선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이러한 배경에서 본 연구에서는 비교적 방사선에 내성을 보이는 A549 폐암세포주를 이용하여 방사선 조사에 따르는 nf-kB 활성화를 확인하고 이러한 NF-kB 활성화를 차단하였을 때 방사선 감수성의 변화를 관찰하고 NF-kB에 의해 유도되는 주요 항아포프토시스 유전자인 cIAP의 발현 변화와 cIAP2 전사활성을 조사하고자 하였다. 본 연구에서 방사선-유도성 세포독성이 있어서 비교적 내성을 보이는 것으로 확인된 A549 세포주에서 방사선 조사에 의해 NE, kB가 활성화됨은 일관성 있게 확인되 었다.
- NF-kB의 항아포프토시스 기전은 NF-kB 의존성 단백질인 cIAPl, 2의 전사 발현 유도에 의한 것으로 cIAPl, 2는 caspase 3, 7, pro-caspase-9의 활성을 차단함으로써 아포프토시스를 억제하는 것으로 알려져 있다. 이에 저자들은 방사선 유도성 세포사멸에 비교적 내성을 보이는 A549 세포주에서 방사선에 의한 NF-kB 활성화와 그에 따른 cIAP 발현유도를 조사하고 NF-kB 활성화를 차단하여 방사선 유도성 세포사멸의 감작효과를 확인하기 위하여 본 연구를 시행하였다. 방 법 :
- 보고된 바가 없다. 이에 저자들은 방사선에 비교적 내성을 보이는 A549 폐암세포주에서 발생하는 방사선-유도성 세포사에서 PF-kB의 역할과 cIAP2 발현을 조사하기 위하여 본 연구를 시행하였다
제안 방법
- 3) buffer에서 4% nondenaturing polyacrylamide gel 을 전기영동 하여 단백질-DNA 복합체를 분리 하여 autoradio- graphy로 결과를 얻었다. 사용된 oligonucleotide probe는 IgG kappa chain 유전자의 5 flanking 부위의 NF-kB site(5' tcgaGTCGGGGACTTTCCT CTGA)를 사용하였고 이에 대한 상보적 strand를 5' 쪽에 네 개의 염기 overhang을 갖도록 고안하여 annealing 한 후 [a-32P] dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) 외" non-radioactive dA/T/ GTPs, 그리고 Klenow DNA polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 제조하였다. Cold competition-^- 250 pg (100x)의 cold oligonucleotide probe를 radio-labeled probe와 반응시키기 5분전에 먼저 반응시켰다.
- 2 mM EDTA plus protease inhibitors)를 첨가하여 핵막을 파괴시키고 4℃에서 30분간 stirring 하였다. 4℃에서 15분간 14, 000 rpm으로 원심분리하여 chromatin을 pellet시켜 핵추출(nuclear extraction) 성분을 얻은 후 4℃ 에서 Buffer D(20 mM HEPES (pH 7.9), 20% glycerol, 100 mM KC1, 0.2 mM EDTA with 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and 1 mM dithiorethreitol(DTT))로 6시간 투석하여 핵단백을 획득한 후 Bradford assay 로 단백 농도를 측정하였다.
- Bradford assay로 단백농도를 측정하고 3분간 가열하여 denaturation 시킨 후 SDS-PAGE로 전기영동하이 nitrocellulose에 tran- sfer한다. Blot을 blocking buffer(4% milk, 1% BSA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) 에서 1시간 incubation 한 후 일차 항체를 4% milk, 1% BSA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20 등을 포함한 4% milk 용액에 l:1000 희석하여 1시간 동안 실온에서 incubation 하고 10분씩 3회 세척한 후 horseradish peroxidase conjugated 이차항체를 1:5000 희석된 blocking buffer로 2차항체 반응을 1시간 거친 후 역시 3회 세척한 후 ECL(Amersham, Arlington Heights, IL) 검출하였다.
- 6, 1% Triton-X, 1 mM DTT and 2 mM EDTA) 를 직접 첨가하여 cell lysate를 harvest한 후 섭씨 4도에서 10분간 14, 000 rpm으로 원심분리하여 세포 단백을 얻었다. Bradford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 단백 농도를 측정한 후 20 Ug의 단백질을 luciferase assay mix(25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO4, 1 mg/ml bovine serum albumin(BSA), 5 mM ATP and 1 mM D-luciferin (Analytical Luminescence Laboratory, San Diego, CA))에 첨가한 후 Monolight 2010 (Analytical Luminescence Laboratory)을 이용하여 20초간 luminescence를 3회 반복 측정하여 평균값을 얻어 결정하였다.
- DNA thermal cycler(Gene Amp PCR system 9600, Perkin Elmer) 에서 94℃ 1 분(denaturation), 55℃ 1 분(annealing), 그리고 72℃ L&(extension) 으로 25 cycle 반복하였다. PCR 반응 후에 1.5% agrose gell electrophoresis 하고, B-actin을 같은 방법으로 실험하여 보정하였다. 사용한 oligonucleotide 는 주문 제작(Bioneer, 충북 청원)하였으며 염기서열(base sequence)은 아래와 같다.
- NF-kB활성을 차단하기 위하여 proteosome inhibitor인 MG132와 IkB a -superrepressor plasmid를 transfection 한 안정적 세 포주 A549TkB a-superrepressor를 이 용하였다. cIAP의 발현은 RT-PCR을 이용하였고, cIAP2 promoter 활성은 NF-kB site를 포함한 cIAP2 유전자 5' flanking region(1.4kb)을 pGL2-Basic luciferase vector에 cloning 한 construct를 사용하여 transfection 후 luciferase assay를 시 행하였다. 결 과 :
- 방사선 조사에 대해 비교적 저항적인 A549 폐암세 포주에서 방사선-유도성 NI、kB의 활성화가 발생 하는지를 확인하기 위하여 luciferase assay를 이용한 전사활성 측정, Western blot을 이용한 IkBu 분해, 그리고 EMSA를 이용하여 NF-kB의 핵이동 및 DNA 결합을 확인하였다. Luciferase assay에서
- 방사선에 대해 내성을 보이는 A549 폐암 세포주에서 항아포프토시스 전사인자인 NF-kB가 활성화됨을 Fig. 2.에서 확인하였기에 NF-kB 억제에 의해 방사선에 대한 감수성이 증가되는 지를 확인하기 위하여 proteasome 억제제로서 대표적인 NF-kB 억제제로 알려져 있는 MG132(5 UM)를 전 처치한 후 방사선 조사를 시행하였으나 MG132는 A549 세포주의 방사선 감수성에 대해 아무런 영향을 미치지 못하였다(Fig. 3).
- 비선택적 NF-kB 억제제인 MG132로서 방사선 감수성에 대한 효과를 관찰하지 못하였기에 NF-kB 에 특이적이고 선텍적인 억제를 통하여 A549 세포주의 방사선 감수성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 IkB a -superrepressor(lKB a A 인산화되어 분해되는데 중요한 역할을 하는 Ser-32 및 -34에 대한 돌연변이 유도체로서 지속적으로 NF-kB를 포획하고 있어서 그 활성을 억제함)를 안정적으로 유전자 주입한 A549-IkB(z-SR 세포주를 제작하여 A549-neo 세포주와 방사선 감수성을 비교하였으나 이 역시 의미 있는 변화를 보여주지 못하였다(Fig. 4B). Fig.
- 세포주를 100 mm dish에서 80-90%의 confluency 되게 배양한 후 대조군과 방사선 조사 2시간 후 Trypsin/EDTA로 harvest 하였다. 100 μ1 Buffer A(10 mM HEPES(pH 7.
- 유전자 주입 실험은 lipofectamine plus(Gibco- BRL)를 이용하여 protocol instruction에 따라 시행하였다.
- 조심스럽게 RNA가 포함된 상층엑을 얻은 뒤 isopropyl alcohol을 넣고 얼음에서 10분간 반응시키고 4℃ 13, 000 rpm에서 원심분리한 후 상층액을 제거하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 농도를 분광광도계 (OD 260/280에서 흡광도 측정, Beckman, CA)를 이용하여 측정하였다. 2 μ日의 RNA를 oligo(dT)에 첨가하여 65℃에서 5분간 결합반응(annealing) 시킨 후 First strand buffer, 0.
대상 데이터
- A549 폐암세포주를 RPMI 1640(GibcoBRL) 배지에 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 그리고 1% penicilline/streptomycin 등을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 방사선 조사는 Varian 사의 Clinac 1800C 선형가속기를 이용하였으며 조사량은 10 Gy를 사용하였다.
- NF-kB 의존성 전사활싱을 평가하기 위하여는 IgGK chain 유전자의 NF~mB binding site인 IgGK-NF- kB site( sequence 5-GGGGACTTTCC-3) oligon - ucleotide가 minimal IL-8 promoter(position -67 to +44) 의 상류(upstream) 에 위치하도록 구축된 luciferase reporter gene construct를 이용하였으며 , IkB a -superrepressor plasmid construct는 스탠포드 의대 Glenn D. Rosen교수로부터 제공받았다. cIAP2 promoter의 전사 활성도를 평가하기 위하여 NF-kB binding site를 포함하는 cIAP2 유전자 5' flanking region(1.
- 세포독성검사는 MTT Assay를 이용하였고, NF-kB 활성화 검사는 luciferase reporter gene assay, electro - mobility shift assay, IkB- a degradation에 대한 western blot을 이용하였다. NF-kB활성을 차단하기 위하여 proteosome inhibitor인 MG132와 IkB a -superrepressor plasmid를 transfection 한 안정적 세 포주 A549TkB a-superrepressor를 이 용하였다. cIAP의 발현은 RT-PCR을 이용하였고, cIAP2 promoter 활성은 NF-kB site를 포함한 cIAP2 유전자 5' flanking region(1.
- Rosen교수로부터 제공받았다. cIAP2 promoter의 전사 활성도를 평가하기 위하여 NF-kB binding site를 포함하는 cIAP2 유전자 5' flanking region(1.4 kb)을 pGL2-H3 lucife - rase vector에 cloning 한 construct를 사용하였으며 연세대학교 이태호 교수로부터 제공받았다.
- 방사선 조사는 Varian 사의 Clinac 1800C 선형가속기를 이용하였으며 조사량은 10 Gy를 사용하였다.
- 5% agrose gell electrophoresis 하고, B-actin을 같은 방법으로 실험하여 보정하였다. 사용한 oligonucleotide 는 주문 제작(Bioneer, 충북 청원)하였으며 염기서열(base sequence)은 아래와 같다.
- 세포주는 A549 폐암세포주를 이용하였고, 방사선 조사는 Varian사의 Clinac 1800C 선형가속기를 이용하였으며 조사량은 10GY를 사용하였다. 세포독성검사는 MTT Assay를 이용하였고, NF-kB 활성화 검사는 luciferase reporter gene assay, electro - mobility shift assay, IkB- a degradation에 대한 western blot을 이용하였다.
이론/모형
- 빙사선 조사에 대한 Cell viability를 보기 위해 MTT assay를 시행하였다. 간단히 요약하면, 96- well 세포배양접시에 A549 세포 주를 10, 000개씩 분주한 후 정해진 시간 후에 3-(4, 5_dimethyltliia- zol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 5mg/ml 용액 20必를 첨가하고 2시간동안 37℃ 5% COencubator에서 incubation한 후 0.
- 세포독성검사는 MTT Assay를 이용하였고, NF-kB 활성화 검사는 luciferase reporter gene assay, electro - mobility shift assay, IkB- a degradation에 대한 western blot을 이용하였다. NF-kB활성을 차단하기 위하여 proteosome inhibitor인 MG132와 IkB a -superrepressor plasmid를 transfection 한 안정적 세 포주 A549TkB a-superrepressor를 이 용하였다.
성능/효과
- 2B). iKBa 분해 후 발생하는 NI, kB의 핵이동 및 DNA 결합을 확인하기 위하여 시행한 EMSA。】"] 방사선 조사에 의한 lane 2에서 NF-kB band가 유의하게 증가함을 보여주었고 이는 cold competition에 의해 소실되는 것으로 보아 NF-kB band 임을 확인할 수 있었다(Fig. 20.
- 4 % 로 비교적 내성이 있음을 확인하였다. 방사선에 의한 NF-kB의 활성은 IkB-a 분해에 대한 western blot고]" EMSA로 확인하였으며 luciferase assay에서도 약 1.6 배 정도의 NF-kB 활성화가 있었다. NF-kB활성을 차단하기 위해 사용한 MG132는 방사선 유도성 세포사멸에 영향을 주지 않았으며 A549-IkB a -superrepressor 세 포주에서 도 세 포사멸의 감작효과는 없었다.
- A549 cell에서 10Gy 방사선 조사에 의한 세포독성은 24hr, 48hr 에 각각 10.82±.3 %, 17.7 ±6.4 % 로 비교적 내성이 있음을 확인하였다. 방사선에 의한 NF-kB의 활성은 IkB-a 분해에 대한 western blot고]" EMSA로 확인하였으며 luciferase assay에서도 약 1.
- A549 세포주에서 방사선이 NF-kB를 활성화 시키지만 NF-kB 억제로 방사선 감수성에 아무런 영향을 미치지 않는다는 사실을 확인한 후 방사선이 NF-kB 에 의해 유도발현되는 주요 항아포프토시스 유전자인 cIAP 발현에 영향을 미치는 지를 평가하기 위하여 RT-PCR을 시행하였다 양성대조물질로 사용한 TNF-a 에 의해서는 cIAPl 및 cIAP2 모두 유의하게 발현 유도가 관찰되지만 방사선 조사에 의해서는 cIAP 발현에 전혀 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 5).
- A549 폐암세포주에서 방사선에 의해 NF-kB의 활성화는 확인하였으나 활성화 정도가 미약하였고 NF-kB 의존성 항아포프토시스 유전자인 cLAP가방사선에 의해 발현유도 되지 않았으며, NF-kB 활성을 차단함에도 세포독성에 감작효과가 없었으므로 A549 폐암세포주에서 방사선 유도성 세포사멸에 내성을 보이는 기전에는 NF-kB의 역할이 미미하리라고 사료된다.
- A549 폐암세포주의 방사선 조사에 대한 감수성을 확인하기 위하여 배양된 A549 세포주를 96 well plate에 분주한 후 10 Gy 방사선 조사 후 각각 24 시간 및 48시간 후 MTT assay로 세포 생존율을 조사한 결과 24시간 후에는 89.2±2.3 %, 48시간 후에는 82.3±6.4 %의 세포 생존율의 결과를 보여 A549 폐암세포주가 방사선에 대해 비교적 내성을 보이는 세포주임을 확인하였다(Fig. 1).
- NF-kB활성을 차단하기 위해 사용한 MG132는 방사선 유도성 세포사멸에 영향을 주지 않았으며 A549-IkB a -superrepressor 세 포주에서 도 세 포사멸의 감작효과는 없었다. 또한 RT-PCR 결과 방사선에 의한 cIAPl, 2 mRNA 발현유도는 관찰되지 않았고 cIAP2 promoter luciferase assay에서도 cIAP2 전사활성 유도는 없었다.
- 전사활성을 조사하고자 하였다. 본 연구에서 방사선-유도성 세포독성이 있어서 비교적 내성을 보이는 것으로 확인된 A549 세포주에서 방사선 조사에 의해 NE, kB가 활성화됨은 일관성 있게 확인되 었다. Reporter gene assay로 전사활성을 확인하였고, Western blot에 의해 NF-kB 활성화의 주요 단계인 iKBa 의 분해를 분석하였으며 EMSA。〕 의해 NT-kB의 DNA 결합을 증명하였다.
- 이어서 방사선이 cIAP2 promoter 활성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 cIAP2 유전자의 5' flanking 부위 (L4 kb)를 pGL2-basic luciferase reporter construct에 주입한 plasmid를 A549 세포주에 유전자 주입한 후 각각 TNF-a 와 방사선 조사 후 luciferase assay를 시행한 결과 TNF-a에 의해서는 2.4±0.4 배의 활성 증가가 관찰된 반면 방사선에 의해서는 1.2±0.1 배로 그 효과가 미미하였다(Fig. 6). 이상의 결과를 종합해 볼 때 A549 세포주에서 방사선에 의해 NF-kB가 활성화되지만 그 정도는 미미하여 항아포프토시스 유전자인 cIAP를 유도할 정도는 아닌 것으로 생각되며 방사
- 저자들은 이렇게 NF-kB 억제에 의해 방사선-유도성 세포사에 대한 감작 효과가 관찰되지 않는 이유로서 방사선 조사에 의해 NF」kB가 활성화 되 기는 하지만 활성화된 NFFcB가 항아포프토시스작용을 하는데 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) 가족군의 중요하 일원인 dAPl과 cIAP2 유전자의 발현 변화를 관찰하였으나 TNF-a 이] 의해 유도되는 것과는 달리 방사선에 의해서는 cIAP가 유도 발현되지 않았으며 cIAP2의 promoter 활성을 확인한 실험에 의해서도 특별한 변화를 확인할 수 없었다. 이는 TNF-a 신호전달 체계에 있어서 발생하는 NF-K B 의존성 cIAP2 유도발현에 의한 세포사 억제 효과가 18 방사선에 의해서는 발생하지 않음을 의미하며, 방사선에 의해 유도되는 NF-KB 활성화는 그 정도가 경미할 뿐 아니라 cIAP 유도 발현에 이은 세포사 억제 효과에 있어서도 그다지 중요한 역할을 하지 않는다는 사실을 시사하는 바라고 생각된다.
- Reporter gene assay로 전사활성을 확인하였고, Western blot에 의해 NF-kB 활성화의 주요 단계인 iKBa 의 분해를 분석하였으며 EMSA。〕 의해 NT-kB의 DNA 결합을 증명하였다. 하지만 NF-KB 활성도는 전형적인 NF-kB 활싱 자극 물질인 PMA나 의 활성도에 비해 전반적으로 미약한 것으로 나타나 적어도 A549 폐암 세포주에서는 방사선 조사에 의해 유도되는 NF-kB 활성도는 그렇게 강력하지 않은 것으로 평가되며 이는 A549 세포주에서 나타나는 방사선 내성의 원인 인자로서의 NF-kB 역할이 그다지 중요하지 않을 것이라는 추측이 가능하였다. 실제로 NF-kB 억제에 의한 방사선-유도성 세포사의 감작효과를 확인하고자 실행한 실험에서 MG132 전처치 및 IkBa superrepressor 유전자 주입에 의해 방사선-유도성 세포사에는 아무런 영향을 미치지 못하였다.
후속연구
- 이는 TNF-a 신호전달 체계에 있어서 발생하는 NF-K B 의존성 cIAP2 유도발현에 의한 세포사 억제 효과가 18 방사선에 의해서는 발생하지 않음을 의미하며, 방사선에 의해 유도되는 NF-KB 활성화는 그 정도가 경미할 뿐 아니라 cIAP 유도 발현에 이은 세포사 억제 효과에 있어서도 그다지 중요한 역할을 하지 않는다는 사실을 시사하는 바라고 생각된다. 본 연구 결과는 A549 단일 세포주에서만 확인된 사실로서 일반화 하기에는 다른 세포주들을 이용한 실험으로 확장하여 확인할 필요가 있다고 생각되며, 세포사 측면에서 방사선-유도성 NF-kB 활성화는 주요 작용기전이 아니며, 방사선-유도성 NF-kB 활성화가 갖는 분자생물학적 의미를 파악하는데 있어서 추가 실험 및 연구가 이어져야 할 것으로 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.