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문제 정의
- 본 연구자들은 천연물로부터 미백화장품의 첨가제로 이용할 수 있는 물질을 개발하기 위하여 대극과 식물로부터분리한 천연 폴리페놀 물질들에 대한 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 melanin 생성 억제실험을 수행하여 그 결과를 보고한다.
제안 방법
- 사용하여 측정하였으며, 온도는 보정하지 않았다. 선광도는 JASCO의 DIP-1000(digital polarimeter, Ibkyo, Japan)를 사용하였고, 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec HI를 사용하였다. Fraction collectofc- Advantec의 SF-160을 사용하였다.
- jolkinii), 사초과의스! 거울(%g humilis), 마디풀과의 대황(Rheum palmatum), 녹나무과의 계피(Cinnamomum cassia) 둥 5종의 고등식물로부터 분리한 것을 사용하였다. 건조한 시료식물(5kg)을 80% 수성아세톤으로 상온에서 1주일간 3회 반복 추출하였다. 추출물은 감압 하에서 아세톤을 농축 증발시켰다.
- 여액은 재차 농축하여 실온에서 방치하고 생성되는 침전물은 감압 여과하여 제거하고 여액을 Sephadex LH-20 column에 loading하였다. Column은 처음에 물로 충분히 씻은 후에 MeOH-H2O 용액(0, 20, 40 60, 80, 100%)으로 용출시켜 분획하였다. 분획물은 1% FeCI3 ethanol 시액으로 확인하여 양성 반응을 나타내는 분획 에 대하여 MCLgel CHP 20P,Fujigel ODS3, RP-18, Cosmosil, Tbyopearl HW40F 등의 reverse phase column을 사용하여 polyphenol 만을 분리하였다.
- Column은 처음에 물로 충분히 씻은 후에 MeOH-H2O 용액(0, 20, 40 60, 80, 100%)으로 용출시켜 분획하였다. 분획물은 1% FeCI3 ethanol 시액으로 확인하여 양성 반응을 나타내는 분획 에 대하여 MCLgel CHP 20P,Fujigel ODS3, RP-18, Cosmosil, Tbyopearl HW40F 등의 reverse phase column을 사용하여 polyphenol 만을 분리하였다. 분리된 화합물은 NMR, UY IR 등 각종 spectral data의 검토를 통하여 구조를 추정한 후 문헌치와 비교하여 구조를 확정하였다.
- 분획물은 1% FeCI3 ethanol 시액으로 확인하여 양성 반응을 나타내는 분획 에 대하여 MCLgel CHP 20P,Fujigel ODS3, RP-18, Cosmosil, Tbyopearl HW40F 등의 reverse phase column을 사용하여 polyphenol 만을 분리하였다. 분리된 화합물은 NMR, UY IR 등 각종 spectral data의 검토를 통하여 구조를 추정한 후 문헌치와 비교하여 구조를 확정하였다.
- 비색법으로 정량하였다. 즉, B-16 mouse melanoma cell lines을 EMEM(10% fetal FCS) 배지를 사용하여 T-75 culture flask에서 confluence가 될 때까지 배양한 후, culture dish에 cell number가 1 x 106/dish 이상'이 되도록 seeding 한 후 1일간 더 배양하였다. 시험물질을 working concentration의 100배 이상으로 제조하여 0.
- 즉, B-16 mouse melanoma cell lines을 EMEM(10% fetal FCS) 배지를 사용하여 T-75 culture flask에서 confluence가 될 때까지 배양한 후, culture dish에 cell number가 1 x 106/dish 이상'이 되도록 seeding 한 후 1일간 더 배양하였다. 시험물질을 working concentration의 100배 이상으로 제조하여 0.5% DMSO 또는 ethanol 등의 용매에 녹인 후 과 30 ㎍/ml의 농도로 첨가하여 1일간 배양하였다. 배지를 교환한 후 2일간 더 배양한 뒤 생성된 멜라닌의 양을 정량하였다.
- 5 N perchloric acid로 2회 반복 추출하고 cold ethanol/ether(3:l)로 2회 반복 추출한 뒤 ethyl ether로 추출하여 건조시켰다. 건조물에 1 N NaOH 용액 1 ml를 첨가한 후 5분간 끓는 물에서 처리하여 멜라닌을 녹인 다음 405 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 즉정하여 control과 비교하였다.
- 둥대풀등 4종의 식물로부터 분리한 phenolic compounds에 대하여 B-16 mouse에서의 melanin 생성 억제 활성을 10㎍/ml과 30㎍/ml의 농도에서 kqjic acid를 비교물질로하여 검토하였다(Table Ⅰ).
대상 데이터
- - 실험에 사용된 천연 polyphenolfi; 본 연구실에서 다년간에 걸쳐 고등식물로부터 분리한 것을 사용하였으며, 각각의 시료는 각종 spectral data를 문헌에 소개되어 있는 문헌치와 비교하여 구조를 확정하였고 표품은 본 연구실에 보관중이다.
- 선광도는 JASCO의 DIP-1000(digital polarimeter, Ibkyo, Japan)를 사용하였고, 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec HI를 사용하였다. Fraction collectofc- Advantec의 SF-160을 사용하였다. 0 및 13C-NMR spectrum은 Broker ARX 250 (250 MHz) spectrometer를 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였고, chemical shift value는 part per million (ppm) 단위로 나타내었다.
- Fraction collectofc- Advantec의 SF-160을 사용하였다. 0 및 13C-NMR spectrum은 Broker ARX 250 (250 MHz) spectrometer를 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였고, chemical shift value는 part per million (ppm) 단위로 나타내었다. EIMS spectrum은 Micromass mass spectrometer(AUTOSPEC,UK)를 사용하였다.
- 추출 및 분리용 용매는 시약용 1급을 사용하였다. TLC plate는 Kieselg이 60 F254 (Merck) 및 RP-18 (Whatman)을 사용하였다. Column 사immatograph)용 고정상은 Sephadex LH-20 (25 - 100 Sigma), MCLgel CHP-20P(75 - 150 μ, Mitsubishi Chem.
- TLC plate는 Kieselg이 60 F254 (Merck) 및 RP-18 (Whatman)을 사용하였다. Column 사immatograph)용 고정상은 Sephadex LH-20 (25 - 100 Sigma), MCLgel CHP-20P(75 - 150 μ, Mitsubishi Chem. Co.), RP-18(40-63 Merck), Toyopearl HW-40F(Tosho), Cosmosil(Nacalai tesque) 둥을 사용하였다. 발색 시 약은 vanillin sulfuric acid 시액, 10% sulfuric acid 시액, 1% FeCl3/ethanol 용액, anisaldchyde sulfuric acid 시액을 사용하였다.
- ), RP-18(40-63 Merck), Toyopearl HW-40F(Tosho), Cosmosil(Nacalai tesque) 둥을 사용하였다. 발색 시 약은 vanillin sulfuric acid 시액, 10% sulfuric acid 시액, 1% FeCl3/ethanol 용액, anisaldchyde sulfuric acid 시액을 사용하였다. B-16 mouse melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성을 평가하는 실험에 사용된 시약 및 기기는 0.
- 발색 시 약은 vanillin sulfuric acid 시액, 10% sulfuric acid 시액, 1% FeCl3/ethanol 용액, anisaldchyde sulfuric acid 시액을 사용하였다. B-16 mouse melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성을 평가하는 실험에 사용된 시약 및 기기는 0.5 N perchloric acid,cold ethanol/ethyl ether(3:l), 1 N NaOH solution, hemacy tometer, microcentrifuge, UV/VIS spectrophotometer이다.
- 사초과의스! 거울(%g humilis), 마디풀과의 대황(Rheum palmatum), 녹나무과의 계피(Cinnamomum cassia) 둥 5종의 고등식물로부터 분리한 것을 사용하였다. 건조한 시료식물(5kg)을 80% 수성아세톤으로 상온에서 1주일간 3회 반복 추출하였다.
- 실험에 사용된 물질은 polyphenol류로 가수분해형 탄닌 및 관련화합물 17종(1-17), phenylpropanoid류 2종(18,19), stilbene류 3종(20,22)이었다(Fig. 1).
이론/모형
- - 융점은 Fisher-Johns의 Melting Point Apparatus를 사용하여 측정하였으며, 온도는 보정하지 않았다. 선광도는 JASCO의 DIP-1000(digital polarimeter, Ibkyo, Japan)를 사용하였고, 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec HI를 사용하였다.
성능/효과
- p data-page="1">대극과(Euphorbiaceae) 식물은 열대, 아열대에 넓게 분포하고 있고 그 종류는 300속, 7500종에 이르며, 그 중에는 약용식물로서 중요한 것이 많고 또 탄닌의 자원으로서도 중요한 식물군이다.') Euphorbia^- 식물은 아열대를 중심으로 2000종이 분포하고 있고 줄기와 잎에 상처를 내면 흰색의 유액을 내는 것이 특징이다. 옛날부터 하제, 이뇨제, 통경약, 진통약, 해독약, 수렴약 등으로 이용되고 있지만 독성 때문에 사용에 주의를 요하는 것이 많다.
- 가수분해형탄닌 중에서 gallic acid(l) 단독으로는 melanin 생성 억제활성을 나타내지 않았으며, gallotannin(2-10)에서는 sugar moiety가 glucose인 경우 (2-8)가 그렇지 않은 경우(9, 10)에 비하여 비교적 강한 melanin 생성 억제활성을 보였고, 당 부분이 glucose인 경우에서는 anomer 탄소가 free인 3,4,6-tri-O-galloyl-D-glucose(6y} 그렇지 않은 경우보다 강한 활성을 나타내었다. 또한 sugar에 결합한 galloyl group의 수가 증가할수록 강한 활성을 보였다.
- 활성을 나타내었다. 또한 sugar에 결합한 galloyl group의 수가 증가할수록 강한 활성을 보였다. Ellagitannin(ll-17)은 1-desgalloyl eugeniin(15)을 제외하고는 전반적으로 gallotannin에 비하여 낮은 활성을 나타냈다.
- 1. Gallotannin에서는 당 부분이 glucose이고 anomer centei가 free인 경우에 비교적 강한 melanin 생성 억제활성을 보였으며 galloyl groups 숫자도 활성에 영향을 주었다.
- 2. Ellagitannin^r 읺ucose의 2, 4위치에 bulky group을 가지고 있는 화합물의 경우에 비교적 강한 억제활성을 나타내었고, glucose가 iC-conformation을 하고 있는 경우가 C1-conformation을 하고 있는 경우보다 강한 활성을 나타내었다.
- 3. Phenylpropanoids는 비교적 강한 melanin 생성 억제활성을 보였으며 methyl 3, 4-dihydroxycinnamate는 10y.g/ml의 농도에서 비교물질인 kojic acid보다 4배의 강한 활성을 나타냈다.
- 4. 실험에 사용된 시료 중에서 1-desgalloyleugeniin이 가장 강한 활성을 나타내었다.
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