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문제 정의
- 본 연구에서는 성분 연구가 미흡한 자귀나무의 뿌리껍질 에 대한 성분연구의 일환으로 에틸아세테이트 분획으로부터 반복적인 컬럼크로마토그라피를 실시하여 이 식물로부 터는 보고되지 않은 4종의 화합물을 새로이 분리하여 구조를 규명하고 세포독성을 측정하였기에 이에 결과를 보고하 고자 한다.
제안 방법
- 시약 및 기기 - 융점은 Gallenkamp melting point apparatus를 사용하여 측정하였으며 온도는 보정하지 않았다. UV spectrophotometere Shimadzu UVeVisible spec- trophotometei를 사용하였고 FT~IRe Nicolet model 205를 사용하였다.
- 10분동안 shaking흐}여 염 색액을 용출시키고 microplate reader를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포들에 대한 시료의 세포독성 효과를 계산하기 위하여, 시료를 가하는 시점에서의 암세포수(Tz: zero time)와 시료 대신 과량의 medium만을 가하여 48시간 배양했을 때의 세포수(C: control) 및 각 농도의 시료를 함께 넣고 48시간 배양했을 때의 세포수(T: test)를 각각 측정하여 다음의 수식에 따라 세포독성을 측정하였다.
- 51에서 3개의 피크들이 관찰되었는데, 이는 화합물 3의 furofuran ring에 의한 피크들과 매우 유사하였다. 이상의 자 료로부터 화합물 4는 3', 5'-dimethoxy-4'-hydroxyphenyl group을 포함하는 대칭구조의 furofuran type lignan 인 (-)- syringaresinol로 추정하였고, 기존 문헌상의 data와 비교하여 이를 확정하였다.24# 이상의 화합물들은 자귀나무 뿌리 껍질로부터 처음으로 분리된 화합물로 인체 암세포주에 대한 세포독성 검색결과 화합물 3이 XF498, HCT-15에 대하여 Ky가 각각 46.
- 자귀나무 뿌리껍질의 EtOAc 가용성 분획에 대한 반복적 인 컬럼크로마토그라피를 실시하여 4종의 화합물을 분리, 정제하여 물리화학적 , 분광학적인 결과들로부터 화합물 1eeuscaphic acid ester glucoside, 화합물 2는 luteolin-7-O- neohesperidoside, 화합물 3은 (+)-medioresinol, 화합물 4는 (-)-syringaresinol으로 결정하였으며 이 식물로부터 처음으 로 분리된 화합물들이다. 이들 화합물에 대해 5종의 인체암세포주(A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498, HCT15)에대한 세포독성 측정 결과 화합물 3이 XF498과 HCT15에 대하여 IC507}- 각각 46.
- 추출 및 분획 -신선한 자귀나무 뿌리껍질을 음건, 세절 하여 얻어진 건조중량 약 1 kg을 5일간 MeOH로 추출하고 (3회) 여과후 여액을 감압농축하여 MeOH 엑스 120 g을 얻 었으며 이를 클로르포름(CHC、), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(”-butanol)로 계통분획하여 EtOAc층 3.5 g과 BuOH 층 8 g을 얻었다.
- 화합물의 분리 -5종의 인체 종양세포에 대해 세포독성을나타낸 EtOAc 분획 3.1 g을 Hexane:EtOAc = 9:1 —1:1 — EtOAc only—EtOAc:MeOH = 8:2TMeOH only의 용매로실리카젤 컬럼크로마토그라피를 실시하여 6개의 소분획 (E1- E6)으로 나눈 뒤 소분획 (E3, 135 mg)에 대하여 Toluene: EtOAc = 49:1을 용출용매로 실리카젤 컬럼크로마토그라피 를 실시하여 2개의 소분획 (E31, E32)으로 나누었다. 이중소분획 (E31, 65 mg)을 MeOH:H2O = 1:1^ 용출용매로 RP-18을 이용한 컬럼크로마토그라피를 실시하여 백색 분말상의 화합물 1(8 mg)을 얻었다.
대상 데이터
- UV spectrophotometere Shimadzu UVeVisible spec- trophotometei를 사용하였고 FT~IRe Nicolet model 205를 사용하였다. 】H-NM仅과 "=NMRe VARIAN Unity Inova 500을 사용하였고 EI-MS, FAB-MS는 JMS-AX505WA, JEOL LCmate를 사용하였다. 분취용 HPLC는 Recycle HPLC로서 JAI InstnimRiit(Japan)를 사용하였고 column chromatography의 packing material로■는 Kieselgel 60 (70- 230 mesh, Art.
- 9385, Merck) 와 Lipophilic Sephadex LH-20 (Bead size 25 - 100 gm, Sigma)을 사용하였다. Thin layer chromatography®- plate는 precoated silica gel 60 F254 plate (layer thickness 0.25 mm, 20 x20 cm, Art. 5715, Merck)와 precoated RP-18 F254S plate (layer thickness 0.25 mm, 20 x 20 cm, Art. 15423, Merck)를 사용하였으며 발색시약으로는 10% H2SO4를 사용하였다. 추출, 분획 및 컬럼 크로마토그라피용 시약 은 EP급 용매를 사용하거나 용매를 재증류하여 사용하였다.
- 시약 및 기기 - 융점은 Gallenkamp melting point apparatus를 사용하여 측정하였으며 온도는 보정하지 않았다. UV spectrophotometere Shimadzu UVeVisible spec- trophotometei를 사용하였고 FT~IRe Nicolet model 205를 사용하였다. 】H-NM仅과 "=NMRe VARIAN Unity Inova 500을 사용하였고 EI-MS, FAB-MS는 JMS-AX505WA, JEOL LCmate를 사용하였다.
- 】H-NM仅과 "=NMRe VARIAN Unity Inova 500을 사용하였고 EI-MS, FAB-MS는 JMS-AX505WA, JEOL LCmate를 사용하였다. 분취용 HPLC는 Recycle HPLC로서 JAI InstnimRiit(Japan)를 사용하였고 column chromatography의 packing material로■는 Kieselgel 60 (70- 230 mesh, Art. 7734, 230 - 400 mesh, Art. 9385, Merck) 와 Lipophilic Sephadex LH-20 (Bead size 25 - 100 gm, Sigma)을 사용하였다. Thin layer chromatography®- plate는 precoated silica gel 60 F254 plate (layer thickness 0.
- 세포독성검색 - 1989년 미국의 National Cancer Institue (NCI)에서 개발한 Sulforhodamin B(SRB) Bioassay 방법을따랐으며 활성검색에 사용한 인체종양 세포주는 A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498, HCT15이다.
- 실험재료 - 본 실험에 사용한 자귀나무는 1999년 5월 전 라남도 무안에서 자생하는 것을 채취하였으며 정확한 감정 을 거친 후에 음건하여 세절한 후 실험에 사용하였다.
성능/효과
- chamber] 하루간 방치하여 가수분해시킨 후 표준당과C* o-TLC 행하여 CHCeMeOH::%。= 9:3:1로 전개시킨후 aniline phthalate 시약으로 발색시켰으며 그 결과 조성당 은 glucose, rhamnose로 확인되었다.
- 0 Hz)의 anomeric 피크로 화합물 2는 luteolin의 OH기에 glucose, rhamnose가 결합된 flavonoid glycoside계열의 화합물임을 알 수 있었다. 문헌에 나타난 luteolin의 13C-NMR spectrum과 비교해 볼 때 화합물 2의 경우 C-7에서 2.3 ppm upfield shifl가, C- 6에서는 변화가 없고 C-8에서는 0.1 ppm downfield shift가 관찰되므로 luteolin의 C-7위치의 OH기에 당이 결합함을 추 정할 수 있었고, luteolin-7-O-glucoside의 data와 비교해 본 결과 다른 data는 모두 일치하나, glucose의 C-2에서 3.4 ppm downfield shift가, 이과 C-3 에서 각각 2.7 ppm, 0.4 ppm씩 upfield shift가 일어나고, rhamnose의 이의 signal 이 8 100.3 ppm의 downfield에서 관찰되는 것으로 미루어 luteolin의 C-7에 glucose가 먼저 결합하고 glucose의 C-2 위치에 rhamnose가 결합한 것으로 추정되었고, 화합물 2는 문헌에 기재된 spectral data와의 비교로 luteolin 7-0- neohesperidosideS. 확인하였다.
- 74의 단일 pea#로 화합물 2는 flavone을 기본골격으로 하고 있는 것으로 추정되었다. 산가수분해 시험및 ‘H-NMR 스펙트럼에서 5 5.18 (s, J=1.9 Hz), 8 5.22 (d, J=7.0 Hz)의 anomeric 피크로 화합물 2는 luteolin의 OH기에 glucose, rhamnose가 결합된 flavonoid glycoside계열의 화합물임을 알 수 있었다. 문헌에 나타난 luteolin의 13C-NMR spectrum과 비교해 볼 때 화합물 2의 경우 C-7에서 2.
- 자귀나무 뿌리껍질의 EtOAc 가용성 분획에 대한 반복적 인 컬럼크로마토그라피를 실시하여 4종의 화합물을 분리, 정제하여 물리화학적 , 분광학적인 결과들로부터 화합물 1eeuscaphic acid ester glucoside, 화합물 2는 luteolin-7-O- neohesperidoside, 화합물 3은 (+)-medioresinol, 화합물 4는 (-)-syringaresinol으로 결정하였으며 이 식물로부터 처음으 로 분리된 화합물들이다. 이들 화합물에 대해 5종의 인체암세포주(A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498, HCT15)에대한 세포독성 측정 결과 화합물 3이 XF498과 HCT15에 대하여 IC507}- 각각 46.28, 63.18 #1로 나타났고 나머지 화합물 1-3은 IC50가 100 μg/ml 이상으로 나타나 세포독성 이 없는 것으로 사료된다.
- 화합물 2는 FeCl3 test에서 양성반응을 보여 flavonoid계 화합물임을 예상하였고, 1H-NMR specthU게서 5 6.38, 6.75에 flavonoid A ring의 H-6, H-8에 기인하는 2개의 doublet (7=2.1 Hz)이 나타났고, 5 6.93, 7.42, 7.43에 나타난 3, 4- disubstituted flavonoid B ring의 특징적인 피크들과 8 6.74의 단일 pea#로 화합물 2는 flavone을 기본골격으로 하고 있는 것으로 추정되었다. 산가수분해 시험및 ‘H-NMR 스펙트럼에서 5 5.
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