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문제 정의
- 따라서 본 연구는 St. John's Wort 뿌리 추출물의 암세포의 생육억제활성과 면역세포의 생장과 면역세포가 생성하는 cytokine에 대한 영향을 측정하여 St. John's Wort의 기존의 허브로서 뿐만 아니라 기능성 식품소재로서의 활용 가능성을 높이고자 한다.
제안 방법
- 실험에 사용한 세포의 초기 농도는 4X102 * 4 cells/㎖ 의 농도로 조절하여 96 well tissue culture microplate에 100 ㎕/well 씩 접종하여 사용하였다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 최종농도가 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 mg/㎖가 되도록 조정 하여 100 ㎕씩 시료를 투여 한 후 48시간 배양하였다. 배양 후 상등액을 제거하고 차가운 trichloroacetic acid (TCA) 100 ㎕를 가하여 4 ℃ 에서 1시간동안 놓아둔 뒤 증류수로 4~5회 세척하여 TCA를 제거하였다.
- 배양 후 cell을 hemacytometer로 세포수를 측정하였다. 그리고 이것은 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포의 생육과 세포수에 따라 면역 활성을 측정하였다. 또한 보다 명확한 면역 활성 효과를 검증하기 위하여 면역세포들이 배지 내에 분비하는 cytokine인 Tumor Nerosis Factor— 와 Interleukin-6의 양을 ELISA kit (Genzyme, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 그리고 이것은 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포의 생육과 세포수에 따라 면역 활성을 측정하였다. 또한 보다 명확한 면역 활성 효과를 검증하기 위하여 면역세포들이 배지 내에 분비하는 cytokine인 Tumor Nerosis Factor— 와 Interleukin-6의 양을 ELISA kit (Genzyme, USA)를 이용하여 측정하였다. 배양액을 원심분리한 상측액에 ELISA kit (Tumor necrosis factor-(1,000 pg/㎖, 250 pg/㎖, 62.
- 면역 기능 증강 효과는 인간 면역 세포인 T cell (Jurkat) 과 B cell (Raji) 을 이용하여 검증하였다. 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역 기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 2.
- 0 mg/M의 농도로 첨가한 후 4일간 다시 배양하였다. 배양 후 cell을 hemacytometer로 세포수를 측정하였다. 그리고 이것은 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포의 생육과 세포수에 따라 면역 활성을 측정하였다.
- 또한 보다 명확한 면역 활성 효과를 검증하기 위하여 면역세포들이 배지 내에 분비하는 cytokine인 Tumor Nerosis Factor— 와 Interleukin-6의 양을 ELISA kit (Genzyme, USA)를 이용하여 측정하였다. 배양액을 원심분리한 상측액에 ELISA kit (Tumor necrosis factor-(1,000 pg/㎖, 250 pg/㎖, 62.5 pg/㎖, 15.6 pg/㎖, 0.0 pg/㎖), Interleukine-6 (5, 00 pg/㎖, 125 pg/㎖, 31.25 pg/㎖, 7.81 pg/㎖, 0.0 pg/㎖) 시약을 가하여 37℃에서 30분간 배양 후 ELISA reader를 이용하여 450 ran에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질을 이용해 표준곡선을 작성하고 이에 시료에서 얻어진 O.
- 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역 기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 2.0x10, cells/㎖의 농도로 조절한 후 900 ㎕/well씩 접종하고 24시간 배양한 후, 0.2 ㎛의 filter로 여과되어진 시료들은 각각의 well에 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 mg/M의 농도로 첨가한 후 4일간 다시 배양하였다. 배양 후 cell을 hemacytometer로 세포수를 측정하였다.
- )는 미국의 오하이오 서부지역에서 재배된 것의 뿌리를 구입하여 사용하였다. 수직의 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에 시료 중량 100 g에 대하여 각각 10배의 증류수와 ethanol을 사용하여 12시간 동안 2회 반복 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조 한 후 각각의 수율을 계산하여 각각의 실험에 사용하였다.
- 수직의 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에 시료 중량 100 g에 대하여 각각 10배의 증류수와 ethanol을 사용하여 12시간 동안 2회 반복 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조 한 후 각각의 수율을 계산하여 각각의 실험에 사용하였다.
- 0 pg/㎖) 시약을 가하여 37℃에서 30분간 배양 후 ELISA reader를 이용하여 450 ran에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질을 이용해 표준곡선을 작성하고 이에 시료에서 얻어진 O.D값을 비교하여 cytokine 의 양을 측정하였다 (Han et al., 1998).
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 St. John s Wort (Hypericum perforatum L.)는 미국의 오하이오 서부지역에서 재배된 것의 뿌리를 구입하여 사용하였다. 수직의 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에 시료 중량 100 g에 대하여 각각 10배의 증류수와 ethanol을 사용하여 12시간 동안 2회 반복 추출하였다.
- 세포배양에 사용된 기본배지는 AGS와 HEL299에는 RPMI1640(GIBCO, USA)을 Hep3B와 MCF—7에는 DMEM (GIBCO, USA) 을 사용하였으며, 모두 FBS를 10%로 첨가하여 배양하였다. 암 세포의 생육저해와 정상 세포의 세포독성은 sulforhodamine B (SRB) 방법을 이용하였다( Doyle et al.
- 실험에 사용된 암세포주는 인간 유래의 간암 세포주인 Hep3B (hepatocellular carcinoma, human, ATCC HB-8064), 위암 세포주인 AGS (stomach adenocarcinoma, human, ATCC CRL-1739), 유방암 세포주인 MCF-7 (breast adenocarcinoma, human, ATCC HTB-22) 정상 세포로는 인간 정상 폐세포주인 HEL299 (embryo lung cell, human, ATCC CCL-137) 을 이용하였다. 세포배양에 사용된 기본배지는 AGS와 HEL299에는 RPMI1640(GIBCO, USA)을 Hep3B와 MCF—7에는 DMEM (GIBCO, USA) 을 사용하였으며, 모두 FBS를 10%로 첨가하여 배양하였다.
데이터처리
- , 1996). 각 실험 결과들은 실험군에서 최대치와 최소치를 제외한 자료들의 평균을 계산하였으며, 각 평균치간의 차이는 Student t-test에 의해 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 세포배양에 사용된 기본배지는 AGS와 HEL299에는 RPMI1640(GIBCO, USA)을 Hep3B와 MCF—7에는 DMEM (GIBCO, USA) 을 사용하였으며, 모두 FBS를 10%로 첨가하여 배양하였다. 암 세포의 생육저해와 정상 세포의 세포독성은 sulforhodamine B (SRB) 방법을 이용하였다( Doyle et al., 1993; Dool et al. 1981). 실험에 사용한 세포의 초기 농도는 4X102 * 4 cells/㎖ 의 농도로 조절하여 96 well tissue culture microplate에 100 ㎕/well 씩 접종하여 사용하였다.
성능/효과
- 2. 3, 4에 나타낸 바와 같이 농도의존적인 억제활성을 보였으며, 0.5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서는 매우 높은 억제율을 나타내었다. 고추나물의 증류수 및 에탄올 추출물 모두 0.
- 0 ㎎/㎖의 높은 농도에서도 정상 세포 생존율을 80% 이상으로 유지시켜 정상 세포의 안전성이 유지되었다. St. John s wort 추출물은 0.5 ㎎/㎖의 농도에서 간암세포주인 Hep3B에 대하여 80% 이상의 높은 억제율을 나타내었으며, 위암세포주인 AGS에 대하여서는 75% 이상의 높은 생육억제율을 나타내었고, 유방암 세포주인 MCF-7에 대하여서는 증류수 추출물들은 0.5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 약 80%정도, 에탄올 추출물들은 90% 이상의 매우 높은 암세포 생육억제활성을 나타내었다. 또한 각 추출물의 정상세포독성에 대한 암세포의 억제율을 나타내는 selectivity에 있어서 각 추출물이 4 이상의 수치를 나타내어, 암세포를 선택적으로 사멸하는 기작을 지닌 것을 확인하였다.
- 5, 6, 7에 나타내었다. St. John's Wort 뿌리의 증류수 추출물과 에탄올 추출물의 면역 세포 생육 증진 기능은 Fig. 5에 나타난 바와 같이 농도가 증가할수록 면역세포들의 생장율이 농도 의존적으로 증가하였으며, 0.5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 T세포의 생장을 2배 이상 증가시켰으며, B-cell의 경우 1.2~ 1.5배 이상의 생장율의 증가를 나타내었다. 또한 물 추출물들이 에탄올 추출물에 비하여 높은 면역세포의 생육 증진활성을 나타냄을 확인하였다.
- St. John's Wort의 정상세포에 대한 세포독성을 측정한 결과 두 종류의 추출물 모두 1.0 ㎎/㎖의 높은 농도에서도 정상 세포 생존율을 80% 이상으로 유지시켜 정상 세포의 안전성이 유지되었다. St.
- 또한 각 추출물의 정상세포독성에 대한 암세포의 억제율을 나타내는 selectivity에 있어서 각 추출물이 4 이상의 수치를 나타내어, 암세포를 선택적으로 사멸하는 기작을 지닌 것을 확인하였다. 고추나물의 뿌리 물 추출물들은 인간 B와 T 세포주의 생육을 0.5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 T세포의 생장을 2배 이상, B-cell의 경우 1.2~1.5배 이상의 생육 증가를 나타내었으며, 물 추출물들이 에탄올 추줄물에 비하여 높은 면역세포의 생육 증진활성을 나타내었다. 배양기간에 따른 면역세포의 생육과 면역물질인 cytokine의 생산을 보면 배양 5일째 두 종류 추출물에서 가장 높은 생존율을 나타내었으며 추출물을 첨가하지 않은 경우에 비교하여 약 1.
- 5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서는 매우 높은 억제율을 나타내었다. 고추나물의 증류수 및 에탄올 추출물 모두 0.5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 간암세포주인 Hep3B에 대하여 80% 이상의 높은 억제율을 나타내었으며, 증류수 추출물의 경우 0.1 ㎎/㎖의 농도에서도 60%의 높은 억제율을 나타내었다. 위암세포주인 AGS 에 대하여서도 에탄올 추출물에서 0.
- 에 나타내었다. 두 종류의 추출물 모두 1.0 ㎎/㎖의 농도에서도 정상세포 생존율을 80% 이상으로 유지시켜 정상세포에 대한 세포독성은 매우 낮았다. 이는 0.
- 5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 약 80% 정도, 에탄올 추출물들은 90% 이상의 높은 암세포 생육억제활성을 나타내었다. 또한 각 주줄물의 정상세포독성에 대한 암세포의 억 제율을 나타내는 selectivity에 있어서 각 추출물이 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 4이상의 수치를 나타내어 고추나물 추출물이 암세포를 선택적으로 사멸하는 기작을 지닌 것을 확인하였다.
- 5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 약 80%정도, 에탄올 추출물들은 90% 이상의 매우 높은 암세포 생육억제활성을 나타내었다. 또한 각 추출물의 정상세포독성에 대한 암세포의 억제율을 나타내는 selectivity에 있어서 각 추출물이 4 이상의 수치를 나타내어, 암세포를 선택적으로 사멸하는 기작을 지닌 것을 확인하였다. 고추나물의 뿌리 물 추출물들은 인간 B와 T 세포주의 생육을 0.
- 5배 이상의 생장율의 증가를 나타내었다. 또한 물 추출물들이 에탄올 추출물에 비하여 높은 면역세포의 생육 증진활성을 나타냄을 확인하였다. 이는 암세포의 생육억제활성에 있어서 에탄올 추출물들이 높은 활성을 나타내는 것에 반대되는 것으로 St.
- 5배 이상의 생육 증가를 나타내었으며, 물 추출물들이 에탄올 추줄물에 비하여 높은 면역세포의 생육 증진활성을 나타내었다. 배양기간에 따른 면역세포의 생육과 면역물질인 cytokine의 생산을 보면 배양 5일째 두 종류 추출물에서 가장 높은 생존율을 나타내었으며 추출물을 첨가하지 않은 경우에 비교하여 약 1.5배의 생장율을 나타내었고, B 세포에서 IL-6은 에탄올 추출물이 배양 6일째 0.5 ㎎/㎖ 의 농도에서 최고 6.9 pg/cell의 분비량을 나타내었고, T 세포의 TNF-α도 에탄올 추출물이 배양 6일째 최고 6.8 pg/cell의 분비량을 나타내었다.
- 1 ㎎/㎖의 농도에서도 60%의 높은 억제율을 나타내었다. 위암세포주인 AGS 에 대하여서도 에탄올 추출물에서 0.1 mg/M의 농도 이상에서 60% 이상의 생육 억제 활성을 나타내었으며, 0.5 ㎎/㎖의 농도에서 두 종류의 추출물 모두 75% 이상의 높은 생육억제율을 나타내었다. 유방암세포주인 MCF-7에 대하여서는 에탄올 추출물들은 0.
- 5 ㎎/㎖의 농도에서 두 종류의 추출물 모두 75% 이상의 높은 생육억제율을 나타내었다. 유방암세포주인 MCF-7에 대하여서는 에탄올 추출물들은 0.05 ㎎/㎖ 이상의 농도에서도 약 65% 이상의 높은 암세포 생육억제활성을 나타내었으며, 증류수 추출물들은 0.5 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 약 80% 정도, 에탄올 추출물들은 90% 이상의 높은 암세포 생육억제활성을 나타내었다. 또한 각 주줄물의 정상세포독성에 대한 암세포의 억 제율을 나타내는 selectivity에 있어서 각 추출물이 1.
후속연구
- John's Wort 뿌리 추출물의 면역 활성 기능이 있는 유용성분 물질이 80℃ 이상의 높은 온도에서 잘 녹아 나오는 수용성 물질로 사료되어 진다. 또한 증류수 추출물의 경우 에탄올 추출물에 비하여 약 2.7배 이상의 높은 수율을 나타내어 이를 잘 활용할 경우 용매의 수율 및 가격 측면에서 좀더 효율적인 고추나물의 이용이 가능하리라고 예상된다. Fig.
- 5 pg/cell의 분비량을 나타내었다. 이러한 면역증진활성의 확인은 이들의 기능성 식품 소재로서의 이용할 수 있는 기초 자료가 되어, 고추나물의 부가가치를 좀더 높이고, 이에 따라 이들의 수요증대에도 기여할 것으로 사료되어진다.
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