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문제 정의
- Topical dosage form으로써 아크릴계 고분자와 다가 금속 염을 사용하여 압력 감응형 점착성 하이드로겔 기제를 제조하였고, 피부 병변의 일종인 주름 억제에 유용한 약물을 matrix 형으로 설계하여 약제학적 응용 가능성을 연구하였다. 주름 생성의 원인인 피부의 건조와 collagen의 분해를 방지할 목적으로 보습력 증진 및 collagenase 활성 억제 실험을 하였으며, 무모 쥐를 이용한 동물실험과 human test를 통하여 그의 약제학적 효능을 검증한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서의 가교제는 물에서 쉽게 해리되지 않는 난용성 다가 금속 염인 dihydroxy aluminum aminoacetate를 산촉매에 의해 서서히 aF+을 해리시켜 아크릴계 고분자와 가교 반응을 시키는 방법으로 연구하였으며, 전연 시 겔의 점도, 표면의 균일성 및 이수현상 등이 나타나지 않는 것으로 보아, 본 처방 시스템은 압력 감응형 점착성 하이드로겔 패치의 제조에 우수한 가교 반응 시스템으로 사료된다.
- 본 연구자들은 하이드로겔 패치 자체의 보습력을 증진시키고, collagenase의 활성 억제제로써 유백피 추출물을 함유하는 압력 감응형 하이드로겔 패치를 제조하여, 이에 대한 보습력 측정, in vivo 동물시험 및 human test를 통하여 피부 노화의 가장 두드러진 현상인 주름의 여러 형성 기전 중에서 피부의 건조 방지와 collagen 분해를 억제시킴으로서, 얼굴의 주름을 완화시키는 국소용 제제로서의 약제학적 응용가능성을 검토하였다.
제안 방법
- 11명의 건강한 성인 여성을 대상으로 팔의 상박 내측에 하이드로겔 패치를 10x10mm 크기로 절단하여, 직경 12 mm의 fin chamber와 hill top chamber의 tape을 이용하여 붙이고, 3시간 후에 패치를 제거하여, 20분 후에 각질층의 수분함량을 Skin hygrometer (Skicon-200, IBS Co., Japan) 로 측정하였으며, 패치를 제거한 2시간 이후에 보습효과를 재측정하였다. 초기값을 100으로 놓고, 패치 제거 후의 측정 값을 상대값으로 환산하여 유백피 추출물을 함유한 패치와 /-test를 하여 p<0.
- 05%의 FITC-CoUagen 200 μl를 각각 첨가하였다. 1개의 Eppendorf tube는 blank로 사용하고, 3개의 Eppen- dorf tube에는 효소의 표준 활성도 곡선을 작성하기 위하여, 표준 효소 용액인 Collagenase Type I (Karl Biochem.)을 각각 10 ppm, 100 ppm 및 200 ppm이 되도록 첨가하였다. 다른 각각의 Eppendorf tube에는 표준 효소 용액 100와 유백피 추출물을 0.
- 반응 중지 액으로 80mM의 o-phenanthroline (50% ethanol 에 용해)을 10 W 첨가하여 잘 혼합한 후, 37℃ 항온조에서 1시간 동안 유지한 후 냉각시켰다. 70%의 ethanol을 0.5 ml 첨가한 후, Eppendorf tube를 3, 000 rpm에서 10분 동안 원심 분리시키고, 각 tube로부터 500μl의 상등액을 취하여 520 nm (EM)/495 nm (EX)에서 형광강도를 분광형광광도계로 측정하였다.
- Collagenase의 활성 억제 시험은 형광 물질인 fluorosceniso- thiocyanate (FITC)와 conjugated collagen Type I에 colla- genase를 첨가한 후, 생성되는 collagen을 변성시켜 형광강도 (FI)를 측정하는 방법으로 collagenase의 activity는 다음식에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 Table Ⅲ에 나타내었다.
- Fujimura의 방법17)에 따라 6주령의 암컷 무모 쥐 (type SKH) 23마리의 등판에 0.2 pg의 la, 25-dihydroxyvitamin D3를 1일에 1회씩 4주 동안 도포하여, 인위적으로 주름을 유발시키고, 효과의 객관적 평가를 위하여 시험할 부위의 주름 형태를 실리콘 고분자로 주름 주형을 만들었다. 사용된 주형의 재료는 실리콘 고분자인 Provil® (Heraeus Kulzer Inc.
- 압력 감응형 점착성 하이드로겔 패치는 Lee 등의 %)제조방법에 따라 Table I의 처방으로 제조하였다. Methyl paraben, 유백피 추출물 및 PEG-40 hydrogenated castor oil을 경피 흡수촉진제인 Transcutol CG®에 완전히 용해시키고, 서서히 교반하면서 glycerin을 첨가하여 균일상이 될 때까지 혼합한 후, dihydroxy aluminum aminoacetate, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate 및 색소를 분산시켜 phase A를 제조하였다. L(+)-tartaric acid를 정제 이온수에 용해시키고, sorbitol과 polyacrylic acid를 첨가 용해하여 균일상의 phase B를 제조하였다.
- )을 각각 10 ppm, 100 ppm 및 200 ppm이 되도록 첨가하였다. 다른 각각의 Eppendorf tube에는 표준 효소 용액 100와 유백피 추출물을 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.05% 및 0.07% 가 되도록 첨가하고, 또한 대조약인 doxycycline을 유백피 추출물과 동일 함량으로 첨가하였다. 완충용액 (0.
- 01 을 유의한 차이로 분석하였다. 모든 시험은 50% RH, 2S, C의 항온 항습실에서 실행하였다.
- 보습성분으로 잘 알려진 glycerin, dipropylene glycol, propylene glycol, 1, 3-butyleneglycol 및 sorbit이에 대한 수분 보유능을 측정하기 위해, 각각의 시료를 50% 수용액으로 제조하였다. 약 5 g의 시료를 취하여 50℃에서 200분 동안 Halogen moisture analyzer H53 (Mettler-lbledo Co.
- 외견상 전신적 질환이 없는 40~50세의 건강한 여성 10명을 대상으로 8주동안 시험하였다. 시료는 in vivo 동물시험에서 사용한 동일 처방의 주름 치료용 하이드로겔 패치 R] 및 R2를 취침 전 좌우의 눈 밑에 붙이고, 취침 후 아침에 떼어 내도록 하였다.
- 보습성분으로 잘 알려진 glycerin, dipropylene glycol, propylene glycol, 1, 3-butyleneglycol 및 sorbit이에 대한 수분 보유능을 측정하기 위해, 각각의 시료를 50% 수용액으로 제조하였다. 약 5 g의 시료를 취하여 50℃에서 200분 동안 Halogen moisture analyzer H53 (Mettler-lbledo Co. Swiss) 을 사용하여 항량이 될 때까지 수분 함량을 측정하였다.
- 유백피 추출물의 collagenase 활성 억제 효과는 collageno Kit (CLN-100, Japan)를 사용하여 평가하였다. 1.
- 2 kg) 로 2회 왕복하여 판상의 하이드로겔 패치를 제조하였다. 제조된 패치는 일정한 크기로 잘라서, 하이드로겔에 함유되어 있는 수분이 증발되지 않도록 알루미늄 포장지에 넣고, 열 접착기를 사용하여 공기가 통하지 않도록 포장지 입구를 접착하여 Figure 1과 같은 압력 감응형 점착성 하이드로겔 패치를 제조하였다.
- 주름 개선 효과는 자체의 시험방법에 따라 전문가의 육안으로 평가하였으며, 임의의 기준을 Table II와 같이 5 등급으로 분류하여 초기, 2주, 4주, 6주 및 8주 동안 주름의 변화를 관찰하였다.
- Topical dosage form으로써 아크릴계 고분자와 다가 금속 염을 사용하여 압력 감응형 점착성 하이드로겔 기제를 제조하였고, 피부 병변의 일종인 주름 억제에 유용한 약물을 matrix 형으로 설계하여 약제학적 응용 가능성을 연구하였다. 주름 생성의 원인인 피부의 건조와 collagen의 분해를 방지할 목적으로 보습력 증진 및 collagenase 활성 억제 실험을 하였으며, 무모 쥐를 이용한 동물실험과 human test를 통하여 그의 약제학적 효능을 검증한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 기포가 생기지 않도록 phase B를 phase A에 서서히 첨가하면서, 약 60rpm의 속도로 혼합하여 균일상의 겔을 제조한다. 한쪽 면이 실리콘으로 이형 처리된 폴리프로필렌 필름의 위에 자체 제작한 doctor blade 를 사용하여, 제조한 겔을 1 mm 두께로 전연한 후, 평량이 100g/m2인 폴리에스테르 부직포로 편평하게 덮어 씌우고, 부직포의 표면을 roUer (직경 10 cm, 길이 25 cm, 무게 3.2 kg) 로 2회 왕복하여 판상의 하이드로겔 패치를 제조하였다. 제조된 패치는 일정한 크기로 잘라서, 하이드로겔에 함유되어 있는 수분이 증발되지 않도록 알루미늄 포장지에 넣고, 열 접착기를 사용하여 공기가 통하지 않도록 포장지 입구를 접착하여 Figure 1과 같은 압력 감응형 점착성 하이드로겔 패치를 제조하였다.
대상 데이터
- (Japan)에서 구입하였다. Collagenase의 활성 억제제인 유백피 추출물은 에탄올로 추출하여 사용하였고, 경피흡수촉진제로서 Transcutol CG® (diethylene glycol monoethyl ether)는 Gattefosse Co. (France)로부터 구입하였다. Glycerin 및 sorbitole LG생활건강 (Korea), sodium carboxymethylcellulose는 고제화학(Korea)에서 구입하였다.
- (France)로부터 구입하였다. Glycerin 및 sorbitole LG생활건강 (Korea), sodium carboxymethylcellulose는 고제화학(Korea)에서 구입하였다. 또한, 기타 모든 시약들은 특급 및 1급 시약을 사용하였다.
- Polyacrylic acid는 Nihon Junyaku Co. (Japan)에서 제공 받았고, sodium polyacrylate 및 dihydroxy aluminum amino- acetate는 Showa Denko Chemical Co. (Japan)에서 구입하였다. Collagenase의 활성 억제제인 유백피 추출물은 에탄올로 추출하여 사용하였고, 경피흡수촉진제로서 Transcutol CG® (diethylene glycol monoethyl ether)는 Gattefosse Co.
- 대구시 약령 거리에서 구입한 유백피(지리산 기슭에서 채집)를 10-200 meshS 분쇄하여 100% ethanol과 1:5 (w/v)로 혼합하고 상온에서 72시간 동안 냉침을 한 후, 여과지 (Whatman paper No. 2)로 여과하였다. 여과액을 감압 농축 기로 451에서 농축하여 유백피 추출물을 얻었다.
- 2 pg의 la, 25-dihydroxyvitamin D3를 1일에 1회씩 4주 동안 도포하여, 인위적으로 주름을 유발시키고, 효과의 객관적 평가를 위하여 시험할 부위의 주름 형태를 실리콘 고분자로 주름 주형을 만들었다. 사용된 주형의 재료는 실리콘 고분자인 Provil® (Heraeus Kulzer Inc., South Bend, IN)로 Provil®의 기제 및 경화제를 1:1 부피 비로 혼합하여 사용하였고, 약 10분 후 주형을 피부에서 제거하였다. 주름이 생성된 무모 쥐를 2그룹으로 분류하여, 주름 완화용 하이드로겔 패치 % 및 Rz를 하루에 6시간 씩 무모 쥐 등판의 주름 위에 붙여 4주 후에 주름의 변화를 영상 분석법을 이용하여 Corcuff 등의 방법18)에 따라 측정하였으며, 획득한 영상 중에서 가장 큰 주름을 선택하여 Image-Pro Software인 Ultimage (USA)로 주름의 면적을 분석하였다.
- 약물의 in vivo 주름 완화 시험에 사용한 동물은 6~10주령의 건강한 암컷 무모 쥐(SKH)로써, (주)LG생활건강 기술 연구원에서 구입했으며, 사육 조건은 온도 20~25℃, 명암 교대 시간은 12시간(실내 형광등/09:00~21:00으 유지하였고, 실험 중을 제외하고는 고형사료와 물을 충분히 공급하였다.
- 외견상 전신적 질환이 없는 40~50세의 건강한 여성 10명을 대상으로 8주동안 시험하였다. 시료는 in vivo 동물시험에서 사용한 동일 처방의 주름 치료용 하이드로겔 패치 R] 및 R2를 취침 전 좌우의 눈 밑에 붙이고, 취침 후 아침에 떼어 내도록 하였다.
데이터처리
- , Japan) 로 측정하였으며, 패치를 제거한 2시간 이후에 보습효과를 재측정하였다. 초기값을 100으로 놓고, 패치 제거 후의 측정 값을 상대값으로 환산하여 유백피 추출물을 함유한 패치와 /-test를 하여 p<0.01 을 유의한 차이로 분석하였다. 모든 시험은 50% RH, 2S, C의 항온 항습실에서 실행하였다.
- 주름이 생성된 무모 쥐를 2그룹으로 분류하여, 주름 완화용 하이드로겔 패치 % 및 Rz를 하루에 6시간 씩 무모 쥐 등판의 주름 위에 붙여 4주 후에 주름의 변화를 영상 분석법을 이용하여 Corcuff 등의 방법18)에 따라 측정하였으며, 획득한 영상 중에서 가장 큰 주름을 선택하여 Image-Pro Software인 Ultimage (USA)로 주름의 면적을 분석하였다. 통계처리는 Mest를 사용하였고, F<0.01의 유의 수준에서 분석하였다.
이론/모형
- 압력 감응형 점착성 하이드로겔 패치는 Lee 등의 %)제조방법에 따라 Table I의 처방으로 제조하였다. Methyl paraben, 유백피 추출물 및 PEG-40 hydrogenated castor oil을 경피 흡수촉진제인 Transcutol CG®에 완전히 용해시키고, 서서히 교반하면서 glycerin을 첨가하여 균일상이 될 때까지 혼합한 후, dihydroxy aluminum aminoacetate, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate 및 색소를 분산시켜 phase A를 제조하였다.
- , South Bend, IN)로 Provil®의 기제 및 경화제를 1:1 부피 비로 혼합하여 사용하였고, 약 10분 후 주형을 피부에서 제거하였다. 주름이 생성된 무모 쥐를 2그룹으로 분류하여, 주름 완화용 하이드로겔 패치 % 및 Rz를 하루에 6시간 씩 무모 쥐 등판의 주름 위에 붙여 4주 후에 주름의 변화를 영상 분석법을 이용하여 Corcuff 등의 방법18)에 따라 측정하였으며, 획득한 영상 중에서 가장 큰 주름을 선택하여 Image-Pro Software인 Ultimage (USA)로 주름의 면적을 분석하였다. 통계처리는 Mest를 사용하였고, F<0.
성능/효과
- 최근 하이드로겔의 특성을 응용하여 국소이용율이 높은 새로운 topical dosage form으로써, 아크릴계 고분자와 Al3+ 의 가교반응으로 형성된 점착성 하이드로겔에 약물이 matrix 형태로 함유된 여드름 치료용 하이드로겔 패치의 제형화 연구가 보고되었다.16)이러한 압력 감응형 점착성 하이드로겔 패치는 하이드로겔 자체의 3차원 그물망 구조가 국소부위에서 약물의 저장소 역할을 하여 일정한 농도로 약물을 피부에 지속적으로 전달시킬 수 있으며, 다량의 수분을 함유하고 있어 보습력이 우수한 제제이다. 또한, 경피흡수촉진제와 함께 난용성 약물의 가용화가 쉬우며, 적당한 점착력을 가지고 있어 피부에 쉽게 붙일 수 있고, 떼어낼 때 통증이 없으며, 피부에 잔유물이 남지 않는 등의 국소용 제제로서 좋은 특성을 가지고 있다.
- 2. 수분 보유능 측정 결과, 수분 보유능이 가장 우수한 것으로 나타난 sorbitol을 처방하여 하이드로겔 패치의 보습력을 향상시킬 수 있었다.
- 3. In vivo 동물실험에서 유백피 추출물을 함유한 하이드로겔 패치의 주름 감소 효과는 약 31.2%이었다.
- 4. 유백피를 함유한 하이드로겔 패치에 대해 8주 동안 실험한 human test 결과, 약 33%의 피시험자에서 주름 개선 효과를 관찰할 수 있었다.
- 유효성분은 P-sitosterol, phytosterol, stigmasterol, tannin, resin, fat, cathechin 및 cathechin apioside 등으로 구성되어 있으며, collagen의 분해에 의해 몸 안에 있는 조직이 파괴되어 나타나는 위궤양, 치주 질환 및 염증 등에 치료 효과가 있다.7)유백피는 collagen의 합성 촉진과 collagenase의 활성을 억제하는 효과가 우수하고, 사람의 섬유아세포 및 단핵세포 증식에 대한 세포독성이 없으며, 4)유백피의 알코올 추출물은 진통, 소염 및 항균 작용이 매우 우수하다.5)이와 같이 유백피는 약리적 작용이 우수할 뿐만 아니라, 인체에 대한 안전성이 높기 때문에 처방약 및 일반 의약품으로 개발하기 좋은 장점이 있다.
- 따라서, 수분 보유능이 가장 우수한 sorbitol을 주름 완화용 하이드로겔 패치에 처방할 경우 우수한 보습효과를 기대할 수 있을 것으로 나타났다.
- 또한, in vivo test 및 human test에서 나타난 주름 개선 효과는 매우 만족스러운 수준은 아닐지라도, 주름의 다양한 생성 기전 중에서 보습효과와 collagenase 활성 억제 효과에 기인하는 것으로 추정할 수 있었으며, 앞서 연구 보고된 하이드로겔 패치의 약물 피부잔류 및 투과 특성을 고려할 때 본 연구에서 설계한 압력 감응형 점착성 하이드로 겔은 국소용 제제로써 약제학적 응용 가능성이 높은 것으로 평가되었다.
- 또한, 평가 완료 후 피시험자가 느끼는 주름 개선 정도에 대한 설문 결과 품질만족도는 4.1 점/5.0점으로 9명 모두 호전을 보인 것으로 느끼고 있었다.
- 4주 동안 하이드로겔 패치를 무모 쥐의 등판에 첩포한 후의 주름 면적을 Figure 3에 나타내었다. 보습력을 증진시키고, 유백피 추출물이 함유되지 않은 패치(%)로 처리한 경우의 주름의 면적은 2609±22Q으로 약 9.3%가 감소하였으며, 유백피 추출물이 함유된 패치(R2)를 처리한 경우에는 1978±247으로 약 31.2% 감소 하였다. 이상의 실험 결과 보습 효과만으로도 주름 개선 효과를 확인할 수 있었으며, 유백피 추출물의 주름 감소 효과는 더욱 우세하게 나타났다.
- 본 collagenase의 활성 억제 실험에서 대조약으로 선정한 doxycyclinee 골격근에서 collagen을 분해하는 matrix mata- lloprotease (MMP)의 활성억제제로 잘 알려져 있으며,31,32) 유백피 추출물은 대조약보다 저농도에서도 우수한 collagenase 활성 억제 효과가 나타나, 콜라겐의 분해를 방지할 수 있는 약물임을 확인할 수 있었다.
- 그러나, 모든 시험자가 하이드로겔 패치 적용에 따라 주름 감소 효과를 보인 것은 아니다. 본 연구에 참여한 10명 중 9명에 대해서 8주간 시험을 진행하였으며, 약 33%에 해당하는 3명에서 효과를 나타내었고, 1명은 2주까지 실험에 참여 하여 평가 결과에서 제외시켰다.
- 5종의 보습제에 대한 보습효과는 보습제 자체의 수분 보유능으로 평가하였으며, 그 결과는 Figure 2에 나타내었다. 실험 결과 수분 보유능은 sorbitol이 가장 높았으며, glycerin, 1, 3-butylene glycol, dipropylene glycol의 순으로 나타났다. propylene glycole 효과가 거의 없었다.
- 육안에 의한 주름 평가 결과는 Figure 5에 나타내었다. 유백피 주줄물을 함유한 하이드로겔 패치(R2)에 대해서는 사용 전 평균 grade 2.8에서 grade 2.2로 낮아져, 약 22%가 호전되었으며, 유백피 추출물을 함유하지 않은 패치에서는 grade 3.0에서 grade 2.7로 약 10%가 호전되는 것으로 나타났다3<0.05). 따라서, 주름을 완화시키는 여러 기전 중에서 유백피 주출물은 collagenase의 활성을 저해시켜, collagen 의 분해 억제에 기여하는 것으로 추측된다.
- 유백피 추출물과 doxycycline의 농도가 증가함에 따라 coHagenase 활성 억제 효과가 증가하는 것으로 나타났으며, 특히, 유백피 추출물은 0.01%의 저농도에서 대조약인 doxycycline 보다 우수한 collagenase 활성 억제 효과를 나타냈다.
- 이상의 결론을 종합해 보면, 피부 노화의 대표적인 현상인 주름의 다양한 생성 기전 중 collagenase 활성 억제제인 유백피 추출물과 sorbitol을 matrix 형태로 처방화한 압력 감응형 점착성 하이드로겔 패치는 얼굴의 주름을 치료하는 새로운 국소제제로써 약제학적 응용 가능성이 높은 것으로 평 가되었다.
- 2% 감소 하였다. 이상의 실험 결과 보습 효과만으로도 주름 개선 효과를 확인할 수 있었으며, 유백피 추출물의 주름 감소 효과는 더욱 우세하게 나타났다. 주름의 감소 효과는 무모 쥐의 각 개체 마다 약간씩 차이가 있었으나, 가장 객관적으로 분석된 무모 쥐의 주름 감소 사진을 Figure 4에 나타내었다.
- 약물 및 보습제의 선정 시험 결과에 따라 설계한 주름 치료용 하이드로겔 패치의 보습효과는 Table IV에 나타내었다. 전반적으로 하이드로겔 패치는 blank에 비해 뛰어난 보습효과를 나타내었으며, 특히 sorbit이을 함유한 패치인 % 및 R2의 보습효과는 R3 보다 우수하게 나타났다(p<0.01). Sorbitol과 같이 구조적으로 수산기 (-OH)를 많이 가지고 있는 화합물이 피부 표면에 잔류할 경우, 피부 속이나 대기중의 수분과 결합하여 수분 증발을 억제함으로써, 보습 효과를 나타내는 것으로 추정이 된다.
- 주름은 오랜 시간을 통해서 형성되고, 발생 기전 또한 정확히 밝혀지지 않아 본 연구에서 시도한 연구 결과로 모든 피시험자들을 만족시킬 수 없었으나, 하이드로겔의 보습효과와 collagenase의 활성 억제제인 유백피를 약물층으로 하는 하이드로겔 패치로 주름을 치료할 수 있는 가능성을 확인하였다.
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