이온채널의 활성을 포함한 세포의 생리활성을 측정하기 위하여 토마토의 뿌리조직으로부터 원형질체를 분리하였다. 일반적으로 널리 사용되는 원형질체 분리법은 뿌리조직의 경우 효율이 좋지 않았다. 따라서, 다양한 조건을 변화시키며 분리효율을 조사하던 중 두 단계의 삼투압 처리로 원형질체 분리효율이 높아짐을 확인하였다. 첫 단계로 뿌리조직을 300 mM sorbitol을 포함하는 용액에서 30분간 배양한 후, 700 mM sorbitol과 세포벽 분해효소를 포함하는 용액으로 옮겼을 때, 원형질체 형성은 급격히 증가하였다. 이러한 분리방법의 최적 조건을 결정하기 위하여 pH와 삼투압, 배양시간, 세포벽 분해효소의 농도 등을 조사하였다. 원형질체 분리의 수율은 3% cellulase와 1% macerozyme, 0.1% pectolyase를 포함하는 pH 5.0의 혼합효소액에서 2시간 배양할 때 최대로 나타났다. ATPase 활성으로 평가한 원형질체의 세포활성은 뿌리조직의 시료에서 측정한 간과 유사하였다. 또한, 분리한 원형질체의 세포활성은 4시간 동안 감소하지 않아 생리활성 측정을 위한 시료로 적합하였다. 본 결과는 두 단계 삼투압 처리법이 토마토 뿌리조직으로부터 높은 수율의 원형질체 분리에 성공적임을 보인다.
이온채널의 활성을 포함한 세포의 생리활성을 측정하기 위하여 토마토의 뿌리조직으로부터 원형질체를 분리하였다. 일반적으로 널리 사용되는 원형질체 분리법은 뿌리조직의 경우 효율이 좋지 않았다. 따라서, 다양한 조건을 변화시키며 분리효율을 조사하던 중 두 단계의 삼투압 처리로 원형질체 분리효율이 높아짐을 확인하였다. 첫 단계로 뿌리조직을 300 mM sorbitol을 포함하는 용액에서 30분간 배양한 후, 700 mM sorbitol과 세포벽 분해효소를 포함하는 용액으로 옮겼을 때, 원형질체 형성은 급격히 증가하였다. 이러한 분리방법의 최적 조건을 결정하기 위하여 pH와 삼투압, 배양시간, 세포벽 분해효소의 농도 등을 조사하였다. 원형질체 분리의 수율은 3% cellulase와 1% macerozyme, 0.1% pectolyase를 포함하는 pH 5.0의 혼합효소액에서 2시간 배양할 때 최대로 나타났다. ATPase 활성으로 평가한 원형질체의 세포활성은 뿌리조직의 시료에서 측정한 간과 유사하였다. 또한, 분리한 원형질체의 세포활성은 4시간 동안 감소하지 않아 생리활성 측정을 위한 시료로 적합하였다. 본 결과는 두 단계 삼투압 처리법이 토마토 뿌리조직으로부터 높은 수율의 원형질체 분리에 성공적임을 보인다.
In order to measure cellular physiological activity including ion channel activity, protoplasts were isolated from the root tissue of tomato plant. The general methods recommended were not efficient enough to make protoplasts from the root tissue. Among various conditions tested, we found that a two...
In order to measure cellular physiological activity including ion channel activity, protoplasts were isolated from the root tissue of tomato plant. The general methods recommended were not efficient enough to make protoplasts from the root tissue. Among various conditions tested, we found that a two-step treatment of osmosis is very efficient for the isolation of protoplasts. In this procedure, root tissues were preincubated in a solution containing 300 mM sorbitol for 30 min. Then, they moved to the reaction solution containing 700 mM sorbitol as well as cell wall-digesting enzymes. The formation of protoplast was greatly increased by this method. In order to find the optimal condition of the two-step method, various conditions of pH, osmotic pressure, incubation time, and the concentrations of cell wall-digesting enzymes were tested. The yield of protoplast isolation was maximal at pH 5.0 after 2 hr incubation. Mixed enzymes of 3% cellulase, 1 % macerozyme, and 0.1 % pectolyase showed maximal protoplast isolation. The physiological activity of isolated protoplast evaluated by measuring the cellular ATPase activity was as high as that measured from the preparation of root tissue. The protoplasts isolated by this method were remained healthy up to 4 hrs which is enough time to measure the cellular physiological activity. These results show that the two-step treatment of osmotic pressure was successful to obtain high yield of healthy protoplast from tomato root tissue.
In order to measure cellular physiological activity including ion channel activity, protoplasts were isolated from the root tissue of tomato plant. The general methods recommended were not efficient enough to make protoplasts from the root tissue. Among various conditions tested, we found that a two-step treatment of osmosis is very efficient for the isolation of protoplasts. In this procedure, root tissues were preincubated in a solution containing 300 mM sorbitol for 30 min. Then, they moved to the reaction solution containing 700 mM sorbitol as well as cell wall-digesting enzymes. The formation of protoplast was greatly increased by this method. In order to find the optimal condition of the two-step method, various conditions of pH, osmotic pressure, incubation time, and the concentrations of cell wall-digesting enzymes were tested. The yield of protoplast isolation was maximal at pH 5.0 after 2 hr incubation. Mixed enzymes of 3% cellulase, 1 % macerozyme, and 0.1 % pectolyase showed maximal protoplast isolation. The physiological activity of isolated protoplast evaluated by measuring the cellular ATPase activity was as high as that measured from the preparation of root tissue. The protoplasts isolated by this method were remained healthy up to 4 hrs which is enough time to measure the cellular physiological activity. These results show that the two-step treatment of osmotic pressure was successful to obtain high yield of healthy protoplast from tomato root tissue.
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문제 정의
식물세포로부터 세포벽을 제거하여 원형질체를 형성하면, 이 원형질체는 pH, 삼투압, 온도, 광 등의 다양한 외부 환경에 노출되며, 이러한 요인에 의하여 원형질체의 세포활성은 변화할 수 있다. 따라서 시간에 따른 원형질체 시료의 ATPase 활성을 측정함으로써 원형질체의 세포활성 변화를 조사하였다. 원형질체 분리 후, ATPase 의 활성은 4시간까지 감소하지 않았으나, 그 이후에는 점차 감소하여 10시간 후에 처음 활성의 약 70%에 도달하였고 더 이상의 감소는 나타나지 않았다(Fig.
본 연구는 염류집적 토양에서 작물체에 나타나는 생육장애의원인을 구명하고 개선방안을 마련하기위한 장기적 목적으로 수행되고 있다. 생육장애시 이온채널을 통하여 나타나는 이온의 비정상적 이동은 미세전극을 이용한 patch clamp 방법으로 측정할 수 있으며, ” 유리전극의 사용을 위해서는 깨끗한 세포막을 갖는 원형질체의 분리가 선행되야 한다.
본 연구에서는 enzyme-coupled assay를 이용하여 뿌리조직과 원형질체로부터 각각 분리한 ATPase의 활성을 측정함으로써 원형질체의 세포활성을 평가하였다. 이 방법에서 ATPase의 활성감소는 원형질체의 세포활성 감소를 나타내는 척도가 된다.
특히, 뿌리의 조직세포로부터 원형질체의 형성은 타 조직에 비하여 어려운 것으로 알려져 있다. 뿌리조직으로부터 원형질체 분리를 위한 효율적인 방법을 개발하기 위하여 다양한 삼투압 조건에서 원형질체 분리율을 조사하였다. Sorbitol을 사용한 삼투압 조절을 통하여 측정한 원형질체 형성효율은 극히 낮아 IX105 cell・ml-1 이하의 원형질체가 발견되었다.
토마토 뿌리조직으로부터 원형질체를 분리하기 위한 세포벽 분해효소로 cellulase와 macerozyme, pectolyase를 사용하였다. 효율적인 원형질체 분리를 위한 이들세 가지 효소의 적정 농도를 결정하기 위하여 각각의 효소 농도에 따른 원형질체 수를 조사하였다. 세 가지 효소 중 한가지의 효소농도만을 변화시켰으며, 나머지 두 효소의 농도는 일정하게 유지하였다.
제안 방법
; Pink Forcer) 종자를 발아하여 얻었다. 종자는 스펀지를 이용하여 빛을 주지 않은 상태로 25。(2를 유지하며 증류수에서 약 3-5일간 발아시켰고, 발아 후 Cho 등의 방법에 따라 제조한 양액이 담긴 플라스틱 용기에 이식하였다. 이식한 토마토는 온실에서 온도를 28-3TC로 유지하며 약 2주간 재배한 후 뿌리조직을 채취하여 실험에 사용하였다.
이러한 예비실험 과정에서 1차 처리된 조직을 더 높은 농도의 sorbitol용액에 처리하였을 때, 많은 원형질체가 형성됨을 확인하였다. 따라서 두 단계의 삼투압 처리조건을 다양하게 분석하였다.
원형질체의 세포활성은 Niggli 등'2)의 enzyme-coupled assay법을 변형한 Cho 등, 의 방법으로 마이크로 솜 /TPase의 활성을 측정함으로써 평가하였다. 먼저, 생체중량 1g의 잘게 자른 토마토 뿌리조직을 효소처리한 후, 원형질체를 300Xg로 10분간 원심분리하여 분리하고, 뿌리 중량의 1/10배(w/v)인 100 B의 완충용액(250 mM sucrose, 2mM DTT, 0.5 mM PMSF, 0.1% BSA, 25 mM Tris-MES, pH 7.0) 을 첨가하여 glass-Teflon homogenizerJS- 균질화한 용액의 ATPase 활성을 측정하였다. 또한, 비교실험을 위하여 사용된 마이크로 솜은 세 가지 다른 방법으로 얻어졌다.
이렇게 얻어진 조직은 다음 단계에서 각각 300, 500, 700 mM sorbitol을 포함하는 효소용액으로 옮겨져 2시간 동안 진탕 배양하여 원형질체를 분리하였다. 세포벽 분해효소는 cellulase와 macerozyme, pectolyase가 각각 2, 2, 0.1 % 가 되도록 일정하게 조절하였다. 이러한 조건에서 형성된 원형질체의 수는 300 mM sorbitol을 포함하는 완충용액에서 전처리한 후, 500 또는 700 mM sorbitol을 포함하는 효소용액에서 분리하였을 때, 약 5X105 cell ml-1로 가장 높게 나타났다(Fig.
시간에 따른 원형질체 형성의 정도를 조사하기 위하여 0.5- 3시간까지 효소용액에서 원형질체를 분리하며 원형질체의 수를 조사하였다. 뿌리조직의 효소처리 시간이 증가할수록 원형질체의 수는 급격히 증가하였고, 약 2시간 후에는 원형질체의 수가 일정하게 유지되었다(Fig.
토마토 뿌리조직에서 원형질체의 분리. 원형질체 분리를 위하여 사용한 효소용액은 Arabidopsis와 maize의 뿌리조직으로부터 원형질체를 분리하기 위하여 사용한 이전 연구들의 효소 조성을 변형하여 사용하였다(500mM sorbitol, 10mM CaCl2, 0.5% BSA, 5mM DTT, 0.5% PVP, 2% cellulase, 2% macerozyme, 0.1% pectolyase, 5 mM MES, pH 5.5). 효소 용액을 이용한 원형질체 분리과정은 Shin 등3)의 방법을 기초로 하여 이루어졌다.
원형질체의 세포활성 측정. 분리된 원형질체의 세포 활성을 측정하는 방법은 여러 가지가 알려져 있다.
pH 효과. 원형질체의 형성에 미치는 효소완충액의 pH 효과는 pH를 4.0에서 7.0까지 변화시키면서 측정하였다. 먼저, pH 를 조절한 각각의 효소용액에서 토마토 뿌리 조직을 2시간 동안 진탕 배양한 후, 형성된 원형질체를 분리하였다.
세포벽 분해효소들에 의하여 유리된 원형질체를 분리하기 위해 용액을 60|im 나일론 망으로 거른 후, 300Xg로 5분간 원심분리하여 원형질체를 침강시켰다. 이후 상징액은 제거하였고, 유리된 대부분의 원형질체를 포함하는 침전물에 세포벽 분해효소를 포함하지 않는 700 mM sorbitol buffer를 뿌리 중량의 l/2(w/v)배인 50ul 첨가하여 침전을 현탁한 후, haemacytometer를 이용하여 원형질체의 수를 측정하였다.
대상 데이터
세포벽 분해효소인 cellulase(Onozuka R-10)와 macerozyme R-10 은 DUCHEFA 사 (Netherlands) 의 제품을 사용하였고, pectolyase Y23은 Sigma사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. 원형질체 분리과정에 사용한 완충액의 제조와 원형질체의 활성측정을 위한 enzyme-coupled assay에 사용한 pyruvate kinase (PK)와 lactate dehydrogenase(LDH) 등의 시약은 모두 Sigma 사에서 구입하였다.
Louis, USA)에서 구입하였다. 원형질체 분리과정에 사용한 완충액의 제조와 원형질체의 활성측정을 위한 enzyme-coupled assay에 사용한 pyruvate kinase (PK)와 lactate dehydrogenase(LDH) 등의 시약은 모두 Sigma 사에서 구입하였다.
재료. 원형질체를 분리하기 위하여 사용한 토마토의 뿌리조직은 흥농종묘의 서광토마토(乙ycope而co” esculentum L.; Pink Forcer) 종자를 발아하여 얻었다. 종자는 스펀지를 이용하여 빛을 주지 않은 상태로 25。(2를 유지하며 증류수에서 약 3-5일간 발아시켰고, 발아 후 Cho 등의 방법에 따라 제조한 양액이 담긴 플라스틱 용기에 이식하였다.
효소 농도에 따른 효과. 토마토 뿌리조직으로부터 원형질체를 분리하기 위한 세포벽 분해효소로 cellulase와 macerozyme, pectolyase를 사용하였다. 효율적인 원형질체 분리를 위한 이들세 가지 효소의 적정 농도를 결정하기 위하여 각각의 효소 농도에 따른 원형질체 수를 조사하였다.
이론/모형
이것을 초고속 원심분리하여 침전으로 whole tissue 용액을 얻었고, 마쇄한 용액을 3겹의 거즈로 여과한 현탁액을 초고속 원심분리하여 침전을 filtered tissue로 흐]였다. 마지막으로 뿌리조직으로부터 Cho 등9)의 방법에 따라 분리한 원형질막 및 액포막 마이크로솜 분획을 purified membrane 시료로 사용하였다. 이렇게 분리한 4가지 시료의 단백질 함량은 Lowry방법3)으로 측정한 후, 각각의 ATPase 활성측정에 이용하였다.
원형질체의 세포활성 평가. 원형질체의 세포활성은 Niggli 등'2)의 enzyme-coupled assay법을 변형한 Cho 등, 의 방법으로 마이크로 솜 /TPase의 활성을 측정함으로써 평가하였다. 먼저, 생체중량 1g의 잘게 자른 토마토 뿌리조직을 효소처리한 후, 원형질체를 300Xg로 10분간 원심분리하여 분리하고, 뿌리 중량의 1/10배(w/v)인 100 B의 완충용액(250 mM sucrose, 2mM DTT, 0.
마지막으로 뿌리조직으로부터 Cho 등9)의 방법에 따라 분리한 원형질막 및 액포막 마이크로솜 분획을 purified membrane 시료로 사용하였다. 이렇게 분리한 4가지 시료의 단백질 함량은 Lowry방법3)으로 측정한 후, 각각의 ATPase 활성측정에 이용하였다.
5). 효소 용액을 이용한 원형질체 분리과정은 Shin 등3)의 방법을 기초로 하여 이루어졌다. 간략히, 토마토 뿌리조직을 약 0.
성능/효과
높음을 확인하였다. 결론적으로, 토마토 뿌리조직으로부터의 원형질체 분리를 위한 최적 조건은 300mM sorbitol에서의 전처리와 700mM sorbitol에서의 효소처리로 얻어졌으며, pH와 효소농도, 배양시간 등의 조절로 원형질체의 분리효율을 1.6배 증가시킬 수 있었다. 이렇게 분리한 원형질체의 세포활성은 뿌리조직에서의 세포활성과 비교하였을 때 큰 차이를 보이지 않았다.
두 단계 삼투압 처리에 의한 뿌리조직 원형질체 분리 방법은 원형질체의 분리효율뿐만 아니라 분리한 원형질체의 생리활성도 높음을 확인하였다. 결론적으로, 토마토 뿌리조직으로부터의 원형질체 분리를 위한 최적 조건은 300mM sorbitol에서의 전처리와 700mM sorbitol에서의 효소처리로 얻어졌으며, pH와 효소농도, 배양시간 등의 조절로 원형질체의 분리효율을 1.
생육장애시 이온채널을 통하여 나타나는 이온의 비정상적 이동은 미세전극을 이용한 patch clamp 방법으로 측정할 수 있으며, ” 유리전극의 사용을 위해서는 깨끗한 세포막을 갖는 원형질체의 분리가 선행되야 한다. 따라서 안정하게 생체막 효소의 활성을 유지하는 원형질체를 분리하기 위하여 토마토 뿌리조직으로부터 삼투압, 세포벽 분해효소, pH 등 다양한 조건을 조합하여 원형질체 분리효율을 조사하였고, 두 단계의 삼투압 처리가 원형질체 형성에 효과적임을 확인하였다. 이렇게 얻어진 원형질체는 높은 세포활성을 갖고 있음을 확인하였다.
6). 따라서, 분리한 원형질체는 세포활성이 약 4시간동안 유지되어 대부분의 생리활성 실험에 무리없이 사용될 수 있음을 확인하였다.
것으로 추측된다. 또한, 두 번째 단계에서 sorbitol의 농도가 낮은 경우에는 형성된 원형질체가 팽창하여 시간에 따라 파괴됨으로써 효율이 감소됨을 확인하였다.
먼저, cellulase의 농도를 5%까지 증가시켰을 때, 원형질체 형성은 3%에서 가장 크게 나타났으며, 그 이상의 농도에서는 오히려 감소하였다(Fig. 2, ■). 이러한 결과는 온실에서 재배한 토마토 엽육조직으로부터 원형질체 유리가 3% cellulase를 포함하는 효소용액에서 최대로 얻어졌다는 이전의 보고와 동일하였다.
5- 3시간까지 효소용액에서 원형질체를 분리하며 원형질체의 수를 조사하였다. 뿌리조직의 효소처리 시간이 증가할수록 원형질체의 수는 급격히 증가하였고, 약 2시간 후에는 원형질체의 수가 일정하게 유지되었다(Fig. 4). 배양시간을 3시간 이상으로 증가시켰을 경우는 더 이상 증가를 관측할 수 없었고, 오히려 점차 수가 감소하였다(자료 미제시).
효율적인 원형질체 분리를 위한 이들세 가지 효소의 적정 농도를 결정하기 위하여 각각의 효소 농도에 따른 원형질체 수를 조사하였다. 세 가지 효소 중 한가지의 효소농도만을 변화시켰으며, 나머지 두 효소의 농도는 일정하게 유지하였다. 이때, 효소의 기본농도는 cellulase와 macerozyme, pectolyase가 각각 2, 2, 0.
이렇게 분리한 원형질체의 세포활성은 뿌리조직에서의 세포활성과 비교하였을 때 큰 차이를 보이지 않았다. 이 방법을 통하여 분리한 원형질체 크기는 20-50 로다양한 분포를 보였으며 (Fig. 7), 현미경 관측상 비교적 깨끗한 막을 갖고 있어 미세전극을 이용한 patch clamp 방법을 통하여 세포막의 이온채널 특성을 연구하기에 무리없이 사용될 수 있음을 확인하였다.
배양시간을 3시간 이상으로 증가시켰을 경우는 더 이상 증가를 관측할 수 없었고, 오히려 점차 수가 감소하였다(자료 미제시). 이러한 결과로부터 원형질체 분리를 위한 효소의 처리시간은 2시간이 적절함을 확인하였다.
Sorbitol을 사용한 삼투압 조절을 통하여 측정한 원형질체 형성효율은 극히 낮아 IX105 cell・ml-1 이하의 원형질체가 발견되었다. 이러한 예비실험 과정에서 1차 처리된 조직을 더 높은 농도의 sorbitol용액에 처리하였을 때, 많은 원형질체가 형성됨을 확인하였다. 따라서 두 단계의 삼투압 처리조건을 다양하게 분석하였다.
1 % 가 되도록 일정하게 조절하였다. 이러한 조건에서 형성된 원형질체의 수는 300 mM sorbitol을 포함하는 완충용액에서 전처리한 후, 500 또는 700 mM sorbitol을 포함하는 효소용액에서 분리하였을 때, 약 5X105 cell ml-1로 가장 높게 나타났다(Fig. 1). 효소용액에 sorbit이의 농도가 700mMe 때, 형성된 원형질체는 독립적으로 분리되어 발견되어 사용에 유리하였으며, 전처리로 500이나 700 mM sorbitol을 처리하였을 때는 오히려 원형질체의 분리율이 감소하였다.
1% pectolyase를 포함하는 조건에서는 macerozyme의 농도가 2%°] 상으로 증가되면 오히려 원형질체의 분리효율이 감소함을 확인하였다. 이상의 결과로부터 효율적인 원형질체 형성을 위한 효소 농도는 3% cellulase와 1% macerozyme, 0.1% pectolyase의 혼합조건임을 확인하였다. 이후 원형질체의 분리는 이러한 혼합효소 조건에서 이루어졌다.
). 즉, 2% cellulase와 0.1% pectolyase를 포함하는 조건에서는 macerozyme의 농도가 2%°] 상으로 증가되면 오히려 원형질체의 분리효율이 감소함을 확인하였다. 이상의 결과로부터 효율적인 원형질체 형성을 위한 효소 농도는 3% cellulase와 1% macerozyme, 0.
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