차가버섯과 어성초 함유 발효 조성물이 인체 위암 AGS 및 대장암 HCT-15 세포 생육에 미치는 영향 Effect of Fermented Compositions Containing Inonotus obliquus with Houttuynia cordata on Growth of Human AGS Gastric and HCT-15 Colon Cancer Cells원문보기
어성초 분말을 포함하는 차가버섯 발효 조성물의 물 추출물이 인체 위암 세포 AGS 및 대장암 세포 HCT-15, 그리고 정상세포 NIH3T3 fibroblast의 세포 생육에 미치는 영향을 검토하였다. 세포독성 실험은 세포수 count와 MTT 방법으로 측정하였다. 어성초 분말을 포함하는 차가버섯 발효 조성물의 제조는 차가버섯과 어성초 분말을 혼합하고, 여기에 대두 발효 미생물원을 다시 혼합시켜 습도 $50{\sim}60%$,온도 $30{\sim}37^{\circ}C$에서 30일 정도 발효시킨 후 건조 시킨 분말에서 5% 물 추출물을 얻어 동결건조 시켜 실험에 제공하였다. MTT assay 방법에서 차가버섯 발효 조성물의 수용성 추출물 0.16, 0.4, 0.8, 1.6 및 4.0 mg/ml 첨가 농도에서 AGS 세포 생육은 13, 25, 40, 67 및78% 억제 되었으며, HCT-15세포 생육은 22, 40, 50, 69및 76%씩 각각 억제되었다. 그러나 동일한 실험조건에서 정상 세포수 NIH3T3은 86% 이상의 생존율을 나타내었다. 차가버섯 발효 조성물의 수용성 추출물은 인체 대장암 세포주 HCT-15와 위암 세포수 AGS에 대해 생육억제 작용이 강한 반면, 정상세포 NIH3T3에 대해서는 세포 독성을 거의 나타내지 않아 가장 바람직한 암예방 또는 항암식품 개발가능성을 제시하였다.
어성초 분말을 포함하는 차가버섯 발효 조성물의 물 추출물이 인체 위암 세포 AGS 및 대장암 세포 HCT-15, 그리고 정상세포 NIH3T3 fibroblast의 세포 생육에 미치는 영향을 검토하였다. 세포독성 실험은 세포수 count와 MTT 방법으로 측정하였다. 어성초 분말을 포함하는 차가버섯 발효 조성물의 제조는 차가버섯과 어성초 분말을 혼합하고, 여기에 대두 발효 미생물원을 다시 혼합시켜 습도 $50{\sim}60%$,온도 $30{\sim}37^{\circ}C$에서 30일 정도 발효시킨 후 건조 시킨 분말에서 5% 물 추출물을 얻어 동결건조 시켜 실험에 제공하였다. MTT assay 방법에서 차가버섯 발효 조성물의 수용성 추출물 0.16, 0.4, 0.8, 1.6 및 4.0 mg/ml 첨가 농도에서 AGS 세포 생육은 13, 25, 40, 67 및78% 억제 되었으며, HCT-15세포 생육은 22, 40, 50, 69및 76%씩 각각 억제되었다. 그러나 동일한 실험조건에서 정상 세포수 NIH3T3은 86% 이상의 생존율을 나타내었다. 차가버섯 발효 조성물의 수용성 추출물은 인체 대장암 세포주 HCT-15와 위암 세포수 AGS에 대해 생육억제 작용이 강한 반면, 정상세포 NIH3T3에 대해서는 세포 독성을 거의 나타내지 않아 가장 바람직한 암예방 또는 항암식품 개발가능성을 제시하였다.
This study was performed to investigate the inhibitory effect of the water-extract from fermented compositions containing Inonotus obliquus with added Houttuynia cordata on the growth of either human AGS gastric and HCT-15 colon cancer cells or NIH3T3 normal mouse fibroblast cells. Cytotoxic activit...
This study was performed to investigate the inhibitory effect of the water-extract from fermented compositions containing Inonotus obliquus with added Houttuynia cordata on the growth of either human AGS gastric and HCT-15 colon cancer cells or NIH3T3 normal mouse fibroblast cells. Cytotoxic activity on cancer cells was investigated by viable cell count, MTT assay and morphological observation. Mixtures of Inonotus obliquus with added Houttuynia cordata were fermented at $30{\sim}37^{\circ}C$, $50{\sim}60%$ humidity for 30 days, extracted with water, freeze dried, powered, and then dissolved in water for the experiment. In MTT assay, the fermented compositions exhibited inhibitory effects of 13, 25, 40, 67 and 78% for AGS and 22, 40, 50, 69 and 76% for HCT-15 at 0.16, 0.4, 0.8, 1.6 and 4.0 mg/ml, respectively. However, normal NIH3T3 cells were exhibited 86% survival under the same experimental condition. Fermented compositions showed highly inhibitory effect against human cancer cell line HCT-15 and AGS, but not on normal cell line NIH3T3.
This study was performed to investigate the inhibitory effect of the water-extract from fermented compositions containing Inonotus obliquus with added Houttuynia cordata on the growth of either human AGS gastric and HCT-15 colon cancer cells or NIH3T3 normal mouse fibroblast cells. Cytotoxic activity on cancer cells was investigated by viable cell count, MTT assay and morphological observation. Mixtures of Inonotus obliquus with added Houttuynia cordata were fermented at $30{\sim}37^{\circ}C$, $50{\sim}60%$ humidity for 30 days, extracted with water, freeze dried, powered, and then dissolved in water for the experiment. In MTT assay, the fermented compositions exhibited inhibitory effects of 13, 25, 40, 67 and 78% for AGS and 22, 40, 50, 69 and 76% for HCT-15 at 0.16, 0.4, 0.8, 1.6 and 4.0 mg/ml, respectively. However, normal NIH3T3 cells were exhibited 86% survival under the same experimental condition. Fermented compositions showed highly inhibitory effect against human cancer cell line HCT-15 and AGS, but not on normal cell line NIH3T3.
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문제 정의
6)그 또한, 어성초에는 aristolactam, piperolactam, splendidine 같은 alkaloids와 quercitrin, quercetin, kaempferol 같은 polyphenol류가 많이 함유되어 있어 항산화 활성 및 항암작용이 강한 것으로 보고된 바 있다.7) 본 연구에서도 차가버섯의 항종양 활성을 증가시킬 목적으로 항종양 활성이 강한 어성초를 첨가하여 발효시킨 조성물의 물 추출물을 얻어 최근 우리나라 남녀 모두에서 가장 많이 발생하는 위암과 대장암에 대한 항암효과를 검토하기 위하여 인체유래 위암 세포주 AGS(gastric cancer cell)와 대장암 세포주 HCT-15(colon cancer cell) 생육에 미치는 항종양 효과를 검토하였다.
따라서, 기능성 식품을 개발하는데 있어서 안전성과 경제성을 고려해 볼 때 수용성 추출물이 가장 바람직한 것으로 생각된다. 그러나, 차가버섯의 항종양 활성은 에틸아세테이트 분획물에서 강하게 나타났으나, 수용성 분획에서는 상대적으로 약하면서도 정상세포에 대해서도 약간의 성장억제 작용이 있는 것으로 보고되어 이러한 문제점을 개선할 수 있는 연구가 필요하다고 본다, 본 연구자들은 이러한 점을 감안하여 물 추출물중에 종양세포에 대해 성장억제 작용을 나타내는 catechin과 같은 polyphenol 화합물을 많이 함유한 녹차M를 일부 첨가하여 발효시킨 조성물의 물 추출물에 위암 및 대장암 세포의 생육억제 작용이 있는 결과를 선행연구를 통하여 얻을 수 있었다.
최근의 조사에서 우리나라의 경우 식생활이 서구화 되어감에 따라 위암 및 대장암 발생률이 꾸준히 증가 추세로 나타나고 있다.따라서, 본 실험에서는 최근 들어 성인 남녀 모두에서 급속히 증가되어 사회적 문제로 제기되고 있는 위암 및 대장암에 대한 항종양 효과를 검토하기 위하여 인체유래 위암 세포주 AGS(gastric cancer cell)와 대장암 세포주 HCT-15(colon cancer cell)를 선택하였다.
실험재료의 조제. 어성초를 포함하는 차가버섯 발효 조성물의 물 추출물중의 항종양 활성을 나타내는 다당체의 기능을 높이기 위하여 본 연구자들에 의하여 분리 보관된 protease와 amylase 활성이 강한 Bacillus속 균주를 배양시킨 후 살균한 대두 발효기질에 접종하여 37P에서 7일간 발효시켜 미생물 원을 얻었다.'' 차가버섯 분말과 어성초분말을 10:1 비율(w/w)로 혼합하고, 여기에 대두 발효 미생물원을 다시 10:3 비율(w/w)로 혼합 시켜 습도 50-60%, 온도 30~37℃에서 발효시켜 30일 정도 경과하였을 때 60~7(FC로 속성 건조시킨 후 분말화 시켰다.
. 의품의 소재 개발 가능성을 제시하게 되었다.
제안 방법
어성초를 포함하는 차가버섯 발효 조성물의 물 추출물중의 항종양 활성을 나타내는 다당체의 기능을 높이기 위하여 본 연구자들에 의하여 분리 보관된 protease와 amylase 활성이 강한 Bacillus속 균주를 배양시킨 후 살균한 대두 발효기질에 접종하여 37P에서 7일간 발효시켜 미생물 원을 얻었다.'' 차가버섯 분말과 어성초분말을 10:1 비율(w/w)로 혼합하고, 여기에 대두 발효 미생물원을 다시 10:3 비율(w/w)로 혼합 시켜 습도 50-60%, 온도 30~37℃에서 발효시켜 30일 정도 경과하였을 때 60~7(FC로 속성 건조시킨 후 분말화 시켰다. 이렇게 조제된 차가버섯 발효 조성물을 5%(w/v) 농도로 증류수에 취하여 80~1000(2에서 3시간 추출한 후 여과지로 여과시킨 후 동결건조시켜 얻은 분말을 시료로 사용하였다.
AGS와 HCT-15 및 NIH3T3 세포를 次 盼 cells/mZ 되도록 조절하여 24 well tissue culture dish에 분주하고 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 6시간 동안 배양하여 세포를 dish 바닥에 부착시킨 후, 차가버섯 발효 조성물의 추출물을 0.16, 0.4, 0.8, 1.6, 4.0 mg/m/ 농도로 만든 실험 용액을 각각 20씩 첨가하였다. 이를 24시간 간격으로 최대 96시간까지 배양하면서 세포 수를 측정하였는데 이때 모든 세포 실험은 3회 반복 측정하였다.
04 N HC1 in isopropanol)을 각 well당 100 叫씩 첨가하고, dark blue crystal을 용해시킨 후 ELISA- reader(Bio-Rad Model 550 Microplate Reader, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포의 시료 무첨가구를 100% 로 하여 상대적인 세포 성장률을 구하였다. 또한, 농도별 세포배양 실험에서 얻어진 결과를 바탕으로 정상세포에 80% 이상의 생존율을 보이는 1.
세포 형태 관찰. 각 세포의 형태 변화의 관찰을 위하여 1.6 mg/ml 농도로 첨가하여 96시간 배양한 후 디지털 카메라가 장착된 culture microscopes(CKX41, Olympus Optical Co., Ltd. Tokyo, Japan)에 200배 배율로 확대하여 촬영하였다.
이를 24시간 간격으로 최대 96시간까지 배양하면서 세포 수를 측정하였는데 이때 모든 세포 실험은 3회 반복 측정하였다. 경시적으로 배양된 세포에 1 m/의 0.05% trypsin- EDTA(Grand Island Biological Co., USA)를 처리하여 세포를 dish 바닥에서 부유시킨 후 10mZ의 PBS buffer로 씻어 원심분리하고 상층액을 제거한 후 PBS buffer에 재부유된 세포 50 를 0.4% trypan blue stain(Gibco, USA) 50p7에 넣어 섞고, 1 분후 haematometer로 세포수를 측정하였다.
각 세포의 시료 무첨가구를 100% 로 하여 상대적인 세포 성장률을 구하였다. 또한, 농도별 세포배양 실험에서 얻어진 결과를 바탕으로 정상세포에 80% 이상의 생존율을 보이는 1.6mg/mJ 농도로 각 세포 배양에 첨가하여 96시간 배양시켜 상기와 동일한 방법으로 MTT assay를 분석하였다.
이렇게 생성된 fomazan을 용해시켜 그 발색정도를 흡광도로 측정함으로 살아있는 세포의 수를 계측할 수 있다. 본 실험에서는 먼저 차가버섯 발효 조성물의 수용성 추출물의 농도별 세포 생육 저해실험을 MTT assay로 분석하였다. 종양세포 및 정상세포를 2X1(/ cells/m/ 농도가 되도록 조절한 후 96 well plate에 100 B씩 분주하고 이것을 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 간 배양하여 세포를 부착시킨 후 각각 차가 버섯조성물의 추출물을 0.
01 mg/mZ streptomycine을 함유한 RPMI media 1640 복합배지에 37℃, 5% CO2, 95% 공기의 조건하에서 10 cm Falcon dish로 약 1주일간 배양하였으며, 이때 배지는 2~3일에 한 번씩 교환하였다. 실험 개시전 세포를 배양기에 2><105개씩 접종하여 세포성장이 배양기 표면의 80-90% 정도 되었을 때 trypsin 을 사용하여 세포를 dish에서 분리하고 일정량의 Dulbeccbs modified Eagle's medium(DMEM; Bio Whittaker Co, USA) 으로 세포를 2회 씻어준 다음 희석하여 본 실험에 사용하였다. 차가버섯 발효 조성물의 5% 추출물을 동결건조시켜 얻은 분말을 RPMI 1640에 0.
0 mg/m/ 농도로 만든 실험 용액을 각각 20씩 첨가하였다. 이를 24시간 간격으로 최대 96시간까지 배양하면서 세포 수를 측정하였는데 이때 모든 세포 실험은 3회 반복 측정하였다. 경시적으로 배양된 세포에 1 m/의 0.
) 상에 5% 수용성 주출물을 spot하여 1-butanol/ ethanoVwater(5 :5 : 3) 용매로 전개시켰다. 전개가 완료된 plate는 3% 황산을 함유한 methanol 발색용액을 살포 한 후 hot plate 상에서 가열시켜 다당체의 분획을 확인하였다. 이때 사용한 표준물질은 standard malto-oligosaccharides(Gl-G7)로서 Gl, G2, G3, G4, G5, G6 및 G7은 각각 glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose 및 maltoheptaose 이였다.
본 실험에서는 먼저 차가버섯 발효 조성물의 수용성 추출물의 농도별 세포 생육 저해실험을 MTT assay로 분석하였다. 종양세포 및 정상세포를 2X1(/ cells/m/ 농도가 되도록 조절한 후 96 well plate에 100 B씩 분주하고 이것을 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 간 배양하여 세포를 부착시킨 후 각각 차가 버섯조성물의 추출물을 0.16, 0.4, 0.8, 1.6, 4.0 mg/mZ 농도로 만들 실험용액을 각각 20mg씩 되도록 첨가하였다. 이것을 96시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양시킨 후, 5 mg/m/ 농도로 PBS로 희석한 MTT(Sigma chemical Co.
, USA) 등을 사용하였다. 종양세포와 대조군으로 사용한 NIH3T3 세포 배양은 전보의 방법®0에 따라 10% FBS, 0.1mg/mZ penicillin-G, 0.01 mg/mZ streptomycine을 함유한 RPMI media 1640 복합배지에 37℃, 5% CO2, 95% 공기의 조건하에서 10 cm Falcon dish로 약 1주일간 배양하였으며, 이때 배지는 2~3일에 한 번씩 교환하였다. 실험 개시전 세포를 배양기에 2><105개씩 접종하여 세포성장이 배양기 표면의 80-90% 정도 되었을 때 trypsin 을 사용하여 세포를 dish에서 분리하고 일정량의 Dulbeccbs modified Eagle's medium(DMEM; Bio Whittaker Co, USA) 으로 세포를 2회 씻어준 다음 희석하여 본 실험에 사용하였다.
차가버섯 발효 조성 + 물의 다당체를 확인하기 위한 박층 크로마토그래피는 silica gel plate(25 DC-Alufolien Kieselgel 60, Merck Co., Ltd.) 상에 5% 수용성 주출물을 spot하여 1-butanol/ ethanoVwater(5 :5 : 3) 용매로 전개시켰다. 전개가 완료된 plate는 3% 황산을 함유한 methanol 발색용액을 살포 한 후 hot plate 상에서 가열시켜 다당체의 분획을 확인하였다.
실험 개시전 세포를 배양기에 2><105개씩 접종하여 세포성장이 배양기 표면의 80-90% 정도 되었을 때 trypsin 을 사용하여 세포를 dish에서 분리하고 일정량의 Dulbeccbs modified Eagle's medium(DMEM; Bio Whittaker Co, USA) 으로 세포를 2회 씻어준 다음 희석하여 본 실험에 사용하였다. 차가버섯 발효 조성물의 5% 추출물을 동결건조시켜 얻은 분말을 RPMI 1640에 0.16-4.0mg/m7 농도가 되도록 현탁 시킨 후 0.45 필터 (Millex-HD, Millipore Co., USA)로 각각 제균 시켜 세포배양에 첨가하였다.
대상 데이터
이렇게 조제된 차가버섯 발효 조성물을 5%(w/v) 농도로 증류수에 취하여 80~1000(2에서 3시간 추출한 후 여과지로 여과시킨 후 동결건조시켜 얻은 분말을 시료로 사용하였다. 본 실험에 사용한 차가버섯과 어성초 분말은 (주)홍재그린(Seoul, Korea)에서 제공받아 사용하였다.
정상세포 및 종양세포 배양. 인체 위암 세포주 AGS, 대장암 세포주 HCT-15 및 NIH3T3은 Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 계대 배양하면서 사용하였다. 세포 배양에는 RPMI media 1640(Invitrogen Co.
이론/모형
총당 측정 및 다당체 확인. 차가버섯 발효 조성물의 총당은 phenol-sulfuric acid법으로 발색시켜 490nm에서 흡광도를 측정한 검량선으로부터 총당 함량을 계산하였다.
성능/효과
0 mg/mZ 고농도에서는 71%의 생존율을 보였다. AGS 종양세포에 대해서는 0.16, 0.4, 0.8, 1.6, 4.0 mg/mZ 농도에서 각각 13, 25, 40, 67, 78%의 생육 저해율을 나타내었고, HCT-15 종양세포에 대해서는 22, 40, 50, 69, 76%의 생육 저해율을 나타내었다.
차가버섯 발효 조성물의 추출물을 첨가하지 않은 각각의 무첨가구를 100%로 하여 상대치로 나타내었을 때 정상세포주 NIH3T3은 96시간까지의 세포 배양에서도 80% 이상의 높은 생존율을 나타내어 MTT assay와 동일한 결과로써 정상세포에는 거의 독성이 없는 것으로 확인되었다. 그러나, 동일 농도에서 위암 세포주 AGS는 73%의 세포 생육 억제율과 대장암 세포주 HCT-15의 경우는 79%로 나타나 상당한 종양세포 억제 효과가 확인되었다. 이러한 결과는 이전의 연구에서 어성초 첨가 대신 녹차분말을 넣었을 때 나타난 HCT-15 의 53%와 AGS 세포의 58% 생육 억제 효과보다 높게 나타나 일부는 어성초의 효과에 의한 것으로 사료되어 진다.
정상세포인 NIH3T3은 차가버섯 발효 조성물의 추출물 첨가에 의해서도 세포독성이 거의 없었다. 그러나, 종양 세포주인 AGS와 HCT-15에서는 dark blue formazan 생성량이 많아 짙은 자색을 띄고 있는 무첨구에 비해서 첨가 구에서는 옅은 색을 띄어 살아있는 세포수가 상대적으로 적어 생육 억제 효과가 확인되었다.
5와 같으며, 특히 종양 세포주 HCT-15와 AGS 세포의 경우 세포사멸 정도가 분명하게 나타난 것을 알 수 있다. 따라서 차가 버섯발효 조성물의 추출물 농도가 1.60 mg/mZ 이하에서는 정상 세포인 NIH3T3 세포의 생육에는 큰 영향을 미치지 않으면서 위암 세포와 대장암 세포에는 특이적으로 세포 생육을 크게 저해시킴으로써 항암작용이 있는 것으로 확인되었다.
0 mg/m/ 농도별로 증가시킬 때 정상세포인 NIH3T3 세포는 생육이 크게 저해되지 않았지만, 위암 세포주 AGS 및 대장암 세포주 HCH5는 무첨가구에 비해 각각 첨가농도가 높을수록 살아있는 세포가 상대적으로 적은 것으로 나타나 세포생육 저해가 일어났다는 것을 의미한다. 이러한 MTT assay의 결과는 Fig. 3과 같이 차가버섯 발효 조성물의 추출물을 0.16-1.60 mg/m; 농도로 첨가하였을 때 NIH3T3 세포는 86% 이상의 높은 생존율을 보였으나, 단지 4.0 mg/mZ 고농도에서는 71%의 생존율을 보였다. AGS 종양세포에 대해서는 0.
이상의 실험 결과로부터 어성초를 함유한 차가버섯 발효 조성물 유래의 수용성 추출물은 정상세포의 세포 생육에는 크게 영향을 미치지 않으면서도 위암 세포와 대장암 세포의 생육을 크게 저해시킴으로써 가장 바람직한 새로운 암예방 및 항암식 . 의품의 소재 개발 가능성을 제시하게 되었다.
2와 같다. 차가버섯 발효 조성물의 추출물을 각 세포에 0-4.0 mg/m/ 농도별로 증가시킬 때 정상세포인 NIH3T3 세포는 생육이 크게 저해되지 않았지만, 위암 세포주 AGS 및 대장암 세포주 HCH5는 무첨가구에 비해 각각 첨가농도가 높을수록 살아있는 세포가 상대적으로 적은 것으로 나타나 세포생육 저해가 일어났다는 것을 의미한다. 이러한 MTT assay의 결과는 Fig.
6과 같다. 차가버섯 발효 조성물의 추출물을 첨가하지 않은 각각의 무첨가구를 100%로 하여 상대치로 나타내었을 때 정상세포주 NIH3T3은 96시간까지의 세포 배양에서도 80% 이상의 높은 생존율을 나타내어 MTT assay와 동일한 결과로써 정상세포에는 거의 독성이 없는 것으로 확인되었다. 그러나, 동일 농도에서 위암 세포주 AGS는 73%의 세포 생육 억제율과 대장암 세포주 HCT-15의 경우는 79%로 나타나 상당한 종양세포 억제 효과가 확인되었다.
1과 같다. 차가버섯 추출물의 다당체를 박층 크로마토그래피법으로 확인한 결과 대부분 분자량이 상당히 큰 고분자의 당으로 확인 되었으며, G7 부근에 저분자 당이 조금 나타났다. 일반적으로 버섯 유래의 항암효과를 가지는 다당체는 §-(1, 3) 결합에 P-(l, 6) 곁가지를 가지는 비교적 고분자 glucan으로 수용성 추출물중에 있는 것으로 알려져 있다.
94%를 차지하였다. 차가버섯으로부터 추출된 수용성 및 불용성 polysaccharides 수율이 각각 17.7% 및 13.3%로 나타나 본 연구 결과보다 약간 낮았으며, 버섯 자실체 추출물중의 다당체가 균사체 배양 다당체보다 2~3배 정도 높은 항암효과를 가진다고 하였다.5)이러한 다당체의 구조는 P-(l, 3) 주쇄에 3-( 1, 6) 곁가지가 결합된 glucan 인 xylogalactoglucan으로 밝*) 혀졌다.
후속연구
5배 정도 적은 양임에도 불구하고 종양 세포 성장 억제작용이 강한 것은 어성초 유래의 물질 또는 발효원 첨가로 인한 차가버섯 유래의 다당체 분해에 의해 생성된 물질의 영향을 받은 것으로.사료되어 지나, 정확한 실험 내용에 대해서는 차후 보다 자세한 검토가 있어야 할 것으로 여겨진다.
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