보고서 정보
주관연구기관 |
국립원예특작과학원 National Institute of Horticultural and Herbal Science |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2013-01 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
과제관리전문기관 |
국립원예특작과학원 National Institute of Horticultural and Herbal Science |
등록번호 |
TRKO201300013809 |
과제고유번호 |
1395028650 |
사업명 |
원예특작시험연구 |
DB 구축일자 |
2013-07-29
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201300013809 |
초록
▼
Ⅰ. 제 목
○ 버섯 생리활성물질 추출물 은행구축 및 기능성 소재화
Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성
세계적으로 버섯종류는 약 20,000여 종으로 추산되며, 그 중 식용으로 개발가능한 버섯은 약 2,000여 종으로 알려져 있고, 우리나라에서 자생하는 것은 약 1,800여 종으로 300여 종이 식, 약용으로 분류되고 있으나, 실제적으로 20여 종만 이용된다. 버섯은 식품소재, 기능성 바이오 소재 및 의약소재로 좋은 재료이며 영지, 상황, 차가버섯 등 약용으로 사용이 이를 입증하고 있으며 버섯의 체계적인 화학성분 분리
Ⅰ. 제 목
○ 버섯 생리활성물질 추출물 은행구축 및 기능성 소재화
Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성
세계적으로 버섯종류는 약 20,000여 종으로 추산되며, 그 중 식용으로 개발가능한 버섯은 약 2,000여 종으로 알려져 있고, 우리나라에서 자생하는 것은 약 1,800여 종으로 300여 종이 식, 약용으로 분류되고 있으나, 실제적으로 20여 종만 이용된다. 버섯은 식품소재, 기능성 바이오 소재 및 의약소재로 좋은 재료이며 영지, 상황, 차가버섯 등 약용으로 사용이 이를 입증하고 있으며 버섯의 체계적인 화학성분 분리 및 유효성분의 구조규명이 절실히 요구된다. 또한 버섯산업의 국제경쟁력 확보를 위해 버섯자원의 수집 및 평가 보존에 대한 시스템 구축이 필요하며, 버섯산업에서 요구하는 평가 및 데이터베이스 구축을 통한 종합적인 관리시스템이 필요하다. 버섯산업의 경쟁력 제고를하여 수집 버섯자원의 기능성 연구를 통한 버섯자원의 산업적 가치를 제고할 필요가 있다.
버섯은 식품적 가치가 우수하고 독특한 향과 맛을 지니고 있어(Chang and Miles, 1989), 이미 고대로부터 식용뿐만 아니라 약용으로도 사용되어져 왔으며, 오늘날 버섯의 종수는 적어도 10,000여 종이 있는 것으로 알려져 있고 그 중 식용 가능한 버섯은 약 600여 종에 달한다(Ammirati et al., 1985). 또한 식용버섯의 일반성분인 탄수화물, 아미노산, 정미성분, 무기질에 관한 연구가 수행되어 왔으며 Hashiguchi 등(1984)에 의하면, 표고는 일반채소류나 과실류와 같이 지방함량이 높지는 않으나 불포화지방산인 linoleic acid의 비율이 높다. 느타리버섯은 채소류나 일부 버섯류에 비하여 영양가와 향미가 높아(Crisan and Sands, 1978), 고혈압, 당뇨병에도 효과가 있고(Chang and Miles, 1989), 특히 항암효과(Yoshioka et al., 1985) 등의 약리활성이 있다고 보고하였다. 또한 단백다당체와 베타글루칸(Yoshioka et al., 1985), 아미노산조성(Jandaik and Kapoor, 1976; Karlberer and Kunsch, 1974)등에 대한 기능성 물질 등에 대해서도 보고되었으며, 최근에는 버섯의 항염활성과 관련된 약리학적 활성에 관한 연구(Kim et al., 2004)도 보고되었다.
중풍은 암, 관상동맥 질환에 이어 제 3위의 사망원인이고 전 세계에서 연간 4천5백만명의 환자가 발생한다. 2000년도 한국인 주요 사망원인은 인구 10만 명당 암 122.1명, 뇌혈관 질환 73.2명, 운수사고 25.4명, 간질환 22.5명 순서이며, 성인 10명중 1명꼴로 뇌졸중이 잠복된 채 현재진행중이 발표되었으며 최근 보건복지부 보고서 중 <한국형 건강진단 모델 개발 연구>에서 질병 부담률을 100%로 가정했을 때 55-64세에서는 중풍이 18%(남)와 12%(여)로 1위 조사되었다. 혈관성 치매는 뇌졸중이 그 원인인데 뇌경색인 전뇌 기지핵이나, 해마, 대뇌의 전두엽 또는 측두엽 등에 생기면 치매 발병이 높고 보통 대뇌반구 조직의 약 5%에 손상이 가면 치매가 발병한다. 치매는 임상적 징후가 나타나기 오래 전부터 서서히 진행되는 만성적 장애이므로 이에 따른 적절한 치료가 필요하며 건강하게 장수하고자 하는 욕구가 커지면서 일상생활을 통한 예방에 관심이 높아지고 있다. 현재까지 개발된 기억력 개선 약물은 아세틸콜린 합성전구체, 수용체 활성제 콜린에스테라제 저해제의 Tacrine 및 Donepizil이 경증의 환자에 사용중이며 미국은 65세 이상의 인구가 15-20%를 차지하며 미국정부는 2002년에 6억 달러를 치매연구에 사용하고 치매의 잠재적인 미국시장규모는 년간 20억 달러로 추정되며 미국내 이병으로 고생하는 4백만 명의 환자 중 반수가 치료를 받는다 해도 1,000만 달러로 추정할 수 있는 시장규모이다. 신경보호제 시장규모는 향후 기하급수적으로 커질 전망하고 있다. Neuroprotective products의 시장규모는 2003년 중추신경 전체 시장인 244억 달러 중에서 18억 달러 규모이며 2005년 51억 달러이며 2010년에는 115억 달러로 향후 6-7년간 10배 이상 규모가 커질 것으로 예상된다. 중풍 발생후 수일까지 생기는 염증반응과 세포고사를 차단하는 iNOS/COX-2 저해제 또는 성장인자 등의 여러 종류가 개발되고 있다. 현재 허혈에 의한 신경손상의 예방 및 치료방법에 대한 병리적 현상이나 신경 세포손상의 진행을 차단하는 치료제 개발에 중점하고 있다. 버섯산업의 국제경쟁력 확보를 위해 버섯자원의 수집 및 평가 보존에 대한 시스템 구축이 필요하다. 버섯산업에서 요구하는 버섯 유전자원의 체계적인 특성평가 및 데이터베이스 구축을 통한 종합적인 관리 시스템이 필요하다. 버섯산업의 경쟁력 제고를 위하여 수집 버섯자원의 기능성 물질 탐색을 통한 버섯자원의 산업적 가치를 제고할 필요가 있다.
아직 기능이 밝혀지지 않은 식용 및 야생버섯을 채집하여 라이브러리 구축하고 이를 바탕으로 한 버섯 유전자원의 체계적인 생리활성을 연구할 필요성이 있다. 과제수행기간동안 120점의 식용 및 야생버섯을 수집 및 채집하였고, 몇몇의 버섯을 가지고 생리활성검정이 필요하다. 뇌신경보호소재용 식용버섯 개발을 위한 신경세포를 통한 버섯추출물의 생리활성 검정을 수행할 필요가 있다. 각각 버섯의 생리활성성분의 원천기술을 확보를 위한 물질분리 및 NMR, LC/MS 등 각종 분광학적 기기를 통한 구조구명 요구가 증대되고, 고부가가치 버섯산업을 위한 소재재발 연구가 절실하다.
Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
식 • 약용 및 야생버섯의 시료확보 및 버섯자원의 추출물 은행구축을 위하여 식용버섯, 약용버섯 및 야생버섯 등 다양한 버섯을 시료를 확보하고 추출물을 제조하여 감압농축과정을 통하여 추출물 시료를 확보하였다. in vitro 신경세포에서 버섯 추출물의 활성연구를 위하여 추출물 자원으로부터 신경세포 상에서 뇌신경보호효과 활성 탐색을 수행하였다. 추출, 분획물별 신경보호효과 검정 및 유효물질군 탐색을 위하여 PC12 세포를 통하여 항산화효과 및 항치매효과 검정을 수행하였다. 세포상에서 산화적스트레스 회복능력 검정을 위하여 DCF-DA 활성검정을 수행하였으며 산화적 스트레스 회복능력이 우수한 추출물을 대상으로 항치매효과 검정을 위해 acetylcholinesterase(AChE) 저해능 활성검정을 수행하였다
버섯용매추출 및 용매극성별 물질분획물 제조를 위하여 제조된 추출물을 용매극성도 차이를 통하여 소북획물을 제조하였고, 각종 컬럼크로마토그래피를 이용한 물질분리, 정제를 TLC, HPLC, 분취용 HPLC를 통하여 수행하였다. 세부적으로 유효성분 분리를 위하여 컬럼크로마토그래피를 위한 Silica, C-18, TLC, HPLC, 분취용 HPLC 기법을 사용하여 성분을 분리하였다.
분리성분의 구조구명을 위하여 1H-NMR, 13C-NMR 등 분광기기와 화합물의 정확한 분자량 정보를 측정하기 위하여 LC/MS사용하였다. 각종 기기정보를 이용하여 구조분석을 진행하였다.
Ⅳ. 연구개발결과
1.버섯자원의 추출물 라이브러리 구축
느타리버섯 등 식용버섯 27점 및 야생버섯 50점을 포함하여 총 120점의 시료를 확보하고 추출물을 제조하였다. 식용 및 야생버섯의 항산화효과(DPPH) 검정을 위하여 노랑 느타리 외 34종의 버섯을 대상으로 수행한 결과 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯 등이 대조구인 ABTS보다 매우 우수한 항산화 효과를 보였다. 위암(AGS)세포와 간암(HepG2)세포에 대한 영지버섯 균주별 세포생장저해도를 대상균주 ASI7001외 9균주를 사용하였으며 그 결과 ASI7001은 70%EtOH추출물에서, ASI7002는 물추출물에서 위암세포에 농도별로 생장 저해도를 보였으며, ASI7002는 물 추출물에서, ASI7011은 70%EtOH 추출물에서 간암세포에 농도별로 생장 저해도를 보였다. 대식세포(Raw264.7)에 대한 야생버섯의 항염증효과 검정을 위하여 대상균주 Russula sorroria (노랑무당버섯)외 5종을 사용하였으며 그 결과Lactarius piperatus (굴털이버섯)에서 농도의존적으로 항염증효과가 우수함을 보였다.
식용 및 야생버섯의 항산화효과를 검정하기 위하여 노랑느타리 외 34종을 가지고 DPPH법을 수행한 결과 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯 등이 대조구인 ABTS보다 매우 우수한 항산화 효과를 보였다.
버섯추출물의 항암활성을 측정하기 위하여 위암(AGS)과 간암(HepG2)세포에 대한 영지버섯 균주별 세포생장저해도 검정하였다. 대상균주는 ASI7001외 9균주를 사용한 결과 ASI7001은 70%EtOH추출물에서, ASI7002는 물추출물에서 위암세포에 농도별로 생장저해도를 보였으며, ASI7002는 물추출물에서, ASI7011은 70%EtOH추출물에서 간암세포에 농도별로 생장저해도를 보였다.
대식세포(Raw264.7)에 대한 야생버섯의 항염증효과 검정을 위하여 Russula sorroria(노랑무당버섯)외 5종을 대상으로 실험진행결과 Lactarius piperatus(굴털이버섯)에서 농도의존적으로 항염증효과가 우수함을 보였다.
2. 버섯의 신경보호효과 구명 및 기능성 소재화
버섯의 용매추출물 및 극성분획물 뇌신경보호활성 검정을 위하여 MeOH추출물 및 용매극성별 Hexane층, Methylene chloride층, Ethyl acetate층, BuOH층을 분석하였다. PC12세포상에서 산화적 스트레스 회복능력을 측정하기 위하여 DCF-DA 활성검정을 수행하였으며 MeOH추출물 및 용매극성별 Hexane층, Methylene chloride층, Ethyl acetate층, BuOH층 모두에서 고루 항산화 활성결과를 얻었다. 각각 용매극성별 분획물의 항치매효과는 BuOH분획물에서 양호한 활성을 보였다. 버섯 추출물 처리를 통한 신경세포의 시간별 증식활성 세포관찰결과 추출물의 활성 증식을 확인하였다. 추출 세부분획물별 뇌신경보호효과 활성검정을 수행한 결과 세부분획물 HEM6에서 양성대조구(T300)보다 높은 활성을 보였다. 버섯유래 12종 단일성분의 뇌신경보호효과 검정결과 8종에서 양성대조구 tacrine 300 보다 높은 활성을 보였다.
3. 버섯유래 생리활성물질의 성분분리 및 구조분석 연구
버섯 용매추출물 및 극성별 분획물 제조를 위하여 노루궁뎅이버섯 1kg을 80% MeOH로 상온추출하여 각각의 용매극성별 Hexane, Methylene chloride , Ethyl acetate, BuOH층으로 분획물을 만들어 농축하였다. 각각의 분획물은 성분분리를 위하여 TLC등으로 물질분리 조건을 설정하였다. 성분분리 및 정제를 위하여 물질의 극성차이를 이용한 순상 컬럼크로마토그래피와 역상 컬럼크로마토그래피 방법을 사용하였으며 분자량별 물질분리를 위여 Sephadex LH-20을 사용하였으며, 분리물질의 정제는 HPLC, 분취용 HPLC를 사용하였다. 분리, 정제된 화합물의 분자구조분석을 위하여 1H NMR, 13CNMR, LC/MS, FT-IR 등 분광기기을 통하여 구조결정을 하였다.
노루궁뎅이버섯 추출물로부터 용매극성별 용매분획을 통하여 분획물을 제조하여 각종 컬럼크로마토그래피법과 HPLC, 분취용 HPLC를 사용하여 20개의 성분을 분리하였으며 분자구조를 결정하기 위하여 1차적으로 1H NMR, 13C NMR을 측정하였으며, 분자 구조내 작용기들의 정확한 위치를 확인하기 위하여 COSY, HMQC, HMBC 기법인 2D NMR을 측정하여 정확한 구조결정을 하였다. 결정된 분자구조는 헤리세논D, 헤리세논B, 헤리세논F 등 페놀릭 화합물과 스테롤의 일정인 에르고스테롤퍼록사이드가 구조분석되었다.
Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획
식용 및 야생버섯을 채집하여 추출물을 확보한 뒤, 기초적인 실험을 통해 아직 밝혀지지 않은 식용 및 야생버섯의 생리활성연구 및 신호전달기작 연구에 기초자료로 활용 예정이다. 노루궁뎅이버섯의 인지능력개선 효과 등 건강기능식품 기능성 소재 개발을 위해 인지기능개선 효과 구명 인체적용시험 및 지식재산권 확보가 예상된다. 버섯유래 유효성분, 지표성분의 체계화된 정보DB구축 및 후속연구 연계가능성 있다.
Abstract
▼
○ Title : Establishment of extract library for biologically active substance of mushroom and functional materialization
There are an estimated about 20,000 species of mushrooms in the world. Of these, approx. 2,0000 species is edible and around 1,500 species of them grow naturally in Korea. About
○ Title : Establishment of extract library for biologically active substance of mushroom and functional materialization
There are an estimated about 20,000 species of mushrooms in the world. Of these, approx. 2,0000 species is edible and around 1,500 species of them grow naturally in Korea. About 300 species of Korean natural mushroom could be classified as edible and medical purpose, but actual use is restricted to only 20 species. Mushrooms has been used for food ingredients since early times. Recently it is being used as a good pharmaceutical material or functional bio-material. In this study, we are trying to build a library by using extracts from the edible, medicinal and wild mushrooms. The physiological activities(antioxidant, anticancer and anti-inflammatory effects) were performed to investigate the effectiveness of mushrooms. Anti-oxidant effects analysis was followed by DPPH test. Especially Ganoderma lucidum, Phellinus and Inonotus are showed antioxidant effects highly. In this meaning, the study about chemical component separation and active component effect is necessary. In our result, we are selected Ganoderma lucidum strains ASI 7001, 7002, 7011 that highly growth inhibition rate in cancer cell lines(stomach, liver)by MTT assay. Also, Lactarius piperatus is good resource for anti-inflammatory effects.
For the purpose of evaluation for neuronal protective effects, mushroom extracts were divided four parts to hexane, methylene chloride, ethyl acetate, BuOH layer through polarity. Activity tests were conducted by antioxidative effects on PC12 cell line. To test for recovery of oxidative stress, DCF-DA assay was conducted and hexane, methylene chloride, ethyl acetate, BuOH layer showed good results. Anti-dimentia effects were conducted through AChE assay. HEM6, subfraction layer was showed good activity against postive control, Tacrine 300.
Chemical constituents of mushroom were isolated by column chromatography as TLC, HPLC, preparative HPLC. The chemical structure elucidations were conducted by NMR: 1H NMR, 13C NMR, COSY, HMBC, HMQC and LC/MS. The results of structure elucidation was identified as phenolic compound, ergosterol peroxide.
목차 Contents
- 표 지 ... 1
- 제 출 문 ... 2
- 요 약 문 ... 3
- S U M M A R Y ... 8
- 목 차 ... 9
- 제1장 서 론 ... 10
- 제1절 연구개발의 목적, 필요성 및 범위 ... 10
- 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 12
- 제1절 국내 기술개발현황 ... 12
- 제2절 국외 기술개발현황 ... 13
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 14
- 제1절 버섯자원의 추출물 라이브러리 구축 ... 14
- 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 26
- 제1절 목표대비 달성도 ... 26
- 제2절 정량적 성과 ... 27
- 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 28
- 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 28
- 제7장 중요 변동사항 ... 28
- 제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비현황 ... 28
- 제9장 참고문헌 ... 29
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