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문제 정의
- 본 연구는 구강세균으로 중요한 Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus salivariuse] 유당 대사에 대한 자일리톨의 영향을 보고자 시행하였다.
- 치아우식증 발생을 억제하려는 목적으로 자일리톨을 다량 섭취시 장관내 유당의 대사과정에 영향을 미칠 것이다. 동시에 구강세균으로 중요한 Streptococcus mutans.
제안 방법
- , USA)를 가하여 37P 배양기에서 24시간 배양한 후, 3, 000 rpm으로 20분간 원심하여 상청액을 얻었다. 10배로 희석한 상청액을 0.4% 포도당, 0.4% 갈락토오스, 0.4% 유당과 함께 실리카젤에서 1.5问씩 loading하였다. 실리카젤을 85% acetonitrile 용액에서 전개하고 0.
- 배양액의 흡광도(optical densi- tyX 분광광도계 (spectrophotometer, Hitachi, Tokyo, Japan) 660nm에서 측정하였으며 3번 실험을 반복하여 평균을 구하였다. 8시간과 24시간 배양한 세균배양액을 희석하여 M17 고체배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하고 37℃ 배양기에서 18시간배양한후 생균수를산정하였다.
- 배양액의 흡광도를 분광광도계 660nm에서 측정하였으며 3번 실험을 반복하여 평균을 구하였다. 8시간과 24시간 배양한 세균배양액을 희석하여 M17 고체배지에 접종하고 371 배양기 에서 18시간 배 양한 후 생균수를 산정하였다.
- 10분간 방치한 후, 3, 000 X rpm 로 10분간 원심하여 얻은 상청액을 분광광도계 420nm에서 흡광도를 측정하였다. ONPG와 PEP를 함유된 기질을 가한 세포상청 액으로 부터의 흡광도로부터 ONPG만 함유된 기질을 가한 세포 상청 액으로 부터의 흡광도를 뺀 수치를 lactose-PTS 활성도로 삼았다. Lactose-PTS 활성도는 Miller units로 표시하였는데 A420을 ZiT (min) X amount of sample XA600으로 나누어 1000을 곱한 값으로 하였다.
- Streptococcus mutansS] lactose-PTS 활성도에 미치는 자일리톨의 영향을 보기 위하여 tryptone yeast extract 액체배지에 0.2% 포도당을 첨가하고 0.2% 유당을 단독 또는 0.2% 자일리톨과 병합으로 첨가하였다. 배지 4ml에 2x107 Streptococcus mutans를 접종하여 37P 배양기에서 8시간 혐기 배양한 후, 배양액의 흡광도를 분광광도계 600 nm에서 즉정하였다.
- Streptococcus mutans의 유당 분해시 자일리톨 첨가 시의 영향을 보기 위하여 배양 액에 남아있는 유당의 양을 thin layer chromatography로 비교하였다. Tryptone yeast extract 액체배지에 4% 유당 단독 또는 4% 자일리톨과 병합하여 첨가하였다.
- Tryptone yeast extract 액체배지(1.7% tryptone, 0.3% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 0.25% potassium phosphate)에 1%, 2%, 4%, 8% 유당을 단독 또는 4% 자일리톨과 병합하여 첨가하였고, 0.2% 포도당을 첨가한 tryptone yeast extract 액체배지에 1%, 2%, 4%, 8% 자일리톨을 단독으로 첨가하였다. 배지 10ml에 2x10, Streptococcus mu~ tans를 접종하여 37t 배양기에서 2, 4, 6, 8시간의 단기간과 24시간의 장기간 배양하였다.
- Tryptone yeast extract 액체배지에 1%, 2%, 4%, 8% 유당을 단독 또는 4% 자일리톨과 병합하여 첨가하였다. 배지 10 ml에 2x10’ Streptococcus salivarius를 접종하여 37 ℃ 배양기에서 2, 4, 6, 8시간의 단기간과 24시간의 장기간 배양하여 위의 방법대로 배양액의 흡광도와 생균수를 산정하였다.
- chromatography로 비교하였다. Tryptone yeast extract 액체배지에 4% 유당 단독 또는 4% 자일리톨과 병합하여 첨가하였다. 배지 10 ml에 2x10’ Streptococcus mutans를 접종하여 37℃ 배양기에서 8시간과 24시간 배양한 후, 3, 000rpm 으로 20분간 원심하여 상청액을 얻었다.
- ^-galactosidase에 의한 유당 분해시 자일리톨의 영향을 보기 위하여 tryptone yeast extract 액체배지에 4% 유당 단독 또는 4% 자일리톨과 병합으로 첨가하였다. 배지 5ml에 60 units/ml /^-galactosidase(Sigma-Aldrich, St.
- 구강 중요 세균인 Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus salivariuse 유당분해에 대한 자일리톨의 작용을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 이러한 결과는 이탄당인 유당의 분해에 작용하는 F-galactosidase가 배양 초기 자일리톨에 의해 억제되어 세균의 증식이 억제되었다가, 분해된 유당에 의하여 일부 세균이 증식되어 /egalactosidase를 만들어 배양시간이 경과한 후 세균의 증식이 이루어진 것으로 사료된다. 물론 Streptococcus mutans내로 운반되어 인산화가 된 유당의 분해효소인 phosphor-galactosidase에 대한 영향을 보아야했지만 획득하기가 어려워 /egalactosidase에 대한 영향을 대신 보았다.
- 배지 10ml에 2x10, Streptococcus mu~ tans를 접종하여 37t 배양기에서 2, 4, 6, 8시간의 단기간과 24시간의 장기간 배양하였다. 배양액의 흡광도(optical densi- tyX 분광광도계 (spectrophotometer, Hitachi, Tokyo, Japan) 660nm에서 측정하였으며 3번 실험을 반복하여 평균을 구하였다. 8시간과 24시간 배양한 세균배양액을 희석하여 M17 고체배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하고 37℃ 배양기에서 18시간배양한후 생균수를산정하였다.
- 배지 10 ml에 2x10’ Streptococcus salivarius를 접종하여 37 ℃ 배양기에서 2, 4, 6, 8시간의 단기간과 24시간의 장기간 배양하여 위의 방법대로 배양액의 흡광도와 생균수를 산정하였다.
- 2% 포도당을 첨가한 tryptone yeast extract 액체배지에 1%, 2%, 4%, 8% 자일리톨을 단독으로 첨가하였다. 배지 10ml에 2x10, Streptococcus mu~ tans를 접종하여 37t 배양기에서 2, 4, 6, 8시간의 단기간과 24시간의 장기간 배양하였다. 배양액의 흡광도(optical densi- tyX 분광광도계 (spectrophotometer, Hitachi, Tokyo, Japan) 660nm에서 측정하였으며 3번 실험을 반복하여 평균을 구하였다.
- 첨가하였다. 배지 10ml에 2x10, Streptococcus oralis를 접종하여 37℃ 배양기에서 2, 4, 6, 8시간의 단기간과 24시간의 장기간 배양하였다. 배양액의 흡광도를 분광광도계 660nm에서 측정하였으며 3번 실험을 반복하여 평균을 구하였다.
- 배지 10 ml에 2x10’ Streptococcus mutans를 접종하여 37℃ 배양기에서 8시간과 24시간 배양한 후, 3, 000rpm 으로 20분간 원심하여 상청액을 얻었다. 이를 0.4% 포도당, 0.4% 갈락토오스, 0.4% 유당과 함께 실리카젤에서 1.5/4씩 loading하였다. 실리카젤을 85% acetonitrile 용액에서 전개하고 0.
- 전술한 tryptone yeast extract 액체배지에 1%, 2%, 4%, 8% 유당을 단독 또는 4% 자일리톨과 병합하여 첨가하였다. 배지 10ml에 2x10, Streptococcus oralis를 접종하여 37℃ 배양기에서 2, 4, 6, 8시간의 단기간과 24시간의 장기간 배양하였다.
대상 데이터
- Streptococcus mutans Ingbritt strain, Streptococcus orah's(ATCC 35037, Rockville, MA, USA), Streptococcus salivarius는 보관중인 것을 공시하였으며, 공시세균은 M17 액체배지(Difco, Detroit, MI, USA)에서 37℃, 18시간 배양하였다.
데이터처리
- 배지 10ml에 2x10, Streptococcus oralis를 접종하여 37℃ 배양기에서 2, 4, 6, 8시간의 단기간과 24시간의 장기간 배양하였다. 배양액의 흡광도를 분광광도계 660nm에서 측정하였으며 3번 실험을 반복하여 평균을 구하였다. 8시간과 24시간 배양한 세균배양액을 희석하여 M17 고체배지에 접종하고 371 배양기 에서 18시간 배 양한 후 생균수를 산정하였다.
성능/효과
- 2. 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에 Streptococcus oralis와 Streptococcus salivarius를 배 양하면 배 양액 흡광도가 배양 8시간에 증가하지 않다가 배양 24시간에 증가하였다.
- 3. 배지에 유당 단독으로 첨가할 때보다도 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에 Streptococcus m&ns를 8시간 배양하면 thin-layer chromatography상 남아있는 유당이 많았으나, 배양 24시간에는 모든 유당이 분해되었다.
- 4. 배지에 유당 단독으로 첨가할 때보다도 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에서 Streptococcus mu切ns의 lac- tose-PTS 활성도가 낮았다.
- 5. 배지에 유당 단독으로 첨가할 때보다도 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에 /^-galactosidase 작용시 thin-layer chromatographye 유당이 많았다.
- 배지에 유당과 자일리톨을 병합 첨가 시 배양 시간이 경과한 후 Streptococcus salivarius의 증식이 이루어진 것은 Streptococcus mutans와 Streptococcus ora lis에서와같이 Streptococcus salivarius의 증식에 사용되는 유당의 이용이 저해되었다가 배양시간이 경과함에 따라 Streptococcus salivarius가 유당을 이용한 것으로 생각된다. Streptococcus mutans 배양액을 thin layer chromatography한 결과, 유당 단독보다 유당과 자일리톨을 병합 첨가하여 8시간 배양할 때 유당 이용이 억제되어 배지에 남아있는 유당이 많았으나, 24시간 배양하면 유당을 첨가한 배지에서나 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에서 유당이 모두 분해되어 thin layer chro~ matography상 유당이 보이지 않았다.
- Streptococcus mutans의 유당 이용에 관한 자일리톨의 영향을 보기 위하여 유당의 세포 내 운반 및 인산화를 담당하는 lactose-PTS 활성도를 본 결과, 유당만 첨가할 때보다도 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에서 lactose-PTS 활성도가 낮았다. 유당을 분해하는 8-galactosidase에 대한 자일리톨의 영향을 보기 위하여 유당 첨가 배지와 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에 戸-galactosidase를 각각 작용시 thin layer chro- matography상 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에서 분해되지 않고 남아있는 유당이 많았다.
- 배지에 유당과 자일리톨을 병합 첨가하면 Streptococcus mutans와 Streptococcus ora万s에서와 같이 Streptococcus salivarius 배양액의 흡광도도 배양 8시간까지 증가하지 않다가, 배양 24시간에 증가하였다. Streptococcus salivarius의 배양액 생균수는 배양 24시간에 유당 단독시와 비교하여 유당과 자일리톨을 병합 첨가 시 유의하게 많았다. 배지에 유당과 자일리톨을 병합 첨가 시 배양 시간이 경과한 후 Streptococcus salivarius의 증식이 이루어진 것은 Streptococcus mutans와 Streptococcus ora lis에서와같이 Streptococcus salivarius의 증식에 사용되는 유당의 이용이 저해되었다가 배양시간이 경과함에 따라 Streptococcus salivarius가 유당을 이용한 것으로 생각된다.
- Tryptone yeast extract 액체배지에 유당만 첨가하였을 때 lactose-PTS 활성도는 5.99이었으나, 유당과 자일리톨을 병합 첨가하였을 때는 3.50으로 낮았다(Table 1).
- Tryptone yeast extract 액체배지에서 Streptococcus mu- tanse 8시간 배양할 때 , 4% 유당을 첨가한 경우(StL) 에 비교하여 4% 유당과 4% 자일리톨을 병합 첨가한 경우(StLX) 유당 이용이 억제되어 배지에 남아있는 유당이 많았다(Fig. 14). 배지에서 Streptococcus mutans를 24시간 배양할 때 4% 유당을 첨가한 경우(StL)나 4% 유당과 4% 자일리톨을 병합 첨가한 경우(StLX) 8시간 배양할 때와는 달리 thin layer chro- matography상 남아있는 유당이 없어 유당이 모두 분해되었음을 나타내었다 (Fig.
- 않다가 배양 24시간에 증가하였다. 배양 8시간에서의 생균수도 유당 단독보다 유당과 자일리톨 병합 첨가 시적게 나타났다.
- Streptococcus sali~ varius 배양시 유당의 농도에 관계없이 배양 8시간에 배양액의 흡광도가 높았다가 배양 24시간이 되면 약간 낮아졌는데 이는 증식이 빠르게 이루어지기 때문이다. 배지에 유당과 자일리톨을 병합 첨가하면 Streptococcus mutans와 Streptococcus ora万s에서와 같이 Streptococcus salivarius 배양액의 흡광도도 배양 8시간까지 증가하지 않다가, 배양 24시간에 증가하였다. Streptococcus salivarius의 배양액 생균수는 배양 24시간에 유당 단독시와 비교하여 유당과 자일리톨을 병합 첨가 시 유의하게 많았다.
- 14). 배지에서 Streptococcus mutans를 24시간 배양할 때 4% 유당을 첨가한 경우(StL)나 4% 유당과 4% 자일리톨을 병합 첨가한 경우(StLX) 8시간 배양할 때와는 달리 thin layer chro- matography상 남아있는 유당이 없어 유당이 모두 분해되었음을 나타내었다 (Fig. 15).
- 본 연구에서는 배지에 Streptococcus mutans를 배양할 때 유당의 농도에 관계없이 배양시간이 경과함에 따라 배양액의 흡광도가 증가하였으나, 자일리톨을 첨가할 때는 그 농도가 높아짐에 따라 배양액의 흡광도가 감소하였다. 배지에 유당과 자일리톨을 병합 첨가하면 Streptococcus mutans 배양액의 흡광도와 생균수가 배양 8시간까지 증가하지 않다가 배 양 24시간에 배양액의 흡광도가 증가하였다.
- 852가 되었다. 여기에 1% 자일리톨 첨가 시 배양 24시간에 배양액의 흡광도는 0.642로 감소되었고 자일리톨의 농도가 높아짐에 따라 배양액의 흡광도는 더욱 감소되어 2% 자일리톨 첨가 시 0.604, 4% 자일리톨 첨가시 0.536, 8% 자일리톨 첨가 시 0.435로 각각 나타났다(Fig. 2). 유당과 4% 자일리톨을 병합 첨가한 tryptone yeast extract 액체배지에 Streptococcus mutans를 배양하면 배양 8 시간의 배양액 흡광도는 유당 1% 첨가 시 0.
- 유당을 분해하는 8-galactosidase에 대한 자일리톨의 영향을 보기 위하여 유당 첨가 배지와 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에 戸-galactosidase를 각각 작용시 thin layer chro- matography상 유당과 자일리톨을 병합 첨가한 배지에서 분해되지 않고 남아있는 유당이 많았다. 이러한 결과는 이탄당인 유당의 분해에 작용하는 F-galactosidase가 배양 초기 자일리톨에 의해 억제되어 세균의 증식이 억제되었다가, 분해된 유당에 의하여 일부 세균이 증식되어 /egalactosidase를 만들어 배양시간이 경과한 후 세균의 증식이 이루어진 것으로 사료된다. 물론 Streptococcus mutans내로 운반되어 인산화가 된 유당의 분해효소인 phosphor-galactosidase에 대한 영향을 보아야했지만 획득하기가 어려워 /egalactosidase에 대한 영향을 대신 보았다.
- 이상의 결과는 자일리톨이 Streptococcus의 유당 이용을 억제함을 시사하였다.
후속연구
- 앞으로 Streptococcus mutans의 세균의 증식과 대사에 관련된 다른 효소에 대한 자일리톨 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
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