Lactobacillus reuteri는 혐기적 조건에서 글리세롤을 대사하여 강력한 항균물질인 루테린을 생산한다. 본 연구의 목적은 다양한 조건에서 루테린의 생산성을 비교 연구하는 것이었다. 회분식 배양에서 $32,\;37,\;42^{\circ}C$에서 비교하였을 때 온도가 높을 수록 시간당 생산되는 량은 많았고 생산이 더 빠른 시간내에 둔화되었으며 생산되는 총량이 더 많았다. 다양한 아미노산을 첨가한 상황에서 생산된 루테린 활성을 조사하였을 때 proline을 제외하고 대부분의 아미노산은 루테린 활성을 저하시켰다. 생산된 루테린은 다양한 식중독균의 사멸을 유도하였다. 생산성을 증가시키기 위하여 L. reuteri 세포를 반응기에 현탁시키고 글리세롤 용액을 연속적으로 통과시켰다. 회분식에 비교하여 연속식 공정으로 루테린 생산성은 현저히 증가하였다.
Lactobacillus reuteri는 혐기적 조건에서 글리세롤을 대사하여 강력한 항균물질인 루테린을 생산한다. 본 연구의 목적은 다양한 조건에서 루테린의 생산성을 비교 연구하는 것이었다. 회분식 배양에서 $32,\;37,\;42^{\circ}C$에서 비교하였을 때 온도가 높을 수록 시간당 생산되는 량은 많았고 생산이 더 빠른 시간내에 둔화되었으며 생산되는 총량이 더 많았다. 다양한 아미노산을 첨가한 상황에서 생산된 루테린 활성을 조사하였을 때 proline을 제외하고 대부분의 아미노산은 루테린 활성을 저하시켰다. 생산된 루테린은 다양한 식중독균의 사멸을 유도하였다. 생산성을 증가시키기 위하여 L. reuteri 세포를 반응기에 현탁시키고 글리세롤 용액을 연속적으로 통과시켰다. 회분식에 비교하여 연속식 공정으로 루테린 생산성은 현저히 증가하였다.
Reuterin production efficiency of Lactobacillus reuteri, which converts glycerol into reuterin (antimicrobial substance) under anaerobic condition, was examined. When compared at $32,\;37,\;and\;42^{\circ}C$, production rate and total amount produced increased with increasing incubation t...
Reuterin production efficiency of Lactobacillus reuteri, which converts glycerol into reuterin (antimicrobial substance) under anaerobic condition, was examined. When compared at $32,\;37,\;and\;42^{\circ}C$, production rate and total amount produced increased with increasing incubation temperature. Reuterin production terminated earlier at $42^{\circ}C$ than at $32\;and\;37^{\circ}C$. Presence of various amino acids in the reaction mixture generally decreased reuterin production, whereas proline did not inhibit reuterin production. A continuous-type reactor in which glycerol was passed through the chamber containing L. reuteri cells produced greater amount of reuterin than when batch-type process was used.
Reuterin production efficiency of Lactobacillus reuteri, which converts glycerol into reuterin (antimicrobial substance) under anaerobic condition, was examined. When compared at $32,\;37,\;and\;42^{\circ}C$, production rate and total amount produced increased with increasing incubation temperature. Reuterin production terminated earlier at $42^{\circ}C$ than at $32\;and\;37^{\circ}C$. Presence of various amino acids in the reaction mixture generally decreased reuterin production, whereas proline did not inhibit reuterin production. A continuous-type reactor in which glycerol was passed through the chamber containing L. reuteri cells produced greater amount of reuterin than when batch-type process was used.
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제안 방법
37% HCl 150 μL를 혼합하여 37℃ 배양기에서 20분간 반응시켰다. 그 후, EL1SA reader를 이용히여 570nm에서 반응액의 absorbance를 측정하였다. 필요에 따라 시료를 증류수를 사용하여 희석하여 실험하였다.
본 실험에서는 루테린 생산에 대한 온도의 영향을 조사하였으며 각 시간별로 새로운 글리세롤 용액으로 대치하여 시간에 따른 추가적인 루테린 생산성을 조사하였다(Fig. 2). 서로 다른 3가지의 온도에서 실험한 결과.
본 실험에서는 몇 종류의 아미노산 첨가가 루테린 생성 반응에 미치는 엉향을 조사하였다(Fig. 3). Glutamine을 함유한 시료의 경우 항균효과는 대조구와 비교하여 약 50% 정도 감소한 것으로 나타났고 arginine과 glycine의 경우에는 상성된 루테린의 활성이 매우 미약하였다.
또한 생산 균주의 안정화에 대한 연구도 필요할 것이다. 본 연구에서는 루테린의 β-HRA의 monomeric, hydrated monomeric and cyclic dimeric form의 3가지 형태에 대한 자세한 분석은 이루어지지 않았다. 회분식과 연속식 또는 기타의 각기 다른 반응에서 생산되는 루테린의 형태별 비율이 상이할 가능성이 있고 이 또한 루테린 항균활성의 극대화 연구를 위한 추가 연구에서 분석되면 좋을 것이다.
생산된 루테린을 이용하여 다양한 균들에 대한 항균력을 조사하였다. 항균력은 10AU의 루테린을 함유하는 각각의 배지 (재료 및 방법)에 E.
본 배양시에는 MRS broth에 집종하여 계대 배양한 배양액을 3% 접종하였고 37℃ 배양기에서 15-18 시간동안 혐기적인 상태로 배양하였다. 세포의 증식정도는 상법에 의하여 spectrophotometer(O.D. 600nm)에서 탁도를 측정하거나 건조 균체량 측정을 위하여 4,000×g에서 원심 분리하여 수세한 세포 pellet을 건조하여 함량를 구하였다. 루테린의 항균성을 실험하기 위한 지시균 배양을 위하여 Escherichia coli KI2, Salmonella typhimurium.
5로 누 번 수세하고 1시간 starvation time을 주었다. 수세된 세포는 배양액 부피의 5%에 해당하는 250 mM 글리세롤 용액에 재현탁하여 37℃ 배양기에서 혐기적으로 유지하며 일정 시간별로 시료를 채취하였다. 반응 시료는 8.
β-HPA) 함량의 분석법은 Luthi-Peng 등의 분석법에 준하였고 acrolein을 표준물질로 사용하였다(13). 실험을 위하여 0.05 N HCl 용매에 tryptophan(Trp)를 넣어 최종 10mM의 Trp-HCF용매를 만들었다. 다음은 10mM Trp-HCl 용매를 38μL.
루테린의 상대적 활성은 MIC까지 도달할 때의 회석배수를 AU(activity unit) 단위로 나타내었다. 아미노산 존재하에서의 루테린 생산 실험에서는 각 아미노산을 50mM과 100mM을 cell-glyccrol 현타용액에 넣었고 대조구는 아미노산을 넣지 않았다. 모든 시료는 루테린을 생성하도록 37℃ 배양기에서 24시간 보존하였다.
22 ㎛여과기를 사용하여 여과한 후에 분석에 이용하였다. 온도별 루테린 생산 실험에서는 1시간 단위로 반응액을 회수하고 다시 농량의 글리세롤 용액을 가하여 실험하였다.
45 ㎛의 이과막이 중산에 장착되어 있으며 상층과 하층으로 구획되어 있는 것을 이용하였다. 준비한 세포 현탁액을 상층에 넣고 magnetic bar를 돌리면 일정속도로 세포가 포함되지 않은 반응액이 믿으로 떨어시게 되고 하층의 반응액은 tube를 통해 collector 모으는 방식으로 실험을 설계하였다. 여과기에서 떨어지는 반응액의 속도는 하충 반응액의 유입, 유출압이 맞게되면 일성 속도로 전체적 용매의 흐름이 유지되었다.
그 후, EL1SA reader를 이용히여 570nm에서 반응액의 absorbance를 측정하였다. 필요에 따라 시료를 증류수를 사용하여 희석하여 실험하였다.
4℃에서 10분 간 원심분리하여 사용하였다. 항균성은 각 지시균의 성장 저해정도를 흡광도 또는 MIC(minimal inhibition concentration assays) 검사를 수행하여 관찰하였다. MIC는 연속된 2-fold 희석식 방법을 사용하여 지시균의 성장을 확인 할 수 없을 때까지의 최소 루테린의 함량이라고 정의하였다(12).
필요하였다. 따라서 본 실험에서는 루테리 균의 세포를 보유하기 위한 반응소 설계를 위하어 Nalgene disposable filterware(115 mL)를 사용하였는데 이 제품의 경우 0.45 ㎛의 이과막이 중산에 장착되어 있으며 상층과 하층으로 구획되어 있는 것을 이용하였다. 준비한 세포 현탁액을 상층에 넣고 magnetic bar를 돌리면 일정속도로 세포가 포함되지 않은 반응액이 믿으로 떨어시게 되고 하층의 반응액은 tube를 통해 collector 모으는 방식으로 실험을 설계하였다.
본 실험에 사용된 균주는 ATCC에서 구입한 L truteri ATCC 53608 균주를 사용하였디-. 본 배양시에는 MRS broth에 집종하여 계대 배양한 배양액을 3% 접종하였고 37℃ 배양기에서 15-18 시간동안 혐기적인 상태로 배양하였다.
이론/모형
루테린(β-hydroxypropionaklehyde. β-HPA) 함량의 분석법은 Luthi-Peng 등의 분석법에 준하였고 acrolein을 표준물질로 사용하였다(13). 실험을 위하여 0.
본 실험에서는 루테린 생산법으로 two-step fennentation process-homologous method를 사용하였다(5). MRS broth에서 15-18 시간 배양된 L.
성능/효과
aureus, L monocytogenes. P. aaies을 접종하여 10시간 동안 배양하여 탁도를 조사하였으나 모든 균주에서 성장이 전혀 관찰되지 않았고 또한 디스크법에 의한 검사에서도 모두 항균환을 나타내었다(자료 제시 않음). 루테린 존재하에서 생존하는 균수를 조사하기 위하여 E.
이와 같은 proline의 분자 특성이 루테린의 활성에 영향을 나타내었을 것으로 추정된다. 본 실험의 결과는 루테린을 식품에 적용할 경우 식품내에 존재하는 아니노산의 종류에 따라 루테린 활성이 달리 나타날 수 있음을 시사한다.
이 때까지 루테린 생산농도가 대부분 20mM 이상으로 유지되어 37℃ 회 분식 배양의 약 5mM 농도에 비하여 4배 정도의 농도로 생산되는 것으로 나타났다. 사용된 균주의 현탁 농도도 회분식이 연속식에 비하여 2배에 해당하는 것을 고려하면 실제는 회분식에 비하여 연속식은 생산되는 루테린의 양을 현저히 증가시키는 것으로 조사되었다. 이는 회분식에 비하여 연속식에서는 생산되는 루테린이 정치되어 있는 시간을 현저히 줄여주어 루테린에 의한 생산균의 활성 저하를 감소시켜준 효과에 기인한 것으로 생각된다.
4에 나타내었다. 연속식 공정에서 수집된 각 분획시료는 1/2 희석된 시료를 이용하여 항균능력을 측정한 결과, 약 3시간 40분, 즉 fraction collector의 11번째 tube까지 수집된 시료가 E. coli K12 의 증식을 효과적으로 억제시키는 것으로 나타났다. 이 때까지 루테린 생산농도가 대부분 20mM 이상으로 유지되어 37℃ 회 분식 배양의 약 5mM 농도에 비하여 4배 정도의 농도로 생산되는 것으로 나타났다.
연속식 공정을 이용한 루테린 생산을 시도한 이유는 다음과 같다. 첫째, 생산된 루테린이 계속 반응기내에 머불러 있을 경우 L reuteri 또한 항균작용의 영항을 받게되므로 계속적인 항균물질의 생산과 균의 활력을 꾸준히 유지하기 위해서는 루테린을 포함하는 용액을 계속 새로운 용액으로 교체하는 것이 필요할 것으로 생각하였다. 두 번째로는 연속식 생산 공정을 통하여 일정한 반응 조건에서 루테린이 생산되므로 루테린 생산의 패턴을 보다 효과적으로 분석할 수 있는 장점이 있기 때문 이었다.
후속연구
따라서 루테린의 인체 안전성에 대한 보다 면밀한 검토가 요구된다. In vitro에서 mouse 유래의 3T3 fibroblasts 세포주로 MTT 분석을 한 결과, 루테린의 MTLo은 19.5 ppm으로 보통의 세포고정액으로 사용하는 glutaraldehyde의 4.5 ppm과 비교하여 약한 세포 독성을 나타내고 있으나 식품 또는 장관내에 존재하는 루테린의 양이 인체의 안전에 어떠한 영향을 미치는 가에 대한 추가 연구도 필요할 것이다. 그 동안의 루테린 생산은 주로 글리세롤의 영향에 대한 연구가 주로 이루어졌을 뿐 루테린의 생산에 대한 다양한 환경적 인자 및 생산 방법에 대한 연구는 아직 미비하다고 할 수 있다.
42℃에서는 4시간까지 시간 당 거의 20mM 정도의 루테린이 생성되는 것으로 조사되었으며 다른 온도 조건에 비해서 단 시간 안에 많은 양의 루테린이 생산되는 것으로 나타났다. 그러나 4시간 이후에는 생산성이 급격히 저하되는 것으로 나타났는데 이것은 효소의 불활성화에 의한 것인지 또는 반옹에 관련되는 비타민 B12 등의 조효소 또는 다른 관련 인자의 소실에 의한 것인지는 추가적으로 조사하는 것이 흥미로울 것이다. 다른 하나의 관련 요인은 생산 세포의 활성과노 관련이 있을 것이다.
그 동안의 루테린 생산은 주로 글리세롤의 영향에 대한 연구가 주로 이루어졌을 뿐 루테린의 생산에 대한 다양한 환경적 인자 및 생산 방법에 대한 연구는 아직 미비하다고 할 수 있다. 따라서 본 연구의 루테린 생산에 대한 배양적 및 환경적 검토와 항균 스펙트럼에 대한 추가적 분석은 루테린의 산업적 활용 및 안전성 검사에 기초자료를 제공할 것이다.
루테린의 생산성을 보다 더 증진시키기 위하여는 생산되는 루테린을 생산균주로부터 보다 효과적으로 격리시키는 방법을 고안하는 것이 추후 필요할 것이다. 또한 생산 균주의 안정화에 대한 연구도 필요할 것이다. 본 연구에서는 루테린의 β-HRA의 monomeric, hydrated monomeric and cyclic dimeric form의 3가지 형태에 대한 자세한 분석은 이루어지지 않았다.
이는 회분식에 비하여 연속식에서는 생산되는 루테린이 정치되어 있는 시간을 현저히 줄여주어 루테린에 의한 생산균의 활성 저하를 감소시켜준 효과에 기인한 것으로 생각된다. 루테린의 생산성을 보다 더 증진시키기 위하여는 생산되는 루테린을 생산균주로부터 보다 효과적으로 격리시키는 방법을 고안하는 것이 추후 필요할 것이다. 또한 생산 균주의 안정화에 대한 연구도 필요할 것이다.
본 연구에서는 루테린의 β-HRA의 monomeric, hydrated monomeric and cyclic dimeric form의 3가지 형태에 대한 자세한 분석은 이루어지지 않았다. 회분식과 연속식 또는 기타의 각기 다른 반응에서 생산되는 루테린의 형태별 비율이 상이할 가능성이 있고 이 또한 루테린 항균활성의 극대화 연구를 위한 추가 연구에서 분석되면 좋을 것이다.
참고문헌 (13)
Cleveland J, Montville TJ, Nes IF, Chikindas ML. Bacteriocins: Safe, natural antimicrobials for food preservation. Int. J. Food. Microbiol. 71: 1-20 (2001)
Ahn C, Kim CH, Shin HK, Lee YM, Lee YS, Ji GE. Antibiosis of pediocin-producing Pediococcus sp. KCA1303-10 against Listeria monocytogenes in mixed cultures. J. Microbiol. Biotechnol. 13: 429-436 (2003)
Talarico TL, Dobrogosz WJ. Chemical characterization of an antimicrobial substance produced by Lactobacillus reuteri. Antimicrob. Agents Chemother. 33: 674-679 (1989)
Dobrogosz WJ, Lindgren SE. Method of determining the presence of an antibiotic produced by Lactobacillus reuteri. US patent. 5,352,586 (1994)
Ganzle MG, Holtzel A, Walter J, Jung G, Hammes WP. Characterization of reutericyclin produced by Lactobacillus reuteri LTH2584. Appl. Environ. Microbiol. 66: 4325-4333 (2000)
El-Ziney MG, Debevere JM. The effect of reuterin on Listeria monocytogenes and Escherichia coli 0157:H7 in milk and cottage cheese. J. Food Prot. 61: 1275-1280 (1998)
Daeschel MA. Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives. Food Technol. 4: 164-167 (1989)
Speck ML, Dobrogosz WJ, Casas I. Lactobacillus reuteri in food supplementation. Food Technol. 7: 90-94 (1993)
Chen CC, Chen JY, Lee SR. Growth inhibition of glycerol metabolites of Lactobacillus reuteri on microorganisms and human cancer cell lines. J. Chin. Agric. Chem. Soc. 37: 117-125 (1999)
Chen CN, Sung HW, Liang HF, Chang WH. Feasibility study using a natural compound (reuterin) produced by Lactobacillus reuteri in sterilizing and crosslinking biological tissues. J. Biomed. Mater. Res. 61: 360-369 (2002)
Luthi-Peng Q, Scharer S, Puhan Z. Production and stability of 3-hydroxypropionaldehyde in Lactobacillus reuteri. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 73-80 (2002)
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