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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 제초제 저항성 콩에 형질 전환된 단백질 CP4EPSPS를 검출대상으로 제초제 저항성 콩의 존재 여부를 판단하기 위한 immunoblotting을 시행하였다. 이를 위해 CP4EPSPS를 면역원으로 하여 다클론 항체와 단클론 항체를 생산하였고, 확립된 조건에서 콩 가공 식품 중 두부를 대상으로 CP4EPSPS 단백질의 함유 여부를 검사하였다.
제안 방법
- 미국 몬산토사에서는 Agmbacterium sp. CP4 유래 epsps 유전자(cp4epsps)를 재조합하여 glyphosate 에 대해 저항성을 갖는 여러가지 작물들을 개발하였다(6-8).
- 판단하기 위한 immunoblotting을 시행하였다. 이를 위해 CP4EPSPS를 면역원으로 하여 다클론 항체와 단클론 항체를 생산하였고, 확립된 조건에서 콩 가공 식품 중 두부를 대상으로 CP4EPSPS 단백질의 함유 여부를 검사하였다.
- 간략하면, 탈지된 콩가루는 1:10으로 증류수와 섞어 실온에서 배양 후 10, 000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액은 0.5 N HCI을 이용하여 pH 4.6으로 조절 후 다시 10, 000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 whey fiaction(상층액)과 globulin fraction(침전물)로 분리하였고 각각을 2차 증류수로 투석하였다.
- 생산하였다. 간략하면, 유전자재조합 대두로부터 PCR 과정을 통해 CP4EPSPS 유전자를 cloning하였으며 E. coli에서 발현하였다. 발현된 단백질은 DEAE 크로마토그램을 이용하여 E.
- coli에서 발현하였다. 발현된 단백질은 DEAE 크로마토그램을 이용하여 E. coli 단백질과 분리하였다. 분리된 단백질은 다음 실험 이용 때까지 -20℃에 냉동보관하였다.
- 간략하면, CP4EPSPS# PBS에 1 mg/mLS. 희석하고 Freund's complete adjuvant와 함께 1:1로 유탁액을 만들어 생후 7주 가량 된 생쥐에 100μL씩 복강주사를 2주 간격으로 3회 면역하고 최종적으로 adjuvant 없이 정맥주사하였다. 정맥주사 2일 후에 비장을 적출하고 이를 잘게 부수어 단세포화 한 후 골수종 세포(myeloma cell)와 융합하였다.
- 희석하고 Freund's complete adjuvant와 함께 1:1로 유탁액을 만들어 생후 7주 가량 된 생쥐에 100μL씩 복강주사를 2주 간격으로 3회 면역하고 최종적으로 adjuvant 없이 정맥주사하였다. 정맥주사 2일 후에 비장을 적출하고 이를 잘게 부수어 단세포화 한 후 골수종 세포(myeloma cell)와 융합하였다. 96 well plate에서 융합세포를 분리한 후 CP4EPSPS에 대한 반응성이 양호한 융합세포의 상징액에서 비경합 간접 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)법에 의해 CP4EPSPS에 반응성이양호한 5개의 클론을 선발하였다.
- 96 well plate에서 융합세포를 분리한 후 CP4EPSPS에 대한 반응성이 양호한 융합세포의 상징액에서 비경합 간접 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)법에 의해 CP4EPSPS에 반응성이양호한 5개의 클론을 선발하였다. 이들 융합세포를 생후 6-8주된 생쥐의 복강에 pristane을 0.5-1 mL 주사하고 10일 후 생쥐복강에 마리당 107 가량의 융합세포주를 각각 주입하였다. 2주 후 각 마리당 10mL 가량의 복수액을 채취하고 l,500×g에서 15분 동안 원심분리하여 단클론 항체를 생산하였다.
- 항혈청 중의 특이항체를 제조자의 방법에 따라 Protein Acolumn(ImmunoPure plus IgG Purification Kit, #44679)을 이용하여 정제한 후 Sephadex G-25 column으로 탈염하였다. 정제된 항체를 pool한 후 NaN3를 최종농도가 0.
- 5%의 stacking gel을 중합시켰다. 준비된 gele 전기 영동 bufier(25 mM Tris, 192mM glycine, 0.1% SDS)가 들어있는 전기영동조에 설치하고, sample buffer(60niM Tris/HCl(pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromphenol blue)와시료를 1 :5로 혼합 후 100℃에서 5분 동안 중탕 가열하여 시료로 사용하였다. 전기영동은 우선 100볼트에서 10분 동안 시행하여 시료가 stacking gel에 진입한 후 200볼트에서 35분 정도 추가로 전기영동하였다.
- 단백질이 전사된 NC membranee 항혈청과의 반응성 조사에 앞서 block 버퍼 (PBS, 0.3% Tween 20)와 실온에서 1시간 반웅시켜 비특이적 반응부위를 차단하였다, NC membranee 약 5 mm의 넓이로 잘라 Bio-Rad(Hercules, CA, USA)사의 mini incubation tray에 넣고 희석된 1차 항체(항CP4EPSPS 단클론 항체 1 : 2000배 희석, 항CP4EPSPS 다클론 항체 1 : 1000)4 각기 600 μL씩 하룻밤 실온에서 반응시켰다. 수세 완충액(PBS, 0.
- 3% Tween 20)와 실온에서 1시간 반웅시켜 비특이적 반응부위를 차단하였다, NC membranee 약 5 mm의 넓이로 잘라 Bio-Rad(Hercules, CA, USA)사의 mini incubation tray에 넣고 희석된 1차 항체(항CP4EPSPS 단클론 항체 1 : 2000배 희석, 항CP4EPSPS 다클론 항체 1 : 1000)4 각기 600 μL씩 하룻밤 실온에서 반응시켰다. 수세 완충액(PBS, 0.05% Tween 20)으로 3회 세척 후 희석된 2차 항체(anti-rabbit-IgG-Biotin 1 :6000 또는 anti-mouse-IgG-Biotin 1 : 2500) 600 μL와실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 수세 완충액으로 3회 세척하고 alkaline phosphatase conjugated streptavidin 회석액(1:3000)600 μL와 실온에서 30분 반응시켰다.
- E. coli 단백질 발현 시스템에서 발현하여 정제한 CP4EPSPS 단백질과 이 단백질을 이용하여 생산한 항CP4EPSPS 단 클론 및 다클론 항체와의 반응성을 조사하였다. 전기영동 분리 후 NC membrane에 전사된 CP4EPSPS 재조합 단백질은 Coomassie염색 후 0.
- Bradford법(22)에 의해 정량하였다. 콩 단백질을 최고 10.79 μg에서 최저 0.06 μg의 농도까지 순차적으로 희석 후 전기영동으로 분리한 단백질을 NC membrane에 전사한 후 Coomassie 염색을 통한 전체 단백질의 검사와, 단클론 및 다클론 항체와의 반응성을 각각 조사하였다(Fig. 3). 전기영동 후 Coomassie 염색된 콩의 단백질은 대략 80, 55, 48, 30, 20 kDa 부위에서 비교적 두꺼운 밴드로 나타났고 이들 단백질 밴드들은 0.
- 구입된 8종의 두부에는 포장에 재료로 쓰인 콩의 원산지와 양이 백분율로 표기되어 있었고, 한 샘플은 표기되어 있지 않았다. 9종의 두부 샘플은 상대적으로 민감도가 높은 항CP4EPSPS 다클론 항체를 이용하여 조사되었으며, 이와 병행하여 삽입 유전자를 검증하는 PCR 방법으로 유전자재조합 콩의 사용 여부를 검사하였다. 샘플 두부포장에 표기된 콩의 원산지와 CP4EPSPS 단백질 조사 결과가 Table 1에 요약되었다.
대상 데이터
- 0-5% 제초제 저항성 콩이 포함된 유전자재조합 콩 표준시료는 상용화된 시료를 Fluka(Switzerland)에서 구입하여 사용하였다. 조사된 두부 시료는 서울에 있는 슈퍼마켓에서 구입하여사용하였고 상용 분석 스트립 kit(TraitChek RUR Bulk Soybean Grain Test Kit, Strategic Diagnostics Inc.
- 조사된 두부 시료는 서울에 있는 슈퍼마켓에서 구입하여사용하였고 상용 분석 스트립 kit(TraitChek RUR Bulk Soybean Grain Test Kit, Strategic Diagnostics Inc. USA)를 이용하여 유전자재조합 콩의 포함여부가 확인되었으며, 아울러 본 연구소에서 확립된 PCR법에 의해 삽입 유전자의 유무가 확인되었다.
- 면역 1주일 후에 토끼 귀 정맥에서 채혈한 후 항혈청을 분리하였다. 항체가가 가장 높은 항혈청을 1mL씩 분주하여 NaN3를 최종농도가 0.02%가 되게 첨가하여 -70℃에 보관하여 다음실험에 사용하였다.
- 정맥주사 2일 후에 비장을 적출하고 이를 잘게 부수어 단세포화 한 후 골수종 세포(myeloma cell)와 융합하였다. 96 well plate에서 융합세포를 분리한 후 CP4EPSPS에 대한 반응성이 양호한 융합세포의 상징액에서 비경합 간접 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)법에 의해 CP4EPSPS에 반응성이양호한 5개의 클론을 선발하였다. 이들 융합세포를 생후 6-8주된 생쥐의 복강에 pristane을 0.
- 전기영동은 우선 100볼트에서 10분 동안 시행하여 시료가 stacking gel에 진입한 후 200볼트에서 35분 정도 추가로 전기영동하였다. 전기영동 후 gele 단백질 확인을 위해Coomassie 용액(lg Ccwmassie Blue R-250, 450 mL methanol, 450 mL H2O, 100 mL glacial acetic acid)으로 착색하거나 nitro-ceUulose(NC) membrane으로 단백질을 전사하는데 사용하였다.
- 콩 가공 식품 중 우리나라 국민에 의해 다량 소비되고 있는 두부에 유전자재조합 콩의 함유 여부를 검사하기 위해 시중 슈퍼마켓에서 9종의 두부를 구입하였다. 구입된 8종의 두부에는 포장에 재료로 쓰인 콩의 원산지와 양이 백분율로 표기되어 있었고, 한 샘플은 표기되어 있지 않았다.
이론/모형
- 콩과 표준화된 콩가루에서의 단백질 추출은 Awazuhara 둥(20)의 방법에 따라 진행되었다. 간략하면, 탈지된 콩가루는 1:10으로 증류수와 섞어 실온에서 배양 후 10, 000rpm에서 30분간 원심분리하였다.
- CP4EPSPS의 생산은 손 등(21)의 방법에 의해 생산하였다. 간략하면, 유전자재조합 대두로부터 PCR 과정을 통해 CP4EPSPS 유전자를 cloning하였으며 E.
- Bradford법(22)에 의해 단백질을 정량하였고, 시약은 상업적으로 시판되는 Bio-Rad(Hercules, CA, USA)사의 단백질정량 kit를 사용하여 시행하였다.
- 항 CP4EPSPS 다클론 항체의 생성은 곽 등(13)의 방법에 의해 생성되었다. 간략하면, 앞서 정제한 denaturate 상태의 CP4EPSPS 단백질을 PBS에 1 mg/mL로 희석한 다음 Freund's complete adjuvant(Sigma사", St.
- 단백질 전기영동은 Laemmli 방법(24)에 준하여 단백질을 환원 변성시킨 조건에서 실시하였다. 13%의 separation gel을 미리설치된 전기영동용 glass plate에서 중합시킨 후 그 위에 4.
- 본 연구에서는 콩에 포함되어 있는 globulin과 whey fraction 단백질의 분리를 위해 Awazuhara 등(20)이 시행한 빙법에 따라 단백질을 추출하고, 13% SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리 후 Coomassie법을 이용하여 염색 후 비교하였다(Fig. 1, lane 3-6). 일부 시료는 별도의 단백질 추출과정 없이 분말화시킨 후 SDS-PAGE 샘플 buffer와 섞고 가열 후 SDS-PAGE gel 상에서 분리되었다(Fig.
- 제초제 내성 유전자재조합 콩에 소량 발현되어 존재하는 CP4EPSPS 단백질을 검출하기 우〕해, 상용화된 스트립 검사 kit을 이용하여 CP4EPSPS 단백질의 존재가 확인된 제초제 내성유전자재조합 콩에서 단백질을 추출하고 포함된 총 단백질 양을 Bradford법(22)에 의해 정량하였다. 콩 단백질을 최고 10.
성능/효과
- 1에서 보듯이 Awazuhara등(20)의 방법에 의해 추출된 단백질들은 그 양상의 차이가 있었으나 일부 단백질은 양쪽에 공통적으로 나타남으로써 whey와 globulin fraction의 완벽한 분리는 이루어지지 않았음을 알수 있었다. Whey fraction(Fig. 1, lane 5, 6)에는 globulin frac-tion(Fig. 1, lane 3, 4)에서 나타나는 단백질 밴드 외에 대략 20kDa과 75 kDa 크기의 추가 단백질 밴드가 확인되었는데 이들두 단백질이 Awazuhara 둥(24)의 연구결과에서 나타난 whey fraction 단백질과 그 크기가 잘 일치됨을 확인할 수 있었다. 반면 시료 전체를 샘플 버퍼와 직접 섞고 가열하여 분리한 샘플(Fig.
- 1, lane 3, 4)에서 나타나는 단백질 밴드 외에 대략 20kDa과 75 kDa 크기의 추가 단백질 밴드가 확인되었는데 이들두 단백질이 Awazuhara 둥(24)의 연구결과에서 나타난 whey fraction 단백질과 그 크기가 잘 일치됨을 확인할 수 있었다. 반면 시료 전체를 샘플 버퍼와 직접 섞고 가열하여 분리한 샘플(Fig. 1, lane 1, 2)에서는 globulin과 whey fraction0] 혼합된 단백질 밴드 형태를 확인할 수 있었다.
- 2, B). 단클론 항체와의 반응성 조사 결과와 마찬가지로 다클론 항체와의 반응성 조사에서도 분리된 CP4EPSPS 단백질의 농도가 낮아질수록 항원-항체 반응으로 나타나는 단백질 밴드의 세기가 감소하였으며, 다클론 항체에 의해 반응성을 확인할 수 있는 CP4EPSPS 단백질 농도의 한계치가 0.0006μg임을 확인하였다(Fig. 2, C). 본 연구에서 제작, 사용된 항 CP4EPSPS 다클론 항체가 항 CP4EPSPS 단클론 항체보다 10배 정도 높은 민감도를 갖고 있음을 확인할 수 있었으며, 이는 동일한 항체를 이용한 sandwich ELISA 검사법에서 CP4EPSPS 단백질의 검출한계가 0.
- 2, C). 본 연구에서 제작, 사용된 항 CP4EPSPS 다클론 항체가 항 CP4EPSPS 단클론 항체보다 10배 정도 높은 민감도를 갖고 있음을 확인할 수 있었으며, 이는 동일한 항체를 이용한 sandwich ELISA 검사법에서 CP4EPSPS 단백질의 검출한계가 0.03 μg/mL라고 발표한 곽 등 (13)의 결과와 비교하여 볼 때 상당히 높은 민감도이며, ELISA 검사법보다 오히려 immunoblotting법이 더 민감하게 CP4EPSPS 단백질을 검출할 수 있는 방법이 될 수 있다는 것을 제시해 주는 좋은 결과라 할 수 있다.
- 27 μg 이상의 농도로 분리된 콩 샘플에서 대부분 관찰되었다. 항 CP4EPSPS 단클론 항체와의 반응성 조사에서는 분리된 총 단백질의 농도가 1.35 μg 이상인 샘플(Fig. 3, B 1-4번)에서, 다클론 항체와의 반응에서는 분리된 단백질의 농도가 0.13 μg 이상인 샘플(Fig. 3, C 1-6번)에서 CP4EPSPS 단백질과 항체와의 반응을 확인할 수 있었다. CP4EPSPS 단백질은 제초제에 내성을 갖도록 유전자재조합 된 몬산토사의 콩에서 전체 단백질의 약 0.
- 3, C 1-6번)에서 CP4EPSPS 단백질과 항체와의 반응을 확인할 수 있었다. CP4EPSPS 단백질은 제초제에 내성을 갖도록 유전자재조합 된 몬산토사의 콩에서 전체 단백질의 약 0.1% 이하를 차지하는 것으로 밝혀졌으며(8), 이를 감안한다면 단클론 항체의 경우 0.001 μg, 다클론 항체의 경우 0.0001 μg까지의 농도에서 CP4EPSPS 단백질과의 반응성을 검색할 수 있는 민감도이다. 이는 항체 생산에 사용된 재조합단백질 검사에서 확인된 단클론 항체를 이용한 검증 한계치 0.
- 0006 μg보다는 상대적으로 낮으나 역시 곽 등(13)이 발표한 ELISA를 이용한 검증 결과보다 높은 민감도를 나타내는 결과다. 사용된 다클론 및 단 클론 항체는 훨씬 높은 희석배율(단클론 항체 1: 50, 000, 다클론 항체 1:20, 000)에서도 CP4EPSPS# 인식하는 민감도를 나타냈으며 이들 다클론 및 단클론 항체와 CP4EPSPS 단백질 사이의 특이성은 inhibition 테스트를 통해 확인할 수 있었다(자료비공개). 본 연구에서는 CP4EPSPS 단백질의 검증 한계치를 확인하기 위해 상대적으로 높은 단클론 및 다클론 항체의 농도 (단클론 항체 1:2000배 희석, 항 CP4EPSPS 다클론 항체 1 : 1000 희석 사용)를 이용한 검사가 이루어졌고, 높은 항체 농도로 인한 콩 단백질과의 비특이적 반응들이 나타났다.
- 사용된 다클론 및 단 클론 항체는 훨씬 높은 희석배율(단클론 항체 1: 50, 000, 다클론 항체 1:20, 000)에서도 CP4EPSPS# 인식하는 민감도를 나타냈으며 이들 다클론 및 단클론 항체와 CP4EPSPS 단백질 사이의 특이성은 inhibition 테스트를 통해 확인할 수 있었다(자료비공개). 본 연구에서는 CP4EPSPS 단백질의 검증 한계치를 확인하기 위해 상대적으로 높은 단클론 및 다클론 항체의 농도 (단클론 항체 1:2000배 희석, 항 CP4EPSPS 다클론 항체 1 : 1000 희석 사용)를 이용한 검사가 이루어졌고, 높은 항체 농도로 인한 콩 단백질과의 비특이적 반응들이 나타났다.
- 샘플 두부포장에 표기된 콩의 원산지와 CP4EPSPS 단백질 조사 결과가 Table 1에 요약되었다. 다클론 항체를 이용한 immunoblotting 검사 결과 양성 컨트롤로 함께 조사된 2개의 샘플(Fig. 4, B 10 번, C) 외에 조사된 9개의 두부 샘플 중 2개의 샘플(Fig. 4, B 1번, 4번)에서 CP4EPSPS 단백질의 존재를 확인할 수 있었고 이들 두 샘플은 모두 PCR 검사법에서도 양성의 결과를 얻은 샘플이다(자료 비공개). 반면 PCR 검사법에서 양성으로 확인된다른 3개의 두부 샘플에서는 다클론 항체를 이용한 검사에서 CP4EPSPS 단백질의 존재가 확인되지 못했으며, 이러한 결과는 다클론 항체가 상당히 높은 민감도를 갖고 있으나 PCR 검사법이 더 낮은 검증한계치를 갖고 있다는 것을 나타내는 결과이다.
- 4, B 1번, 4번)에서 CP4EPSPS 단백질의 존재를 확인할 수 있었고 이들 두 샘플은 모두 PCR 검사법에서도 양성의 결과를 얻은 샘플이다(자료 비공개). 반면 PCR 검사법에서 양성으로 확인된다른 3개의 두부 샘플에서는 다클론 항체를 이용한 검사에서 CP4EPSPS 단백질의 존재가 확인되지 못했으며, 이러한 결과는 다클론 항체가 상당히 높은 민감도를 갖고 있으나 PCR 검사법이 더 낮은 검증한계치를 갖고 있다는 것을 나타내는 결과이다. 본 연구에서 단클론 항체와 다클론 항체를 이용하여 확립한 제초제 저항성 유전자재조합 콩의 immunoblotting 분석법은 비록 PCR을 이용한 검사법보다 낮은 검증한계치를 갖고있으나, 대다수의 콩 관련 식품이 제조 공정 과정에서 가열처리 되면서 발생되는 DNA 파괴로 인한 PCR 검사법의 제한성을 극복할 수 있는 대체 방법으로서 기존에 발표된 ELISA법보다 높은 민감도를 갖는 개선된 검사법이다.
- 3). 전기영동 후 Coomassie 염색된 콩의 단백질은 대략 80, 55, 48, 30, 20 kDa 부위에서 비교적 두꺼운 밴드로 나타났고 이들 단백질 밴드들은 0.27 μg 이상의 농도로 분리된 콩 샘플에서 대부분 관찰되었다. 항 CP4EPSPS 단클론 항체와의 반응성 조사에서는 분리된 총 단백질의 농도가 1.
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