[논문]대장균을 이용한 Akt/PKB Protein Kinase의 발현 및 활성화

이재학

[국내논문] 대장균을 이용한 Akt/PKB Protein Kinase의 발현 및 활성화
Expression and Activation of Akt/PKB Protein Kinase using Escherichia coli 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.37 no.2, 2009년, pp.105 - 109

초록
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단백질 인산화를 통한 세포내 신호전달기구 중 serine/threonine kinase에 속하는 Akt/PKB는 세포 생존과 사멸, 당대사 등을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로, Akt/PKB 단백질은 천연물질들로부터 항암제를 탐색하기 위한 한 가지 target으로 사용되어 왔다. 본 연구에서는 Akt/PKB 단백질을 대량으로 생산하기 위하여 대장균의 단백질 발현 시스템을 이용하여 human Akt/PKB 단백질을 발현시켰다. 대장균에서 대량 발현된 Akt는 일반적인 조건에서는 inclusion body를 형성하였다. 배양온도 $27^{\circ}C$에서 0.01-0.09 mM IPTG로 발현 유도 시 발현된 human Akt/PKB 단백질 상당 부분이 가용화 되었다. 발현된 Akt kinase를 $Ni^{2+}$-NTA agarose column으로 정제하고, anti-Akt antibody를 이용하여 정제된 단백질이 Akt kinase 임을 확인하였다. 정제된 human Akt/PKB 단백질은 세포추출물에 존재하는 인산화 단백질을 이용하여 in vitro에서 인산화 되었으며, 인산화된 활성형 human Akt/PKB protein kinase는 human Akt/PKB protein kinase 특이 형광 peptide를 특이적으로 인산화하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Among signal transduction systems by protein phosphorylation Akt/PKB protein kinase which is one of serine/threonine kinases, is known to regulate the survival and death of the cell and glucose metabolism. Thus, Akt/PKB protein kinase has been used as one of the target proteins to find anti-cancer agents from natural products. In this study, human Akt/PKB protein kinase was expressed in Escherichia coli expression system for the mass production. Human Akt/PKB protein kinase expressed in E. coli formed inclusion body under the general condition. However, most of the expressed protein was solubilized under the culture temperature at $27^{\circ}C$ and 0.01-0.09 mM of IPTG for induction of the protein expression. The expressed protein was purified using $Ni^{2+}$-NTA agarose column and confirmed by using anti-Akt antibody. Subsequently, the purified human Akt/PKB protein kinase was activated by in vitro phosphorylation using cellular extract containing kinases. The activated protein was confirmed to phosphorylate the specific fluorescent peptide specially designed as the artificial substrate for Akt/PKB protein kinase.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 이와 같은 Akt kinase 활성을 조절 할 수 있는 조절물질은 Akt kinase가 관여하는 다양한 조절 기능으로부터 유추할 때암, 당뇨, 치매 등을 치료할 수 있는 신약 개발에 많은 기여를 할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 세포내 신호전달 기구 중 Akt등을 포함하는 인산화를 통한 신호전달기구를 분석할 수 있는 assay kit개발을 목적으로 human Akt kinase를 활성이 상실되지 않은 형태로 대장균에서 대량으로 발현시키는 연구를 실시 하였다.
이러한 이유로, Akt/PKB 단백질은 천연물질들로부터 항암제를 탐색하기 위한 한 가지 target으로 사용되어 왔다. 본 연구에서는 Akt/PKB 단백질을 대량으로 생산하기 위하여 대장균의 단백질 발현 시스템을 이용하여 human Akt/PKB 단백질을 발현시켰다. 대장균에서 대량 발현된 Akt는 일반적인 조건에서는 inclusion body를 형성하였다.
최근에는 이러한 Akt/PKB kinase를 대체할 수 있는 방선균 유래의 kinase를 이용하여 인산화를 실시하고, 이러한 시스템을 이용하여 Akt/PKB kinase 저해제를 성공적으로 발굴한 예도 있다[4, 17]. 이러한 Akt/PKB kinase의 중요성을 감안하여, 본 연구에서는 Akt kinase assay에 직접 사용할 수 있는 Akt/PKB kinase를 확보하기 위해, Akt/PKB kinase를 동물세포가 아닌 대장균에서 직접 발현시키고 활성화시키는 연구를 실시하였다.

제안 방법

pET28-Akt1을 형질전환 시킨 Escherichia coli BL21을 LB 액체 배지에 ampicillin(50 µg/mL)과 함께 접종하여 12시간 배양한 후 3,000 × g에서 10분간 원심분리하여 균체만을 모은 후 동량의 LB 액체배지를 이용하여 현탁하였다.
배양한 균체에 각각 300 µL의 완충액을 넣어 현탁시키고, 초음파분쇄기로 분쇄한 후 10,000 × g에서 30분간 원심분리하여 얻어진 침전물과 supernatant를 이용하여 각각의 protein의 양을 측정하였는데, 이때 BSA(bovine serum albumin)를 표준품으로 이용하여 표준검량곡선을 작성한 후 측정하였다.
3,000 × g에서 10분간 다시 원심분리한 후 LB 배지에 재현탁시켜 ampicillin(50 µg/mL) 100 µL와 함께 1 mL을 100 mL의 LB 액체 배지에 접종하여 2시간 배양한 후, IPTG를 0.01-0.09 mM을 첨가하여 20-37℃에서 3시간 동안 발현시킨 다음 3,000 × g에서 20분간 원심분리 후 분석하였다.
구입한 pUSEamp-Akt1 cDNA 재조합 벡터를 EcoRI/BamHI으로 자르고 얻은 1.75-kb의 단편을 같은 제한효소를 이용하여 자른 pET28a(+)(Novagene, USA) 벡터에 삽입하여 길이 7.1-kb의 pET28-Akt1 재조합 벡터를 제작하였다.
분리한 단백질이 목적하는 Akt kinase 임을 명확히 밝히기 위해서 SDS-PAGE 후 젤에 전개된 단백질을 Pharmacia사의 multiphore electrophoresis kit를 이용하여 electrotransfer 방법에 의해 nitrocellulose membrane에 옮겼다. Ponceau S staining으로 transfer된 protein band를 확인한 후 1x TBS(Tris-buffered saline: 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7.
05% Tween-20) 100 mL를 넣어 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후, anti-Akt antibody와 1차 반응을 시키고, Supersignal West Femto Chemiluminescence western blotting detection system(Pierce Biotech, USA)을 이용하여 band의 형성을 확인한 후 건조시켜 보관하였다.
대장균 발현 vector인 pET28a(+)에 human Akt/PKB의 cDNA 유전자를 삽입한 pET28-Akt1 재조합 벡터를 제조한 후, 이를 E. coli BL21에 형질전환하였다. 형질전환체 접종시 IPTG를 최종농도 0.
Akt/PKB를 soluble form으로 대량 발현시키기 위해서 IPTG 농도를 바꾸어주거나 배양온도를 낮추어 주는 등 다양한 조건에서 형질전환 된 E. coli를 배양하는 실험을 실시하였다. 전반적으로는 27℃에서 3시간 배양 하였을 때 가용성 발현 단백질 양이 많았다.
활성형 Akt/PKB를 얻기 위하여 정제된 Akt/PKB를 293 cell lysates와 반응시켜 인산화 시킨 후 다시 정제하여 활성형 Akt/PKB를 얻을 수 있었다. 이렇게 얻어진 활성형 Akt kinase가 이전에 보고된 형광 peptide를 이용한 nonradioactive kinase assay system에 이용될 수 있는 지 확인하였다(Fig. 4). 그 결과, 활성화되지 않은 Akt 단백질에서는 peptide의 인산화가 관찰되지 않았지만, 활성화 된 Akt 단백질에서는 peptide를 인산화 시킬 수 있음이 관찰되었다.
09 mM IPTG로 발현 유도 시 발현된 human Akt/PKB 단백질 상당 부분이 가용화 되었다. 발현된 Akt kinase를 Ni²⁺-NTA agarose column으로 정제하고, anti-Akt antibody를 이용하여 정제된 단백질이 Akt kinase 임을 확인하였다. 정제된 human Akt/PKB 단백질은 세포추출물에 존재하는 인산화 단백질을 이용하여 in vitro에서 인산화 되었으며, 인산화된 활성형 human Akt/PKB protein kinase는 human Akt/PKB protein kinase 특이 형광 peptide를 특이적으로 인산화하였다.

대상 데이터

야생형 Akt/PKB kinase 유전자는 pUSEamp-Akt1 cDNA(catalog # 21-153, Upstate Biotechnology사, USA)를 구입하여 사용하였다. 대장균에서의 형질전환 및 plasmid DNA 재조합 조작은 Maniatis 등의 방법에 따라 추출하였다[12].
대장균에서의 형질전환 및 plasmid DNA 재조합 조작은 Maniatis 등의 방법에 따라 추출하였다[12]. 각종 제한효소 및 T4 DNA ligase(Takara, Korea) 등은 구입하여 사용하였으며, 반응조건은 제조 회사의 권장 방법에 따라 실시하였다.

이론/모형

야생형 Akt/PKB kinase 유전자는 pUSEamp-Akt1 cDNA(catalog # 21-153, Upstate Biotechnology사, USA)를 구입하여 사용하였다. 대장균에서의 형질전환 및 plasmid DNA 재조합 조작은 Maniatis 등의 방법에 따라 추출하였다[12]. 각종 제한효소 및 T4 DNA ligase(Takara, Korea) 등은 구입하여 사용하였으며, 반응조건은 제조 회사의 권장 방법에 따라 실시하였다.
각각의 배양 조건에서 성장한 균체의 단백질의 양을 측정 하기 위해서 Bradford 분석법을 이용하였다[2]. 배양한 균체에 각각 300 µL의 완충액을 넣어 현탁시키고, 초음파분쇄기로 분쇄한 후 10,000 × g에서 30분간 원심분리하여 얻어진 침전물과 supernatant를 이용하여 각각의 protein의 양을 측정하였는데, 이때 BSA(bovine serum albumin)를 표준품으로 이용하여 표준검량곡선을 작성한 후 측정하였다.
Protein kinase assay는 형광 물질인 FITC 가 부착된 기질(FITC-TRRSRTESIT)을 이용하여 실험하였다. 반응액은 FITC-peptide 5 µg, 2 × reaction buffer(40 mM HEPES [pH 7.

성능/효과

coli BL21에 형질전환하였다. 형질전환체 접종시 IPTG를 최종농도 0.5 mM이 되도록 첨가하여 37℃에서1시간 배양한 후 cell lysate를 SDS-PAGE로 확인해 본 결과 Akt/PKB로 추정되는 단백질이 발현됨을 알 수 있었다(Fig. 1). 예상되는 발현 단백질은 60 kDa 정도이지만 발현된 단백질의 분자량은 이 보다 약간 큰 것으로 분석되었다.
2에 나타냈다. 결과적으로, IPTG가 0.01-0.09 mM 까지 Akt 단백질이 soluble form으로 발현되었으나, insoluble form도 상당량 존재하였다. 최종적으로 0.
09 mM 까지 Akt 단백질이 soluble form으로 발현되었으나, insoluble form도 상당량 존재하였다. 최종적으로 0.03-0.07 mM의 IPTG 농도에서 soluble form으로의 발현율이 가장 높은 것으로 판단되었으며, 이후의 모든 발현 실험은 0.05 mM IPTG 농도로 27℃에서 3시간 발현을 유도하여 진행하였다.
예상대로 insoluble form의 Akt 단백질은 제시된 컬럼 조작 조건에서 분리되지 않았으나, soluble Akt만이 성공적으로 분리되었다. 분리된 단백질은 예상 하는 분자량 보다 약간 큰 것으로 생각되었지만, anti-Akt antibody를 이용한 Western blot 결과 human Akt/PKB임을 확인할 수 있었다.
4). 그 결과, 활성화되지 않은 Akt 단백질에서는 peptide의 인산화가 관찰되지 않았지만, 활성화 된 Akt 단백질에서는 peptide를 인산화 시킬 수 있음이 관찰되었다. 이러한 사실은 대장균에서 발현시켜 얻은 Akt kinase로도 nonradioactive kinase assay의 kinase source로 사용할 수 있음을 명백하게 보여 주었다.

후속연구

이렇게 활성화 된 Akt는 다양한 스트레스에 의해서 야기되는 apoptosis로부터 세포를 보호하는 survival signal을 전달해주며 insulin과 관련된 대사과정에 참여하여 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이와 같은 Akt kinase 활성을 조절 할 수 있는 조절물질은 Akt kinase가 관여하는 다양한 조절 기능으로부터 유추할 때암, 당뇨, 치매 등을 치료할 수 있는 신약 개발에 많은 기여를 할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 세포내 신호전달 기구 중 Akt등을 포함하는 인산화를 통한 신호전달기구를 분석할 수 있는 assay kit개발을 목적으로 human Akt kinase를 활성이 상실되지 않은 형태로 대장균에서 대량으로 발현시키는 연구를 실시 하였다.
이러한 방법을 이용하여 Akt protein kinase에 특이적인 저해제를 식물로부터 분리하여 구조 및 효능을 보고한 논문이 있으나, 모든 assay에는 반드시 kinase source가 필요하며, 현재 시판되는 Akt kinase를 사용하기에는 너무 고가이다[17]. 본 연구 결과에서 제시하고 있는 것처럼 Akt kinase를 대장균에서 발현시키고 이를 assay에 사용한다면, 학문적으로는 물론 다양한 Akt kinase inhibitor 탐색에 많은 도움이 될 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Akt/PKB kinase은 어떤 signal을 관장하는가?	그 주요 원인은 신호전달의 주요 messenger인 인산화 분석 방법이 너무 어렵고, 고 비용을 필요로 하며, 시간이 많이 걸리는 어려움을 지적할 수 있다. Akt/PKB kinase의 경우 cell signaling의 상부에 위치하고 있는 kinase로서 XXRXRXXS/TXX(X: hydrophobic amino acid) 서열에 대한 특이적인 인산화를 통하여 세포의 생존과 관련된 signal을 관장하고 있다. 이러한 인산화의 표적 단백질 중에는 세포의 암화에 필수적인 telomerase를 포함하여, 당대사에 관련된 조절 유전자, 세포사를 유도하는 조절유전자들이 포함되어 있다[6, 10, 13, 15].
	Akt/PKB kinase를 항암제 등으로 개발할 수 있는 까닭은 무엇인가?	Akt/PKB kinase의 경우 cell signaling의 상부에 위치하고 있는 kinase로서 XXRXRXXS/TXX(X: hydrophobic amino acid) 서열에 대한 특이적인 인산화를 통하여 세포의 생존과 관련된 signal을 관장하고 있다. 이러한 인산화의 표적 단백질 중에는 세포의 암화에 필수적인 telomerase를 포함하여, 당대사에 관련된 조절 유전자, 세포사를 유도하는 조절유전자들이 포함되어 있다[6, 10, 13, 15]. 따라서 Akt/PKB kinase의 활성을 억제하는 저해제를 개발할 경우 세포내 신호전달체계에 대한 연구용으로 매우 유용하게 작용할 것이며, 항암제 등 다양한 의약품 개발이 가능할 것이다[8, 9, 11, 17].
	Akt/PKB kinase가 PI3K의 major effector protein이라는 사실은 무엇을 근거로 밝혀졌는가?	단순히 하나의 발암유전자로 발견된 Akt/PKB kinase는 해당 유전자의 염기서열과 단백질 서열의 분석으로, 새로운 phosphatidylinositol 3 kinase(PI3K)의 major effector protein이라는 사실이 밝혀졌다. 이 효소에는 N-terminal에 pleckstrin homolgy(PH) domain이 존재하며, PH 도메인의 존재로 이 효소가 PI3K lipid products에 의해 세포막에 운반되는 단백질 중의 하나로 밝혀지게 된 것이다[6, 10].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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