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문제 정의
- 50 여종의 한약재 중 여러 가지의 한약재에서 인슐린 저항성을 저하시키거나 인슐린 분비를 증가시키거나 탄수화물 소화를 억제하는 물질을 발견하였다. 본 연구에서는 그 중 하나인 목단피Radicis Corg)를 추출 분획하여 인슐린 작용력과 탄수화물의 소화에 미치는 영향을 연구하였다.
- 목단피의 paeoniflorin은 혈소판 응집 억제 작용을 흐}고 hbrinogen을 감소시킨다고 보고되고 있다(10, 11). 아직까지 목단피가 혈당 강하의 효과에 대한 보고는 없지만, 소갈(당뇨병) 처방의 하나인 육미지황환에 함유된 약재이므로 (7) 본 연구에서는 목단피의 추출물이 인슐린의 작용을 향상시키는 인슐린 민감성 물질로서의 효능이 있는 지 여부와 탄수화물의 소화 흡수에 미치는 영향을 조사하였다. 목단피는 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 실험으로 세포 독성을 측정한 결과 3T3-L1 섬유아세포에 목단피의 메탄올과 물로 분획한 분획층을 본 연구에서 활성을 나타내는 농도인 3Mg/mL보다 고농도인 1mg/mL에서 12시간 처리하였을 때도 세포의 생존률은 모든 분획층에서 93-98%를 보여 세포 독성의 위험성이 거의 없었다(data not shown).
- In , O에서 실험동물에게 목단피의 70% 메탄올 추출물을 투여한 후 말토즈와 dextrin로 경구 부하 검사를 하였을 때 dextrin만이 투여하였을 때에 대조군인셀룰로즈에 비해 혈당의 상승이 현저하게 낮았고 이것은 dextrin 의 소화 흡수의 감소에 의한 것으로 추정된다. 앞으로 효과가 있는 분획층을 더 분리하여 인슐린 민감성 물질과 a-glycoamy- lase의 활성을 억제시키는 유효성분을 분리하고자 한다.
제안 방법
- 3T3-L1 지방세포에 1 ng/mL 인슐린과 함께 0.3 Rg/mL 또는3|Ug/mL목단피 추출 분획물을 처리하였을 때 포도당 흡수에 미치는 영향을 조사하고 그 결과를 각각 Fig. 2A와 Fig. 2B에 주었다. 이 실험을 통해서 인슐린 민감성 물질을 탐색할 수 있는데 그 근거는 1 ng/mL 인슐린과 추출물을 처리하였을 때 포도당의 흡수가 인슐린을 50ng/mL를 처리한 만큼 증가한다면 이 추출물은 인슐린 작용을 향상시키는 물질인 인슐린 민감성 물질로 간주할 수 있기 때문이다.
- 3과 3Hg/mL로 3시간 동안 처리하였다. HEPES 용액으로 media를 교환한 후 다시 추출물을 0, 0.3 그리고 3 Hg/mL로 처리하고 37에서 30분 동안 배양한 후 1 piCUmL의 [l4C]2-deoxyglucose와 1 mM 포도당을 첨가하고 22℃에서 30분 동안 배양하여 포도당의 세포내로의 흡수 정도를 %:이 세포 내로 이동한 양으로 측정하였다. 비특이적으로 포도당이 세포내로 흡수되는 것을 배제하기 위해서 glucose transporter 4 (GLUT4)의 작용을 억제하는 cyto B와 함께 배양하였을 때의 포도당 이동량을 빼고 세포내로 이동한 포도당의 양을 측정하였다.
- In vitro 실험에서 목단피 분획 물의 대부분 층에 a-glucoamy lase 억제제가 함유되어 있었으므로 in vo실험에서는 컬럼으로 분획한 것을 사용하지 않고 70% 메탄올로 추출하여 동결건조시킨 것을 사용하였다. Fig.
- Sprague Dawley 숫컷 백서(중앙 실험 동물, Korea)를 1& 시간동안 금식 시킨 후 목단피 추출물을 500mg/kg 체중을 투여하고 10분 뒤에 dextrin 또는 말토즈를 2 g/kg 체중을 경구투여 한 후 0, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120 n에 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈청 포도당 농도를 측정하였다. 실험 동물 수는 각 군마다 8마리로 하였다.
- 배양용기에 있는 지방세포의 수를 세어 12 well plate에 각 well 마다 5X105 의 세포를 분주하여 빈 공간없이 완전히 채우도록 하였다. Wellplate에 옮긴 지방세포를 phosphate buffer(PBS)로 세척한 후 1% bovine serum albumin을 함유하고 있는 저농도의 포도당을 함유한 DMEM에서 12시간 이상 지난 후에 효과를 조사할 추출 분획물을 0, 0.3과 3Hg/mL로 3시간 동안 처리하였다. HEPES 용액으로 media를 교환한 후 다시 추출물을 0, 0.
- 대조군은 목단피의 분획층의 용매인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다. 결과는 DMSO만을 처리하였을 때 생성되는 유리 포도당 양에 비해 목단피 분획충을 넣었을 때 유리포도당의 생성이 감소되는 정도를 백분율로 계산하였다.
- 반응 후 생성되는 유리 포도당 양을 측정하여 a-glucoamylase의 활성을 측정하였다. 대조군은 목단피의 분획층의 용매인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다. 결과는 DMSO만을 처리하였을 때 생성되는 유리 포도당 양에 비해 목단피 분획충을 넣었을 때 유리포도당의 생성이 감소되는 정도를 백분율로 계산하였다.
- 치료하였다. 동양 의학에서 질병의 치료제는 주로 동의보감을 기초로 사용하므로 본 연구자들은 에비 연구에서 동의보감에 나오는 약 50여종의 한약재에서 인슐린 저항성을 감소시키는 물질, 인슐린 분비능을 증가시키는 물질, 그리고 탄수화물의 소화를 억제하는 물질이 있는 지를 조사하였다(7). 50 여종의 한약재 중 여러 가지의 한약재에서 인슐린 저항성을 저하시키거나 인슐린 분비를 증가시키거나 탄수화물 소화를 억제하는 물질을 발견하였다.
- 목단피 1kg에 70% 에탄올 10 L을 넣고 2시간X2회 열수로 2회 반복 추출한 후 꺼즈로 여과하고 2000rpm으로 원심분리기(Megafuge 1.0R, USA)로 상등액을 분리하고 회전진공 농축기(Buchi R-114, USA)에서 감압농축한 후 동결건조기(Dsin freeze dryer, Korea)로 건조시켜 분말 추출시료를 만들었다. 열수분말추출시료 1g을 증류수 10mL에 현탁시켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지컬럼(직경: 30 mm;길이: 300mm)으로 정제하였다.
- 목단피 추출 분획물이 포도당 흡수에 미치는 영향을 조사하기 위해서 목단피 추출 분획물을 DMSO에 1mg/mL으로 녹인 후 이것을 PBS에 03과 3ug/mL로 희석시켜 두 가지 농도에서 포도당 흡수를 측정하였다. 목단피의 각 분획물에 인슐린 민감성 제재가 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위해서 3T3- L1 지방세포에 인슐린 Ing/mL와 함께 각 분획물을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 흡수 정도를 측정하였고, 대조군은 목단피 분획물 없이 인슐린 1 ng/mL만을 처리한 것을 사용하였다.
- 흡수를 측정하였다. 목단피의 각 분획물에 인슐린 민감성 제재가 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위해서 3T3- L1 지방세포에 인슐린 Ing/mL와 함께 각 분획물을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 흡수 정도를 측정하였고, 대조군은 목단피 분획물 없이 인슐린 1 ng/mL만을 처리한 것을 사용하였다. 모든 실험은 3 반복하였고, 실험결과는 인슐린 1 ng/mL 와 목단피 추출물을 처리한 측정값을 인슐린 1 ng/mL만을 처리한 대조군의 값으로 나누어 증가한 정도를 비 (fold)로 나타내었다.
- 2 M aceticacid 용액을 넣어주었다. 반응 후 생성되는 유리 포도당 양을 측정하여 a-glucoamylase의 활성을 측정하였다. 대조군은 목단피의 분획층의 용매인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다.
- 배양용기 바닥을 완전히 채운 지 2일 후에 유도 분화물질인 분화유도물질인 0.25의 dexamethasone(Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 0.5 mM의 l-methyl-3-isobutylxanthine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 10)ig/mL의 인슐린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA)을 넣어 3일 동안 배양한 후 2일에 한번씩 고농도 포도당 Dulbecco's Modified Eae Mechum(DMEM)을 새로 바꾸어 주어 지방세포로 완전히 전환된 10-15일 사이에 포도당 흡수 실험을 하였다. 배양용기에 있는 지방세포의 수를 세어 12 well plate에 각 well 마다 5X105 의 세포를 분주하여 빈 공간없이 완전히 채우도록 하였다.
- 5 N NaOH로 세포를 분해하였다. 분해된 세포를 초산으로 중화시키고 함유된 의 함량을 베타 counter(Tri-Carb 2100TR, Packard Bioscince, IL)로 측정하였다.
- 3 그리고 3 Hg/mL로 처리하고 37에서 30분 동안 배양한 후 1 piCUmL의 [l4C]2-deoxyglucose와 1 mM 포도당을 첨가하고 22℃에서 30분 동안 배양하여 포도당의 세포내로의 흡수 정도를 %:이 세포 내로 이동한 양으로 측정하였다. 비특이적으로 포도당이 세포내로 흡수되는 것을 배제하기 위해서 glucose transporter 4 (GLUT4)의 작용을 억제하는 cyto B와 함께 배양하였을 때의 포도당 이동량을 빼고 세포내로 이동한 포도당의 양을 측정하였다. 세포는 10 mM 포도당이 함유한 PBS으로 세척하고 0.
- 6 분획물이 작용하는 기전은 과다하게 존재하면 negative feedback을 하여 인슐린 작용을 저하시키는 것과 관련이 있는것으로 추정된다. 이때 분리한 분획물의 포도당 흡수 중가 효과가 특이적으로 인슐린의 작용을 향상시켜서 나타내는 현상인지 분획물이 세포에 detergent로 비특정적으로 작용하여 포도당을 세포내로 이동하는 것인지를 조사하기 위해 인슐린을 첨가하지 않고 분획물만을 넣은 상태에서 포도당을 흡수하는 정도를 측정하였는데 그 값이 기저값과 유사하거나 오히려 낮아 분획물이 detergents. 작용하여 비특이적으로 포도당의 흡수를 증가시키는 것은 아니었다.
- 열수분말추출시료 1g을 증류수 10mL에 현탁시켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지컬럼(직경: 30 mm;길이: 300mm)으로 정제하였다. 이때 용출액은 메탄올의 양을증량시켜 극성을 변화시키면서 H2O(Fr. 1), 20% 메탄올(Fr. 2), 40% 메탄올(Fr. 3), 60% 메탄올(Fr. 4), 80% 메탄올(Fr. 5) 및100% 메탄올 (Fr. 6)으로 나누어 분획하여 감압농축 후 동결건조하였다. 각각의 분획층은 10% DMSO에 1 mg/mLS.
- 분리한 물질이 인슐린의 작용에 관계없이 detergents. 작용하여 세포막을 파괴시켜 포도당 흡수를 증가시키는 것을 배제하기 위해서 인슐린이 0ng/mL 에서 분리한 물질과 함께 포도당 흡수를 측정하였을 때 이 값이 기저 (basal) 값보다 높은 것은 포도당 흡수를 증가시킨다고 해도 인슐린 민감성 제재로서의 작용이 없는 것으로 간주하였다.
- 실험 동물 수는 각 군마다 8마리로 하였다. 정상대조군으로 목단피와 같은 양의 셀루로즈를 사용하였다 경구 말토즈나 dextrin 부하 검사에서 혈당 변화는 area under the curve를 계산하여 혈당이 상승하는정도를 나타내는 지표로 사용하였다.
- 한의학에서 당뇨병(소갈) 처방으로 사용되는 육미지황환의 성분 중의 하나인 목단피의 혈당 강하 효과를 조사하기 위해서목단피를 70% 에탄올로 추출한 후 XAD-4 column으로 분획하여 인슐린 민감성을 향상시키고 a-glucoamylase 활성을 억제하는 분획층이 있는지를 조사하였다. 3T3-L1 지방세포에서 소량의 인슐린(1 ng/mL)의 존재하에서 20, 40, 60% 메탄올 분획층은 인슐린 작용을 증가시켜 포도당 흡수를 효과적으로 증가시키는 인슐린 민감성 성분이 함유되어 있었다.
대상 데이터
- 동양 의학에서 질병의 치료제는 주로 동의보감을 기초로 사용하므로 본 연구자들은 에비 연구에서 동의보감에 나오는 약 50여종의 한약재에서 인슐린 저항성을 감소시키는 물질, 인슐린 분비능을 증가시키는 물질, 그리고 탄수화물의 소화를 억제하는 물질이 있는 지를 조사하였다(7). 50 여종의 한약재 중 여러 가지의 한약재에서 인슐린 저항성을 저하시키거나 인슐린 분비를 증가시키거나 탄수화물 소화를 억제하는 물질을 발견하였다. 본 연구에서는 그 중 하나인 목단피Radicis Corg)를 추출 분획하여 인슐린 작용력과 탄수화물의 소화에 미치는 영향을 연구하였다.
- 계대 배양과 동일한 방법으로 3T3-L1 섬유아세포(AmericanType Culture Collection, Manassas, VA)를 12 well pla에 5X104의 세포를 분주한 후 완전히 채워질(confment) 때까지 배양하였다. 배양용기 바닥을 완전히 채운 지 2일 후에 유도 분화물질인 분화유도물질인 0.
- 본 실험에 사용한 목단피는 서울 경동시장에서 구입한 후 한국한의학연구원에서 엄격하게 감별하고 선정한 것을 사용하였고, 일련 번호(2002-54)를 붙이고 한국한의학연구원 표본실에 보관하고 있다.
- 0, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120 n에 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈청 포도당 농도를 측정하였다. 실험 동물 수는 각 군마다 8마리로 하였다. 정상대조군으로 목단피와 같은 양의 셀루로즈를 사용하였다 경구 말토즈나 dextrin 부하 검사에서 혈당 변화는 area under the curve를 계산하여 혈당이 상승하는정도를 나타내는 지표로 사용하였다.
데이터처리
- 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 3T3-L1 지방세포에서 목단피 분획물이 대조군에 비해 포도당 흡수가 증가하는 정도와 in 에서 ot-glucoamylase의 활성의 변화 정도를 one sam ple Z-test 방법으로 통계적 유의성을 검증하였다. In vivo에서도목단피의 효과를 셀루로즈를 공급한 정상 대조군과 비교하여 two sample r-test로 통계적 유의성을 검증하였다.
- 3T3-L1 지방세포에서 목단피 분획물이 대조군에 비해 포도당 흡수가 증가하는 정도와 in 에서 ot-glucoamylase의 활성의 변화 정도를 one sam ple Z-test 방법으로 통계적 유의성을 검증하였다. In vivo에서도목단피의 효과를 셀루로즈를 공급한 정상 대조군과 비교하여 two sample r-test로 통계적 유의성을 검증하였다. 모든 통계 처리의 유의성 검증은 a = Q05로 정하였다.
- 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 3T3-L1 지방세포에서 목단피 분획물이 대조군에 비해 포도당 흡수가 증가하는 정도와 in 에서 ot-glucoamylase의 활성의 변화 정도를 one sam ple Z-test 방법으로 통계적 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- 함께 3T3-L1 지방세포에 처리하였을 때 Fr. 1, 3, 4, 또는 5는 포도당 흡수를 증가시켜 인슐린만을 처리한 대조군의 값에 비해 통계적으로 유의하게 높았다. 또한 이때 포도당 흡수량이 저농도로 처리하였을 때 보다 고농도에서 현저하게 증가하여 인슐린 50ng/mL를 처리한 것과 유사하거나 더 높았다 (Fig.
- 5)을 50pg/mL로 1시간 동안 배양하였을 때의 결과인데, 이러한 조건은 다른 연구 논문에서 일반적으로 a-glucoamylase의 활성을 억제하는 물질(분획물)을 탐색할 때 사용하는 조건보다 분획물의 농도는 낮았고 배양시간은 길었다. 그럼에도 불구하고, 목단피 분획물이 조건에서도 a-giucoamylase의 활성을 효율적으로 억제한다는 것을 알 수 있었다. 한편 in vitm에서는기질로 말토즈를 사용하였을 때도 목단피 분획 추출물(Fr.
- 3T3-L1 지방세포에서 소량의 인슐린(1 ng/mL)의 존재하에서 20, 40, 60% 메탄올 분획층은 인슐린 작용을 증가시켜 포도당 흡수를 효과적으로 증가시키는 인슐린 민감성 성분이 함유되어 있었다. 또한 20, 40, 60, 80% 메탄올 분획층에는 a-glucoamylase의 활성을 억제하여 말토즈와 dextrin의 a-이ycosidic 결합이 분해되는 것을 억제시키는 성분이 함유되어 있었다. In , O에서 실험동물에게 목단피의 70% 메탄올 추출물을 투여한 후 말토즈와 dextrin로 경구 부하 검사를 하였을 때 dextrin만이 투여하였을 때에 대조군인셀룰로즈에 비해 혈당의 상승이 현저하게 낮았고 이것은 dextrin 의 소화 흡수의 감소에 의한 것으로 추정된다.
- 4는 40g±63g의 숫컷 백서에게 500mg/kg 체중의 목단피 추출물이나 셀루로즈를 공급한 후에 2g/kg 체중의 말토즈를 공급하였을 때 혈당 변화를 나타내었다. 말토즈를 기질로 공급하였을 때 혈당 검사 결과는 최고혈당 값 그리고 혈당 변화 그래프로부터 계산한 area under the curve는 목단피 추출물을 투여 한 군과 셀루로즈를 투여한 대조군 사이에 차이가 거의 없었다(Fig. 6). 그러나 이와는 달리기 질을 dextrin으로 사용하였을 때는 셀루로즈에 비해 목단피추출물이 dextrin 섭취 후 10분에서 3까지의 혈중 포도당 농도가 대조군에 비해 현저하게 낮았다(Fig.
- 목단피의 각 분획물에 인슐린 민감성 제재가 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위해서 3T3- L1 지방세포에 인슐린 Ing/mL와 함께 각 분획물을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 흡수 정도를 측정하였고, 대조군은 목단피 분획물 없이 인슐린 1 ng/mL만을 처리한 것을 사용하였다. 모든 실험은 3 반복하였고, 실험결과는 인슐린 1 ng/mL 와 목단피 추출물을 처리한 측정값을 인슐린 1 ng/mL만을 처리한 대조군의 값으로 나누어 증가한 정도를 비 (fold)로 나타내었다. 분리한 물질이 인슐린의 작용에 관계없이 detergents.
- 아직까지 목단피가 혈당 강하의 효과에 대한 보고는 없지만, 소갈(당뇨병) 처방의 하나인 육미지황환에 함유된 약재이므로 (7) 본 연구에서는 목단피의 추출물이 인슐린의 작용을 향상시키는 인슐린 민감성 물질로서의 효능이 있는 지 여부와 탄수화물의 소화 흡수에 미치는 영향을 조사하였다. 목단피는 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 실험으로 세포 독성을 측정한 결과 3T3-L1 섬유아세포에 목단피의 메탄올과 물로 분획한 분획층을 본 연구에서 활성을 나타내는 농도인 3Mg/mL보다 고농도인 1mg/mL에서 12시간 처리하였을 때도 세포의 생존률은 모든 분획층에서 93-98%를 보여 세포 독성의 위험성이 거의 없었다(data not shown).
- 목단피의 분획물은 대부분 a-glucoamylase 의 활성을 현저하게 감소시켜 생성된 유리 포도당의 양이 적었다. 본 실험은 목단피 분획물(Fr. 2, Fr. 3, Fr. 4 그리고 Fr. 5)을 50pg/mL로 1시간 동안 배양하였을 때의 결과인데, 이러한 조건은 다른 연구 논문에서 일반적으로 a-glucoamylase의 활성을 억제하는 물질(분획물)을 탐색할 때 사용하는 조건보다 분획물의 농도는 낮았고 배양시간은 길었다. 그럼에도 불구하고, 목단피 분획물이 조건에서도 a-giucoamylase의 활성을 효율적으로 억제한다는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구에서도 인슐린 0, 1, 3, 5, 10, 25, 50, 75 ng/mL을 처리한 후 포도당 흡수 정도를 측정하였을 때 인슐린 농도가 25 ng/mL까지는 인슐린 농도가 증가함에 따라 포도당 흡수가 증가하였고, 25ng/n보다 높은 인슐린 농도에서는 세포 내로의 포도당 흡수가 인슐린 농도에 따른 차이가 없었다(Fig. 1).
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