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문제 정의
- 동시에 세포독성이 어떠한 작용기전에 의해 일어나고 있는지에 관한 연구도 필요하다. 본 연구는 기존에 암세포에 대한 세포독성이 보고 되었던 알코올 음료와 전통약주에 대한 세포독성을 비교, 검증함으로써 전통 약주가 암세포에 대한 긍정적인 효과를 갖고 있다는 중요한 근거를 제공하고 있다.
- 본 연구에서는 한국의 전통적인 발효 방법의 하나인 무증자 발효를 통해 한약재와 다른 원료를 첨가하여 제조된 전통약주와 기존에 항암활성이 보고 되어진 적포도주, 백포도주, 일본 청주, 맥주 등의 알코올 음료가 인체유래 대장암(DLD-1), 간암 (HepG2), 백혈암(K562)과 마우스 유래 유방암(EMT6)과 폐암 (LLC1) 등에서의 세포독성효과를 비교 확인하고자 하였다.
- 한국 전통약주와 기존에 암세포주에 대한 세포독성이 보고되어 있는 알코올 음료에 대한 항종양 세포독성을 비교하기 위하여 무증자 발효 방법으로 발효시키면서 한약재를 첨가한 전통 약주I과 뽕잎, 메밀 등을 첨가한 전통약주 Ⅱ, 비교 시료로 적포도주, 백포도주, 맥주, 일본 청주 등에 대하여 연구하였다. 각시료에 대하여 10-80배까지 단계적으로 희석하여 DLD-1, HepG2, K562, EMT6, LLC1 에 처리하였을 때, 인체유래 대장암 세포주인 DLD-1의 경우 적포도주에서만 강한 세포 독성이 확인되었는데, 전통약주I의 경우 그 농축액에서 DLD-1에 대하여 적포도주와 유사한 세포독성을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 의과대학 미생물학 교실에서 보유 중인 세포를 사용하였다. DLD-1은 RPMI 1640 배지 (Giboco BRL, Grand Island, NY USA) 에 10% fetal bovine serum(FBS, Giboco) 와 streptomycin(100 μg/mL), penicillin(100 U/mL), sodium bicarbonate(2.0 g/L)를첨가한 배지에서 배양하였고, K562, EMT6, LLC1 은 DMEM 배지 (Gibco) 에 10% fetal bovine serum(FBS)와 streptomycin( 100 μg/mL), penicillin(100 U/mL), sodium bicarbonate(3.7 g/L)를 첨가한 배지에 배양하였으며, HepG2는 MEM 배지에 10% FBS오+streptomycin(100 μg/mL), penicillin(100 U/mL), sodium bicarbonate(2.2 g/L)을 첨가한 배지어[서 배양하였다. 모든 세포는 37oC, 5% CO2 환경에서 배양하였다.
- 배양 종료 시 원심분리하여 상층액을 제거 하고 하층부에 DMSO 100 μL를 첨 가해 생성 된 formazan 결정을 용해시키고, 100 pL의 isopropan이을 처리하여 반응을 중지시켜 570nm에서 흡광도를 측정하였다. MTT 측정법으로 측정된 대조군과 실험군의 O.D. 값을 다음과 같이 아래의 계산식에 의해 세포독성율을 구하였다.
- 각각의 실험군은 3개의 dish를 동일 조건으로 하여 실험하였다. 배양 종료 시 원심분리하여 상층액을 제거 하고 하층부에 DMSO 100 μL를 첨 가해 생성 된 formazan 결정을 용해시키고, 100 pL의 isopropan이을 처리하여 반응을 중지시켜 570nm에서 흡광도를 측정하였다. MTT 측정법으로 측정된 대조군과 실험군의 O.
- 본 연구를 수행하는 과정에서 데이터를 보이지 않았지만 각 주류가 갖고 있는 낮은 pH에 의한 세포독성 효과와 포함되어있는 당, 알코올 등에 의한 세포독성 여부를 판정하였다. pH의 경우에는 모든 주류에서 pH 2-3의 낮은 pH를 가지고 있었지만, 시료를 모두 pH 7.
- 실험하였다. 세포를 2X105 cells/mL로 만들어 35 mm dish에서 분주한 시료를 10, 20, 40, 80배 단계적으로 희석하여 세포에 처리하고 37oC, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양 시킨 후, MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma, St. Louis, USA) 용액 1 mg/mL을각각 첨가하여 MTT가 생존 암세포의 효소작용에 의해 환원되도록 4시간 더 배양하였다. 각각의 실험군은 3개의 dish를 동일 조건으로 하여 실험하였다.
- 세포의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 각각의 세포들은 시료 처리 전과 시료 처리 후 24시간 동안 배양하면서 시험군과 대조군의 세포 모양을 광학현미경 (Carl zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였고, 여기에 장착된 카메라를 이용하여 400배율 로 사진을 찍어 비교하였다.
- 인체유래 대장암 세포주 DLD-1과 간암 세포주 HepG2의 세포 변화를 살펴보기 위하여 현미경 관찰을 실시하였다(Fig. 6 및 7). 각 10배 희석배수로 희석된 알코올 음료를 처리한 후 24시간 뒤에 나타난 결과를 살펴보면 DLD-1의 경우 적포도주에서만 세포독성이 관찰되었고, HepG2의 경우에는 전통약주I,Ⅱ, 적포도주에서만 세포독성이 관찰되었다.
- 한국 전통약주와 시판되고 있는 여러 알코올 음료에 함유되어 있는 성분들의 암세포주에 대한 세포독성을 측정하기 위하여, 각 종류의 술을 인체 유래 세포주 DLD-1, HepG2, K562와 마우스 유래 세포주 EMT6, LLC1 에 10-80배의 희석배수로 첨가하고 암세포의 살해능을 MTT방법으로 비교하였다. 세포독성은 비특이적 방어기전으로서 암세포에 직접적으로 손상을 줄뿐만 아니라 동물 생체내 림프구나 대식세포와 같이 표적 세포에 대하여 세포독성효과를 나타내는 작동세포를 자극함으로써 그 세포독성효과를 항진시킨다는 보고가 있다(24).
대상 데이터
- 실험에 사용된 세포는 인체유래 종양 세포인 DLD-1(대장암), HepG2(간암), K562(만성골수성 백혈암)을 사용하였으며, 마우스 유래 종양 세포인 EMT6(유방암), LLC1(폐암)으로 모두 연세대학교 의과대학 미생물학 교실에서 보유 중인 세포를 사용하였다. DLD-1은 RPMI 1640 배지 (Giboco BRL, Grand Island, NY USA) 에 10% fetal bovine serum(FBS, Giboco) 와 streptomycin(100 μg/mL), penicillin(100 U/mL), sodium bicarbonate(2.
데이터처리
- 모든 실험결과의 통계처리는 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 3.0)을 이용하여 세포독성율에 관한 평균값과 표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 암세포주에 대한 시료의 독성효과는 MTT colorimetric assay 방법(23)으로 실험하였다. 세포를 2X105 cells/mL로 만들어 35 mm dish에서 분주한 시료를 10, 20, 40, 80배 단계적으로 희석하여 세포에 처리하고 37oC, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양 시킨 후, MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma, St.
성능/효과
- 4에 나타낸 바와 같이 인체 유래 세포주에서와 동일하게 적포도주, 전통약주I, II에서만 강한 세포독성이 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 10배 희석배수에서는 적포도주 90.19%, 전통약주I 90.54%, 전통약주II 88.61%의 세포독성을 보여 유사한효과를 확인할 수 있었다. 하지만 20배 희석배수에서는 전통약주I 70.
- 2). 10배 희석배수에서는 적포도주, 전통약주I, II가 유사한 세포독성을 보였지만, 20배 희석배수에서는 적포도주가 40.98%의 세포 독성을 보여 전통약주Ⅰ, II보다 세포독성이 큰 것을 알 수 있으며, 전통 약주Ⅰ의 경우 20배 희석배수에서 효과가 거의 없는 것을 확인 하였다. 그러나 청주나 맥주, 백포도주에서는 세포독성의 효과가 10% 미만으로 거의 효과가 없는 것을 확인하였다.
- 나머지 4종의 암세포주에서는 10-20배 희석배수에서 적포도주, 전통 약주I, 전통약주II가 세포독성을 보였으나, 각 암세포주의 종류에따라서 세포독성은 약간씩 차이를 보였다. HepG2, K562, EMT6의 경우 10배 희석배수에서 모두 비슷한 세포독성을 보인 반면에 마우스 유래 폐암세포주인 LLC1 의 경우에는 전통 약주 I과 전통 약주 II의 세포독성이 적포도주보다 우수한 것을 확인하였다. 본 연구의 결과에 의하면 이러한 항암효과는 전통 약주에 존재하는 미지의 약리성분이 작용하는 것으로 판단되었다.
- 5에 나타내었다. MTT assay 측정 결과는 앞의 결과와 마찬가지로 10배 희석된 전통약주I, II에서만 세포독성이 강하게 나타났으며, 특이하게도 20배의 희석배수에서는 모든 시료에서 세포독성이 10% 내외로 밖에는 나타나지 않았다. 10배 희석 배수에서도 전통약주[과 전통약주Ⅱ는 86.
- pH의 경우에는 모든 주류에서 pH 2-3의 낮은 pH를 가지고 있었지만, 시료를 모두 pH 7.4로 보정하여도 세포독성의 효과에는 차이가 없었으며, 함유된 알코올에 의한 세포독성 효과가 없음을 확인하였다. 또한 인체 유래 대장암 세포주 DLD-1에 대한 청주 및 전통약주I의 농축액 실험시, 주류에 포함된 당과 동일한농도의 당을 이용한 세포독성 실험 역시 어떠한 세포독성을 관찰할 수 없었다.
- 6 및 7). 각 10배 희석배수로 희석된 알코올 음료를 처리한 후 24시간 뒤에 나타난 결과를 살펴보면 DLD-1의 경우 적포도주에서만 세포독성이 관찰되었고, HepG2의 경우에는 전통약주I,Ⅱ, 적포도주에서만 세포독성이 관찰되었다. 이러한 결과는 MTT시약을 이용한 세포독성 실험과 같은 결과임을 확인할 수 있었다.
- 백포도주, 맥주, 일본 청주 등에 대하여 연구하였다. 각시료에 대하여 10-80배까지 단계적으로 희석하여 DLD-1, HepG2, K562, EMT6, LLC1 에 처리하였을 때, 인체유래 대장암 세포주인 DLD-1의 경우 적포도주에서만 강한 세포 독성이 확인되었는데, 전통약주I의 경우 그 농축액에서 DLD-1에 대하여 적포도주와 유사한 세포독성을 확인할 수 있었다. 나머지 4종의 암세포주에서는 10-20배 희석배수에서 적포도주, 전통 약주I, 전통약주II가 세포독성을 보였으나, 각 암세포주의 종류에따라서 세포독성은 약간씩 차이를 보였다.
- 98%의 세포 독성을 보여 전통약주Ⅰ, II보다 세포독성이 큰 것을 알 수 있으며, 전통 약주Ⅰ의 경우 20배 희석배수에서 효과가 거의 없는 것을 확인 하였다. 그러나 청주나 맥주, 백포도주에서는 세포독성의 효과가 10% 미만으로 거의 효과가 없는 것을 확인하였다.
- 51%의 세포독성을 나타내는 것으로 보아, 기존에 보고 되어진 것처럼 적포도주는 강한 세포독성을 나타내고 있는 것을 알 수 있다. 그에 비해 전통약주 의 경우 10배희석배수에서 24.15%, 20배 희석배수에서 21.47%로 적포도주에 비해 3배정도 낮은 세포독성을 보였으며, 일본청주의 경우에는 10배에서는 전통약주1과 유사한 세포독성을 보이지만, 희석배수가 증가할수록 감소되는 경향을 보였다. 백포도주 역시 약 20%정도의 세포독성을 10배 희석배수에서 보였지만 그 효과가 희석배수가 증가할수록 감소하는 것을 확인하였다.
- 각시료에 대하여 10-80배까지 단계적으로 희석하여 DLD-1, HepG2, K562, EMT6, LLC1 에 처리하였을 때, 인체유래 대장암 세포주인 DLD-1의 경우 적포도주에서만 강한 세포 독성이 확인되었는데, 전통약주I의 경우 그 농축액에서 DLD-1에 대하여 적포도주와 유사한 세포독성을 확인할 수 있었다. 나머지 4종의 암세포주에서는 10-20배 희석배수에서 적포도주, 전통 약주I, 전통약주II가 세포독성을 보였으나, 각 암세포주의 종류에따라서 세포독성은 약간씩 차이를 보였다. HepG2, K562, EMT6의 경우 10배 희석배수에서 모두 비슷한 세포독성을 보인 반면에 마우스 유래 폐암세포주인 LLC1 의 경우에는 전통 약주 I과 전통 약주 II의 세포독성이 적포도주보다 우수한 것을 확인하였다.
- 이러한 결과는 MTT시약을 이용한 세포독성 실험과 같은 결과임을 확인할 수 있었다. 데이터로 보여주지 않았지만 모든 암세포에 대하여 동일한 실험을 수행하였으며, 모두 MTT assay결과와 동일한 것을 확인할 수 있었다.
- 그러나 정 등의 연구를 통하여 일본 청주가 희석배수가 1-8배 미만에서만 효과가 있었다고 보고되었다. 또한 한국 전통약주가 일상적인 음용 범위 내에서 세포에 대한 직접적인 독성이 미약하였으나, 낮은 희석배수에서도 대상 세포들의 형태 변화를 유도하는 것으로 보고하였지만, 본 실험의 결과를 보면 한국전통약주I, Ⅱ는 세포독성의 효과가 잘 알려져있는 적포도주와 거의 유사한 세포독성을 나타내었으며, 세포의 형태변화를 유도하지 않았다. 또한, 기존 보고에서 세포독성이 알려진 청주, 맥주, 백포도주의 경우에는 세포독성 효과가 미약한 것을 확인하였다.
- (25, 26). 또한, 결과로 제시하지 않았지만 일본청주와 전통약주1을 10배 감압 농축하여 DLD-1에 처리하였을 경우 전통약주1에서는 Red wine 10배 희석배수와 유사한 세포독성을 갖고 있었으며, 일본청주의 경우에는 효과가 없는 것을 확인하였다. 이는 세포독성의 효과를 나타내는 미지의 성분이 전통약주Ⅰ에 미량 존재한다는 것을 나타낸다.
- 또한 한국 전통약주가 일상적인 음용 범위 내에서 세포에 대한 직접적인 독성이 미약하였으나, 낮은 희석배수에서도 대상 세포들의 형태 변화를 유도하는 것으로 보고하였지만, 본 실험의 결과를 보면 한국전통약주I, Ⅱ는 세포독성의 효과가 잘 알려져있는 적포도주와 거의 유사한 세포독성을 나타내었으며, 세포의 형태변화를 유도하지 않았다. 또한, 기존 보고에서 세포독성이 알려진 청주, 맥주, 백포도주의 경우에는 세포독성 효과가 미약한 것을 확인하였다.
- 마우스 유래 유방암 세포주인 EMT6에 대한 세포독성효과는 Fig. 4에 나타낸 바와 같이 인체 유래 세포주에서와 동일하게 적포도주, 전통약주I, II에서만 강한 세포독성이 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 10배 희석배수에서는 적포도주 90.
- 47%로 적포도주에 비해 3배정도 낮은 세포독성을 보였으며, 일본청주의 경우에는 10배에서는 전통약주1과 유사한 세포독성을 보이지만, 희석배수가 증가할수록 감소되는 경향을 보였다. 백포도주 역시 약 20%정도의 세포독성을 10배 희석배수에서 보였지만 그 효과가 희석배수가 증가할수록 감소하는 것을 확인하였다. 맥주나 전통약주Ⅱ의 경우에는 그 효과가 10%미만으로 세포독성 효과가 미미하였다.
- 42%로 전통약주I의 세포독성이 가장 강한 것을 알 수 있었다. 백포도주, 일본청주, 맥주의 경우 희석배수 10배에서 각각 19.42%, 11.70%, 17.30%의 세포독성을 보여 유방암 세포주에서 미약하지만 세포독성을 갖고 있는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 20배 이후의 희석배수에서는 그 효과가 거의 없었다.
- HepG2, K562, EMT6의 경우 10배 희석배수에서 모두 비슷한 세포독성을 보인 반면에 마우스 유래 폐암세포주인 LLC1 의 경우에는 전통 약주 I과 전통 약주 II의 세포독성이 적포도주보다 우수한 것을 확인하였다. 본 연구의 결과에 의하면 이러한 항암효과는 전통 약주에 존재하는 미지의 약리성분이 작용하는 것으로 판단되었다.
- 3과 같다. 위의 실험 결과와 유사하게 적포도주, 전통약주I, Ⅱ의 10배 희석배수에서 세포독성이 적포도주 90.48%, 전통약주] 91.26%, 전통 약주 II 88.61%로 매우 강한 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다. 하지만 20배 희석배수에서는 적포도주가 59.
- 8g/L)에 의한 것으로 보고되고 있다(11). 자체측정 결과 전통약주I의 경우 약 30-40mg/ L, 전통약주Ⅱ의 경우 약 100-120mg/L로 적포도주에 비해 적은 양의 polyphen이을 함유하고 있고, 전통약주보다 많은 양의 polyphen이을 함유하고 있는 백포도주(200-300 mg/L)가 전혀 세포 독성을 나타내지 못하는 것으로 확인되었기 때문에, 전통 약주의 항종양 세포독성의 경우 함유된 polyphen이의 효과보다는 전통 약주I과 Ⅱ에 함유된 여러가지 성분과 발효과정에서 생성되는 각 시료에 공통적으로 함유된 성분이 항종양 효과를 유도해 낸 것으로 사료된다.
- 61%로 매우 강한 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다. 하지만 20배 희석배수에서는 적포도주가 59.46%, 전통 약주 I 34.01%, 전통약주II 54.06%의 세포독성을 보여 적포도주와 전통약주II가 유사한 세포독성을 보이고, 전통약주I이 다른 두 시료보다 약한 세포독성을 나타내는 것을 알 수 있다. K562에서도 역시 청주, 맥주 및 백포도주에서 10% 내외의 미약한 세포독성만이 확인되었다.
- 61%의 세포독성을 보여 유사한효과를 확인할 수 있었다. 하지만 20배 희석배수에서는 전통약주I 70.15%, 전통약주II 63.24%, 적포도주 40.42%로 전통약주I의 세포독성이 가장 강한 것을 알 수 있었다. 백포도주, 일본청주, 맥주의 경우 희석배수 10배에서 각각 19.
후속연구
- 필요로 한다. 계속되는 연구를 통해 우선 한국 전통 약주의 성분들을 분획하여 앞서 언급한 효과들에 효과가 있는 성분을 분석하여야 할 것이다. 동시에 세포독성이 어떠한 작용기전에 의해 일어나고 있는지에 관한 연구도 필요하다.
- 이러한 전통약주가 갖는 약리적인 효과를 분명하게 입증하기 위해서는 보다 체계적이고 광범위한 실험을 통한 구체적인 자료를 필요로 한다. 계속되는 연구를 통해 우선 한국 전통 약주의 성분들을 분획하여 앞서 언급한 효과들에 효과가 있는 성분을 분석하여야 할 것이다.
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