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문제 정의
- 9 와 같이 지름 80 mm, 두께 3 mm 로 제작되었고 3 mm X 3 mm 면적에 미세격자가 형성되었다. 몰드 표면에 이러한 미세격자를 모두 12 곳에 형성하여 세포 계수 결과의 편차를 줄이고자 하였다.
- 본 연구에서는, 미세 격자가 형성된 배양 접시를 제작하고 그 접시로 세포를 배양하면서 계수하여, 기존의 헤모사이토미터 사용 과정에서 내포되는 세포의 오염 가능성을 최소화하고 계수작업 효율을 높일 수 있는 새로운 방법을 제안한다.
제안 방법
- 3 pm 로 얇고 금속층 아래에 폴리머가 있어서 압력과 고온에 취약한 구조적인 문제 때문에 반복 사용이 어려웠다. 그러므로, 강도가 높고 반복 사용하기에 적합한 니켈로 몰드를 다시 제작하기로 하였다.
- 또한, 배양액 속을 떠다니며 자라는 S叩T1 세포(human lymphoma cell)와 바닥에 붙어서 자라는 HeLa 세포 (cervical carcinoma cell) 두 종류를 배양하면서 계수하여 본 연구에서 제안한 방법을 검증하였다.
- 몰드 제작은 실리콘 웨이퍼를 기판으로 하는 방법과, 두께 3 mm 의 니켈을 기판으로 하는 두 가지 방법으로 제작하였다. 첫 번째 방법은, 미세격자의 몰드 제작 가능성을 확인하기 위해, 두 번째 방법은, 실리콘 웨이퍼 몰드의 문제점을 보완하기 위해 제작하였다.
- 미세 격자 구조물 제작을 위해 SU-8 을 2 urn 높이로 스핀 코팅하고 패터닝하였다. 티타늄(titanium)을 0.
- 미세 격자가 전사된 세포 배양 접시에 세포를 배양하고 격자를 이용해서 계수하는 실험을 수행하였다. 핫 엠보싱 공정 후, 에탄올 (70 %)로 배양 접시를 세척하여 세포의 생장에 유해할 수 있는 미생물에 대해 살균처리 하였고 poly-L-lysine 에 적셔서 부착 세포의 생장에 도움이 되도록 하였다.
- 배양 접시를 에탄올 (70 %)로 소독하고 poly-L-lysine 으로 표면을 적셔서 세포의 부착성을 높인 후, 부양 세포인 SupTl 세포와 고착 세포인 HeLa 세포 두 종류를 이산화탄소 배양기에서 3~4 일간 배양하면서 계수 실험을 수행하였다. 계수 과정에서, 세포의 생장에 유해한 영향을 미치지 않았으며, 계수를 한 후에도 배양을 계속할 수 있었다.
- 본 연구를 통해, 높이 2 pm, 폭 2 gm, 가로세로의 길이가 50 gm 인 미세 격자 구조물이 3 mm X 3 mm 면적에 배열되어 있는 실리콘 웨이퍼 몰드와 니켈 몰드 (지름 80 mm, 높이 3 mm)를 제작하였고, 핫 엠보싱으로 polystyrene 재질의 세포 배양 접시에 미세 격자를 전사하였다.
- 본 연구에서는, 실제 헤모사이토미터와 동일한 크기와 형상의 미세 격자를 몰드로 제작하였고, 지 름 85 mm 인 polystyrene 재질의 세포 배양 접 시 (Falcon, USA) 에 핫 엠보싱으로 미세 격자를 전사하였다. 또한, 배양액 속을 떠다니며 자라는 S叩T1 세포(human lymphoma cell)와 바닥에 붙어서 자라는 HeLa 세포 (cervical carcinoma cell) 두 종류를 배양하면서 계수하여 본 연구에서 제안한 방법을 검증하였다.
- 5와 같은 공정순서로 제작하였다. 우선, 500 μ m 두께의 4” 실리콘 워]이퍼에 양성 (positive) 폴리머 감광재(AZ5214, Clariant, Switzerland)# 1.4 |im 두께로 스핀 코팅하고 UV 노광을 하여, 폭 2 pm, 가로세로 길이 50wn 인 미 세 격 자를 패 터 닝 하였다.
- 이어서 에탄올로 소독하고, 세포의 부착성을 향상시킬 목적으로 poly-L-lysine (Sigma-Aldrich, USA) 에 접시를 적셔서 얇은 막을 코팅하였다(Fig. 5B).
- 방법으로 제작하였다. 첫 번째 방법은, 미세격자의 몰드 제작 가능성을 확인하기 위해, 두 번째 방법은, 실리콘 웨이퍼 몰드의 문제점을 보완하기 위해 제작하였다.
- 핫 엠보싱 공정 후, 에탄올 (70 %)로 배양 접시를 세척하여 세포의 생장에 유해할 수 있는 미생물에 대해 살균처리 하였고 poly-L-lysine 에 적셔서 부착 세포의 생장에 도움이 되도록 하였다.
대상 데이터
- 니켈 몰드 제작 공정도는 Fig. 7과 같이 실리콘 웨이퍼 몰드 제작 과정과 유사하지만, 금속 증착과정에서 발생하는 열변형이 AZ5214 보다 작아서 정교한 격자 구조물 제작에 유리한, SU-8(Microchem, USA) 음성(negative) 폴리머 감광재를 사용하였다.的
- 4와 같다. 미세 격자를 몰드로 제작하고, 핫엠보싱으로 몰드와 배양 접시를 압착하여, 격자를 형성한다. 그리고 나서, 표면을 에탄올로 소독해서 오염 미생물을 제거하고 세포의 부착성을 높이는 약품을 처리한다.
- 스핀 코팅하고 패터닝하였다. 티타늄(titanium)을 0.3 μm 두께로 SU-8 구조물 표면에 증착한 후 니켈을 3 mm 두께로 전기도금 하였다. 실리콘 증을 tetramethyl ammonium hydroxide (TMAH, wt.
성능/효과
- 계수 과정에서, 세포의 생장에 유해한 영향을 미치지 않았으며, 계수를 한 후에도 배양을 계속할 수 있었다.
- 본 연구에서 제안한, 미세 격자 몰드를 제작하고, 세포 배양 접시에 전사하여, 세포를 배양하는 도중에 계수하는 방법은, 기존의 헤모사이토미터를 이용한 방법에 비해 세포의 추출과 주입 단계를 생략하여 세포의 오염 가능성을 최소화하고 계수에 소요되는 시간을 줄일 수 있었다. 또한, 핫 엠보싱을 이용하므로 대량 생산이 가능하고 기존의 세포 배양 접시제조 과정에도 쉽게 적용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 셋째, PDMS 시트에 미세 격자를 전사하였으나 실제 사용에서는 물속에서 격자가 잘 보이지 않는 어려움이 있었다. PDMS 를 이용한 몰드 캐스팅 방법은 상온에서 적용이 가능한 장점이 있으므로, PDMS 시트에 적당한 물질을 코팅함으로써 격자가 물속에서도 보일 수 있도록 하는 방법의 개발이 요구된다.
- 실리콘 웨이퍼 몰드의 제작, 핫 엠보싱에 의한 미세 격자의 전사, 그리고 5 절의 세포 배양 결과로부터, 본 연구에서 제안한 방법에 의해 효과적으로 세포 계수가 가능함을 확인하였다. 하지만, 실리콘 웨이퍼는 두께가 500 gm 정도로 얇아서 취급하기가 어렵고 부서지기 쉬운 재질의 특성 때문에 몰드로 사용하기에는 적합하지 않았다.
- 계수를 할 수 있었다. 이로부터, 본 연구에서 제안한 방법이 효과적임을 알 수 있었다. 하지만, 3.
후속연구
- 둘째, polystyrene 재질의 세포 배양 접시에 미세격자가 보다 선명하게 전사되도록 하기 위해 핫엠보싱 공정 변수인 온도, 압력, 그리고 시간을 최적화해야 한다.
- 13(b)] 평면에 비해 격자가 가지는 요철 형상이 영하을 미치는 것으로 추정되며, 이를 이용하면 바닥면에 임의로 생성한 패턴의 형상대로 세포를 배양할 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 인공 피부 제작과 같이 세포가 일정한 방향성을 유지하면서 생장하도록 하는 용도에 응용할 수 있을 것으로 판단된다
- 수 있었다. 또한, 핫 엠보싱을 이용하므로 대량 생산이 가능하고 기존의 세포 배양 접시제조 과정에도 쉽게 적용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 그러므로, 헤모사이토미터 사용의 장점인 신속한 작업과 저렴한 비용을 유지하면서, 단점인 세포의 오염과 계수 오차 가능성을 줄일 수 있다. 제안된 방법을 실현하기 위해서는, 배양 접시에 미세 격자를 형성하는 과정이 선행되어야 하고 이로 인해 세포의 생장에 유해한 영향을 주지 않아야 하는 조건을 동시에 만족해야 한다. 아울러, 현미경 관찰시에 동일한 초점 높이에 위치해야 한다.
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