나노 바이오산업의 발전과 더불어 세포 성장 과정에서 발견되는 세포의 이동, 분열, 통합, 아포토시스(apoptosis), 모양 변형, 세포들 간의 상호 작용 등을 포함하는 세포의 행동을 분석하기 위한 자동화된 시스템의 개발은 매우 중요하다. 본 연구에서는 세포 배양 과정에서 광학현미경을 통해 얻은 세포의 실시간 이미지들의 변화/변형 과정을 2D 또는 3D 분석 하기위한 전처리 방법과 세포와 클러스터(둘 이상의 세포의 결합)를 자동 식별하기 위한 방법, 시간의 흐름에 따라 변화되는 세포와 클러스터의 개수를 계수하기 위한 방법을 제시한다. 제안된 방법들은 30분 간격으로 촬영한 3T3 세포 배양 이미지들을 이용하여 실험하였으며 세포 및 클러스터를 분류하고 각각의 개수를 자동계수한 결과 평균 99.8%의 정확도를 보여 주었다.
나노 바이오산업의 발전과 더불어 세포 성장 과정에서 발견되는 세포의 이동, 분열, 통합, 아포토시스(apoptosis), 모양 변형, 세포들 간의 상호 작용 등을 포함하는 세포의 행동을 분석하기 위한 자동화된 시스템의 개발은 매우 중요하다. 본 연구에서는 세포 배양 과정에서 광학현미경을 통해 얻은 세포의 실시간 이미지들의 변화/변형 과정을 2D 또는 3D 분석 하기위한 전처리 방법과 세포와 클러스터(둘 이상의 세포의 결합)를 자동 식별하기 위한 방법, 시간의 흐름에 따라 변화되는 세포와 클러스터의 개수를 계수하기 위한 방법을 제시한다. 제안된 방법들은 30분 간격으로 촬영한 3T3 세포 배양 이미지들을 이용하여 실험하였으며 세포 및 클러스터를 분류하고 각각의 개수를 자동계수한 결과 평균 99.8%의 정확도를 보여 주었다.
With growth of nano-bio industry, it is of significant importance to develop an automated system to exploit cell behaviors, including migration, mitosis, apoptosis, shape deformation of individual cells and their interactions among cells in the process of cell growth. In this paper, we proposed prep...
With growth of nano-bio industry, it is of significant importance to develop an automated system to exploit cell behaviors, including migration, mitosis, apoptosis, shape deformation of individual cells and their interactions among cells in the process of cell growth. In this paper, we proposed preprocessing techniques, a classification method which classifies clusters (overlapping multiple cells) from cells and an automated method which counts the number of cells and clusters in order to analyze 2D or 3D deformations of the cells in the real-time images from microscope in the cell culture. We conducted the 3T3 cell images taken from each thirty-minute interval. It showed the average 99.8% accuracy automatically for separating cells and clusters.
With growth of nano-bio industry, it is of significant importance to develop an automated system to exploit cell behaviors, including migration, mitosis, apoptosis, shape deformation of individual cells and their interactions among cells in the process of cell growth. In this paper, we proposed preprocessing techniques, a classification method which classifies clusters (overlapping multiple cells) from cells and an automated method which counts the number of cells and clusters in order to analyze 2D or 3D deformations of the cells in the real-time images from microscope in the cell culture. We conducted the 3T3 cell images taken from each thirty-minute interval. It showed the average 99.8% accuracy automatically for separating cells and clusters.
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문제 정의
본 연구에서는 수 천 개 혹은 수 만개의 작은 세포 이미지로부터 세포의 개수를 계수하기 위해 광학현미경으로부터 얻은 이미지를 전처리 작업하기 위한 적절한 방법을 제안한다. 또한 정확한 세포 계수가 이루어지기 위해서는 세포 및 클러스터 분류가 정확히 이루어져야 된다는 것에 착안하여 세포의 모양에 따라 세포와 클러스터를 분류하기 위한 방법을 제시한다. 앞선 논문들에서 제시한 방법과의 차이점은 본 논문에서 제시한 방법은 세포나 클러스터의 모양을 이용하여 세포의 크기가 매우 작게 나타나는 세포들로 구성된 이미지에서도 자동 세포 계수가 가능하다는 것이다.
본 연구에서는 수 천 개 혹은 수 만개의 작은 세포 이미지로부터 세포의 개수를 계수하기 위해 광학현미경으로부터 얻은 이미지를 전처리 작업하기 위한 적절한 방법을 제안한다. 또한 정확한 세포 계수가 이루어지기 위해서는 세포 및 클러스터 분류가 정확히 이루어져야 된다는 것에 착안하여 세포의 모양에 따라 세포와 클러스터를 분류하기 위한 방법을 제시한다.
하지만 각 프레임 당 수 천 혹은 수 만개에 해당되는 세포의 개수를 일일이 계수하는 것은 매우 소모적인 작업일뿐더러 많은 시간이 소모된다. 본 연구에서는 이러한 작업을 소프트웨어적으로 해결하기 위해 자동화된 세포 분석기를 개발하였다.
제안 방법
이미지로부터 추출한 클러스터 모양에서 단순세포와 클러스터를 구분할 수 있는 중요한 정보는 오목 정점이다. 따라서 본 연구에서는 단순 세포와 클러스터의 구분을 오목 정점의 유무로 결정하였으며 사용한 알고리즘은 다음과 같다.
모양 추출을 통해 이미지 정보는 벡터 형태의 정보로 변환된다. 모폴로지 열림 연산까지 수행된 이미지에 대해 외곽선 추적 작업을 수행하여 모양 정보를 추출하였다. 검출된 외곽선은 단순 세포와 클러스터를 나타내는 타원이나 다각형의 형태로 나타난다.
본 연구에서는 단순 세포와 클러스터를 구분하기 위해 다각형의 오목 정점(concave point)을 사용하게 된다. 따라서 타원이나 다각형을 구성하는 경계선(contour)이 울퉁불퉁하면 잘못된 오목 정점을 선택하는 오류가 발생하게 된다.
제안된 알고리즘이 어느 정도 정확하게 단순 세포와 클러스터를 구분하여 계수할 수 있는지 성능을 실험하기 위해 사용한 데이터는 쥐의 3T3 세포의 배양과정에서 30분 간격으로 촬영한 광학현미경 이미지들이다. 연속된 여덟 개의 이미지에 대해 제안한 전처리 작업과 단순세포와 클러스터 구분하고 계수하기 위한 알고리즘을 적용하였다. 모든 알고리즘은 Visual C++로 구현하였으며 실험은 HP xw8600 Workstation에서 수행되었다.
세 번째 전처리 과정은 그림 4의 (c)의 사각형 안에 표시된 것과 같이 나타나는 아포토시스된 세포들을 제거하는 것이다. 이를 위해 모폴로지 열림 연산(morphology open)을 수행하였다. 열림 연산의 경우 가는 선들을 제거하여 퇴화된 세포들을 제거하는 작업도 수행해 줄 뿐 아니라 세포 외곽선의 매끄럽지 못한 모양들을 다듬어 주는 역할도 수행한다.
이를 줄이기 위해 전처리 마지막 단계로 다각형 대략화(polygon approximation) 작업을 수행하여 다각형을 매끄럽게 만드는 작업을 수행하였다. 그림 5 (b)는 다각형 대략화 작업까지 수행하여 모든 전처리 작업을 마친 결과를 보여준다.
첫째, 잡음을 제거하고 컬러이미지를 이진 이미지로 변환하였다. 이진 이미지로의 변환 과정에서 세포 이미지를 명확하게 보기 위해 배경색을 흰색으로, 세포를 나타내는 형광물질은 검은색으로 변경하였다. 이진화 작업은 촬영할 때의 불균일한 조명으로 인해 단일 임계값 사용으로는 좋은 결과가 나오지 않아 영상 히스토그램을 이용하여 적응적(adaptive) 임계값을 자동 계산하였다.
이진 이미지로의 변환 과정에서 세포 이미지를 명확하게 보기 위해 배경색을 흰색으로, 세포를 나타내는 형광물질은 검은색으로 변경하였다. 이진화 작업은 촬영할 때의 불균일한 조명으로 인해 단일 임계값 사용으로는 좋은 결과가 나오지 않아 영상 히스토그램을 이용하여 적응적(adaptive) 임계값을 자동 계산하였다. 그림 3은 그림 1 (a)의 이미지에 대해 잡음을 제거하고 이진 이미지로 변환한 결과이다.
첫째, 잡음을 제거하고 컬러이미지를 이진 이미지로 변환하였다. 이진 이미지로의 변환 과정에서 세포 이미지를 명확하게 보기 위해 배경색을 흰색으로, 세포를 나타내는 형광물질은 검은색으로 변경하였다.
대상 데이터
기존의 연구에서 사용하는 이미지들은 그림 1의 (b)와 같이 세포가 타원과 유사한 모양이 될 때까지 충분히 확대한 이미지들을 사용하였다. 하지만 본 연구에서는 그림 1의 (a)와 같이 수 천 개 혹은 수만개의 세포 이미지를 분석하기 위해 매우 작게 촬영한 세포 이미지를 대상으로 한다.
제안된 알고리즘이 어느 정도 정확하게 단순 세포와 클러스터를 구분하여 계수할 수 있는지 성능을 실험하기 위해 사용한 데이터는 쥐의 3T3 세포의 배양과정에서 30분 간격으로 촬영한 광학현미경 이미지들이다. 연속된 여덟 개의 이미지에 대해 제안한 전처리 작업과 단순세포와 클러스터 구분하고 계수하기 위한 알고리즘을 적용하였다.
데이터처리
단순 세포는 연한 선으로 클러스터는 진한 선으로 표시하였다. 알고리즘의 수행 결과와 전문가의 수작업에 의한 세포 및 클러스터 구분 결과와 비교하였다. 표 1은 논문에서 제시한 알고리즘 수행 결과와 전문가 분석을 비교한 결과이다.
이론/모형
그림 5 (b)는 다각형 대략화 작업까지 수행하여 모든 전처리 작업을 마친 결과를 보여준다. 다각형 대략화 작업은 Kolesnikov 등이 제안한 방법을 사용하였다[6].
본 연구에서는 모폴로지 팽창 연산과 level set 방법의 단점을 해결할 수 있는 flood fill 알고리즘을 사용하였다. Flood Fill 알고리즘의 경우 채워야 할 영역이 클 경우 수행속도의 비효율성 문제가 발생할 수 있지만 본 연구에서 사용한 작은 크기의 세포 이미지에 대한 구멍은 채워야 되는 영역이 작기 때문에 비효율성의 문제는 발생하지 않았다.
성능/효과
8%였다. 따라서 세포와 클러스터를 구분하기 위해본 연구에서 제안한 방법은 매우 안정적인 알고리즘이라 할 수 있다.
또한 정확한 세포 계수가 이루어지기 위해서는 세포 및 클러스터 분류가 정확히 이루어져야 된다는 것에 착안하여 세포의 모양에 따라 세포와 클러스터를 분류하기 위한 방법을 제시한다. 앞선 논문들에서 제시한 방법과의 차이점은 본 논문에서 제시한 방법은 세포나 클러스터의 모양을 이용하여 세포의 크기가 매우 작게 나타나는 세포들로 구성된 이미지에서도 자동 세포 계수가 가능하다는 것이다.
3% 정도로 무시할 수 있는 수준이다. 여덟 개의 이미지들에 대한 분류 오류는 평균 0.188이므로 제안한 알고리즘의 정확도는 약 99.8%였다. 따라서 세포와 클러스터를 구분하기 위해본 연구에서 제안한 방법은 매우 안정적인 알고리즘이라 할 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
자동화된 세포 분석은 무엇인가?
자동화된 세포 분석은 일정한 시간 간격으로 광학현미경을 통해 얻은 세포 이미지들로부터 세포의 변화 과정을 관찰하여 각 단계마다 세포의 특징들을 분석하고 세포들이 어떻게 변화되어 가는지 자동적으로 세포의 행동들을 추적하고 분석하는 것이다[1-5]. 배양과정에서 세포는 시간이 경과함에 따라 새롭게 나타나기도, 죽기도 하며 한 개 이상의 세포가 부분적으로 겹쳐서 생성되는 클러스터(cluster)를 만들기도 하고 클러스터는 다시 여러 개의 세포로 분리되기도 한다.
세포 분석에서 현재 가장 광범위하게 요구되는 기능 중 하나는 무엇인가?
세포 분석에서 현재 가장 광범위하게 요구되는 기능 중의 하나가 각 단계에서 발견되는 세포의 개수를 세는 것이다. 예를 들어, 암 세포에 방사선 치료나 화학 요법을 적용한 후 살아 있는 암 세포의 개수를 분석하는 것은 꼭 필요한 작업 중 하나이다.
컬러 이미지에 대한 주성분분석법과 히스토그램 분석 등에 의존한 자동 세포 계수 방법의 문제점은 무엇인가?
컬러 이미지에 대한 주성분분석법(PCA, Principal Component Analysis)과 히스토그램 분석 등에 의존한 자동 세포 계수 방법이 Constantinose 등에 의해 제시되었다. 이 방법은 세포 인식과 클러스터 분리를 위해 경험적 임계값에 과도하게 의존하고 있어 임계값이 잘못된 경우 에러율이 높아지는 문제점이 있다[2].
참고문헌 (7)
Ryoma Bise et al., "Reliable Tracking Partially Overlapping Neural Stem Cells in DIC Microscopy Image Sequences," MICCAI Workshop on Optical Tissue Image analysis in Microscopy, Histopathology and Endoscopy Imperial College London, pp. 67-77, September 2009.
Constantinos G. Loukas et al, "An Image Analysis-Based Approach for Automated Counting of Cancer Cell Nuclei in Tissue Sections," Cytometry Part A, Volume 55A, Issue 1, pp. 30-42, September 2003.
Geisa M. Faustino et al, "Automatic embryonic stem cells detection and counting method in fluorescence microscopy images," ISBI'09 Proceedings of the Sixth IEEE international conference on Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, 2009.
C. D. Ruberto et al. "Segmentation of Blood Images using Morphological Operators", ICPR, Volume 3, pp. 397-400, 2000.
H. Refai et al. "Automatic count of hepatocytes in microscopic images", ICIP, IEEE, Volume: 2, pp. II-1101-4, 2003.
Alexander Kolesnikov et al, "Polygonal approximation of closed discrete curves," Journal Pattern Recognition, Volume 40, Issue 4, 2007.
Michael J. Laszlo, Computational Geometry and Computer Graphics in C++, Prentice Hall, 1996.
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