현재 국내 사용중이며 내분비계 장애추정농약으로 분류된 benomyl, carbaryl, endosulfan등 17종 농약에 대한 estrogen성 영향을 검색하기 위하여 인체난소암세포(BG1Luc4E2)를 이용한 luciferase assay를 수행하였으며, luciferase assay에서 Eeq를 산출한 후 내분비계 장애추정 농약의 에스트로겐성 영향에 대한 식이섭취 위험도 평가를 실시하였다. Estrogen 수용체 결합시험에서 cypermethrin, dicofol, endosulfan, esfenvalerate 및 fenvalerate가 $10^{-5}$ M에서 최고 영향이 관찰되었고, mancozeb 등 8종 농약은 약한 영향이 관찰되었으며, benomyl 등 나머지 4종 농약은 영향이 없었다. 이들 중 활성이 비교적 강한 dicofol 및 endoeulfan의 1 nmol 17 $\beta$-estradiol에 대한 RLP 와 RLU는 dicofol의 경우 $10^{-5}$ 및 56%이었구, endosulfan은 $10^{-5}$ 및 72%이었다. MRL을 이용한 식이섭취 위험도 평가 결과 농약들의 추청 1일 최대농약섭취량은 cypermethrin 0.667, dicofol 0.1462, endosulfan 0.2066 및 lenvalerate/esfenvalerate 0.2098 mg/person으로 총 추정 1일 최대 농약섭취량이 1.2298 mg/person이었고, 남성 혈중 에스트로겐 증가 농도는 3.075 ng/L로 정상농도에 비해 15%정도 증가하였으나, 국내 모니터링 성적을 기준으로 평가한 결과 남성혈중 에스트로겐 증가 농도는 0.01938 ng/L로 정상농도에 비해 0.09693%정도 증가하였다.
현재 국내 사용중이며 내분비계 장애추정농약으로 분류된 benomyl, carbaryl, endosulfan등 17종 농약에 대한 estrogen성 영향을 검색하기 위하여 인체난소암세포(BG1Luc4E2)를 이용한 luciferase assay를 수행하였으며, luciferase assay에서 Eeq를 산출한 후 내분비계 장애추정 농약의 에스트로겐성 영향에 대한 식이섭취 위험도 평가를 실시하였다. Estrogen 수용체 결합시험에서 cypermethrin, dicofol, endosulfan, esfenvalerate 및 fenvalerate가 $10^{-5}$ M에서 최고 영향이 관찰되었고, mancozeb 등 8종 농약은 약한 영향이 관찰되었으며, benomyl 등 나머지 4종 농약은 영향이 없었다. 이들 중 활성이 비교적 강한 dicofol 및 endoeulfan의 1 nmol 17 $\beta$-estradiol에 대한 RLP 와 RLU는 dicofol의 경우 $10^{-5}$ 및 56%이었구, endosulfan은 $10^{-5}$ 및 72%이었다. MRL을 이용한 식이섭취 위험도 평가 결과 농약들의 추청 1일 최대농약섭취량은 cypermethrin 0.667, dicofol 0.1462, endosulfan 0.2066 및 lenvalerate/esfenvalerate 0.2098 mg/person으로 총 추정 1일 최대 농약섭취량이 1.2298 mg/person이었고, 남성 혈중 에스트로겐 증가 농도는 3.075 ng/L로 정상농도에 비해 15%정도 증가하였으나, 국내 모니터링 성적을 기준으로 평가한 결과 남성혈중 에스트로겐 증가 농도는 0.01938 ng/L로 정상농도에 비해 0.09693%정도 증가하였다.
The present study was conducted to test and evaluate estrogenic effect of 17 pesticides including benomy1 and carbaryl, being suspected as endocrine disrupting chemicals. For estrogenic effect examination, luciferase assay were achieved with human ovarian cancer cell, BG1Luc4E2. Estrogenic effects o...
The present study was conducted to test and evaluate estrogenic effect of 17 pesticides including benomy1 and carbaryl, being suspected as endocrine disrupting chemicals. For estrogenic effect examination, luciferase assay were achieved with human ovarian cancer cell, BG1Luc4E2. Estrogenic effects of cypermethrin, dicofol, endosulfan, esfenvalerate, and fenvalerate were observed at the concentration of $10^{-5}$ M by estrogen receptor binding assay. Relative luciferase potency and relative luciferase effects compared with $10^{-10}$ M 17 $\beta$-estradiol were $10^{-5}$, 56% for dicofol, and $10^{-5}$, 72% for endosulfan, respectively. Estimated maximum daily intake for pesticides was calculated from maximum residue limit of agricultural commodity and food consumption was 1.2298 mg/person. Theoretically calculated blood estrogen level from dietary intake for pesticides based on MRL in Korea, 3.075 ng/L was equivalent to 15% of estrogen concentration in normal blood, but practical monitoring data, 0.01938 ng/L was equal to 0.09693% of estrogen concentration in normal blood.
The present study was conducted to test and evaluate estrogenic effect of 17 pesticides including benomy1 and carbaryl, being suspected as endocrine disrupting chemicals. For estrogenic effect examination, luciferase assay were achieved with human ovarian cancer cell, BG1Luc4E2. Estrogenic effects of cypermethrin, dicofol, endosulfan, esfenvalerate, and fenvalerate were observed at the concentration of $10^{-5}$ M by estrogen receptor binding assay. Relative luciferase potency and relative luciferase effects compared with $10^{-10}$ M 17 $\beta$-estradiol were $10^{-5}$, 56% for dicofol, and $10^{-5}$, 72% for endosulfan, respectively. Estimated maximum daily intake for pesticides was calculated from maximum residue limit of agricultural commodity and food consumption was 1.2298 mg/person. Theoretically calculated blood estrogen level from dietary intake for pesticides based on MRL in Korea, 3.075 ng/L was equivalent to 15% of estrogen concentration in normal blood, but practical monitoring data, 0.01938 ng/L was equal to 0.09693% of estrogen concentration in normal blood.
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문제 정의
그러나 본 연구에서는 세포의 분열을 비교한 것이 아니고 luciferase의 활성을 비교하였으므로 RLP 및 RLE로 표현하여 평가하였다.
따라서 본 연구에서는 국내 사용중이며, 내분비계 장애 추정 농약으로 분류된 benomyl, carbaryl, endosulfan 등 17종 농약에 대한 에스트로겐성 영향을 평가하기 위해 인체난소암세포(BGlluo4E2)를 이용한 luciferase assay (Rogers와 Denison, 2000)를 수행하였고, 내분비계 장애추정농약의 에스트로겐성 영향에 대한 식이 섭취 위험도평가(Shaw와 McCuUy, 2002)를 추정최대일일섭취량(EMDI, estimated maximum daily intake) 을 산출하여 평가한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
조건하에서 배양하였다. Luciferase 활성 검색은 배양된 세포를 24 weU 검색용 배양 플레이트에 weU 당 1×104, 세포를 5% dextran-coated charcoal로 처리된 FBS (Hyclone, USA)와 페놀레드가 없는 estrogen- stripped media(ESM, Sigma)에 접종한 후 7일 동안 매일 배지를 교환하면서 90% confluence가 되었을 때 시험물질을 24시간 동안 처리하여 시험하였다. 시험물질 처리시 용매의 농도는 배지의 0.
Soto와 Carlos(1985)가 E-screen에 의한 결과를 평가할 때 사용한 방법으로 합성 에스트로겐인 17 β -estradiol의 최고활성을 보일 때를 기준으로 하여 시험물질의 농도와 비교할 때는 relative proliferation potency(RPP)로, 그리고 최고 활성의 세기를 비교할 때는 relative proliferation effect(RPE)로 비교하여 평가하였다. 그러나 본 연구에서는 세포의 분열을 비교한 것이 아니고 luciferase의 활성을 비교하였으므로 RLP 및 RLE로 표현하여 평가하였다.
2002). 농약의 추정최대일일농약섭취량(EMDI, estimated maximum daily intake)을 국민 평균 식품 섭취량과 MRL을 이용하여 산출하고, 독성 시험으로부터 얻은 최대 활성농도와 17 Gestiadiol의 최고 활성농도의 차이로부터 E.eq(estrogen equivalent index)를 산출하여 남자 혈액 중 에스트로겐 농도와 비교하여 위해성을 평가하였다. 평가식과 관련인자는 다음과 같다.
감소하는 경향을 보였다. 따라서 17 β-estradiol 의 최대 활성농도인 10-10M을 RLP로, 2,500 RLU/mg piotein 을 RLE 로 설정하였다. 반면 dicofol 및 endosulfan의 RLP는 모두 10-5M이었고, RLE는 최고 활성이 1,400 및 1,800 RLU/mg protein으로 각각 56 및 72%였다.
에스트로겐성 활성조사를 위해 BGlLuc4E2 세포를 a-MEM배지에서 3〜5일간 37℃, 5% CO2 및 상대습도 85% 조건하에서 배양하였다. Luciferase 활성 검색은 배양된 세포를 24 weU 검색용 배양 플레이트에 weU 당 1×104, 세포를 5% dextran-coated charcoal로 처리된 FBS (Hyclone, USA)와 페놀레드가 없는 estrogen- stripped media(ESM, Sigma)에 접종한 후 7일 동안 매일 배지를 교환하면서 90% confluence가 되었을 때 시험물질을 24시간 동안 처리하여 시험하였다.
1%를 초과하지 않도록 하였으며, 시험물질이 처리된 세포는 배지를 제거하고 phosphate buffer saline (PBS) 으로 씻은 후 100 uL의 lysis buffer (Promega, USA)로 세포를 용해한 다음 세포를 수거하고 원심분리하였다. 용해액 50 uL에 50 uL 의 luciferase reagent (Promega, USA) 를 첨가하여 Luminometer (MicroLumat plus LB 96V, Berthold Germany)를 이용하여 delay time 10 초, integration time 5초의 시험조건에서 측정하였다.
대상 데이터
Sigma chemical Co.(USA)로부터 구입하였으며, 에스트로겐 수용체 결합유전자 함유 BGILuc 4E2(인체난소암 세포)세포는 캘리포니아 대학 환경 독성 과에 재직중인 Denison 박사로부터 분양받아 사용하였다(표 1.).
배양배지인 a-Minimum Essential Medium(a-MEM), fetal bovine serum(FBS) 등 배양배지는 Gibco BRL (UK)로부터 구입하여 사용하였다.
이론/모형
세포 용해액 중 단백질함량은 단백질 표준물질로 bovine serum albumin(BSA)를 사용하여 Bradford 법으로 측정하였다. 20 uL 시험물질과 50 uL Biorad assay Kit 를 첨가하고 증류수로 량을 조절하여 Multiskan Spectrum(Thermo Labsystems, Finland)을 이용하여 490 nm에서 측정하였다.
성능/효과
eq를 각각 10-5으로 산출하였다. Dicofol과 endosulfan 등 5종 농약의 국내 등록농산물에 대해 설정된 농약잔류허용기준과 1일 식품 섭취량으로부터 추정최대일일농약섭취량을 산출하였는데, 그 결과는 표 2에서 보는 바와 같이 cyper-methriii은 감자, 고추, 사과 배추 둥 8작물에 등록되어있으며 MRL이 0.05〜5.0 mg/kg으로 추정최대일일 농약 섭취량은 0.667 mg/person이었으며, dicofol은 사과, 배 및 감귤에 MRL이 2.0 mgkg로 추정 최대일일 농약 섭취량을 산출한 결과 0.1462 mg/per%ii이었다. Endo- sulfan은 배추에만 등록되어있으며 MRL이 2.
내분비계 장애추정농약 5종에 대한 식이섭취 위험도를 평가한 결과 표 4에서 보는 바와 같이 정상적 인성인 남성의 평균혈중 에스트로겐 농도를 20 ng/L로, 17 Gtstradiol에 대한 E.eq를 표3과 같이 10-5, 5종 농약의 추정최대일일농약섭취총량을 L2298 mg/person, 혈액량을 4 L로 하여 혈중 농약에 의한 에스트로겐성물질의 증가량을 산출한 결과 정상인 혈중에 존재하는 에스트로겐 농도를 농약섭취로 인하여 3.075 ng/L 증가시켰다. 이것은 정상 에스트로겐 농도의 15.
내분비계 장애추정농약 중 국내사용 17종 농약에 대하여 10 uM의 농도로 에스트로겐 수용체 결합 생물검정법으로 에스트로겐성 영향을 시험한 결과 그림 1에서 보는 바와 같이 양성대조물질인 17&estradiol은 음성대조 물질인 DMSO 의 RLU(relative luciferase imit)/mg protein에 비해 약 57배 증가된 활성을 보였으며, dicofol 25.1, endosulfan 11.1, esfenvaler- late 5.4, fenvalerate 5.1, 및 cypermethrm 4.7배 정도로 음성대조에 비해 증가된 활성 율을 보여 에스트로겐 수용체 유전자 발현을 유도하였다. 또한 alachlor, mancozeb, methomyl, methiram, metribuzin, parathion, triflurain 및 vincolzolin은 2.
따라서 17 β-estradiol 의 최대 활성농도인 10-10M을 RLP로, 2,500 RLU/mg piotein 을 RLE 로 설정하였다. 반면 dicofol 및 endosulfan의 RLP는 모두 10-5M이었고, RLE는 최고 활성이 1,400 및 1,800 RLU/mg protein으로 각각 56 및 72%였다. 이와 같은 결과는 인체내에 존재하는 에스트로겐 활성에 대한 E.
비교적 활성이 높은 dicofol과 endosulfan에 대한 RLP 및 RLE에 의한 에스트로겐성 영향을 평가하기위흐} 여 합성 에스트로겐인 17β-estadiol과 농약에 대한 영향을 BGlLuc4E2 세포를 이용하여 luciferase 활성을 검색한 결과 그림 2-(A) 및 2-(B)에서 보는 바와 같이 17 destradiol은 10-13M까지는 영향이 없었으나 l0-12M부터 영향이 나타나기 시작하여 농도 의존적으로 10-11~-9M에서 최고의 활성을 보이다가 10-8M 이상의 농도에서는 세포독성 등에 의한 영향으로 오히려 활성이 감소하는 경향을 보였다. 따라서 17 β-estradiol 의 최대 활성농도인 10-10M을 RLP로, 2,500 RLU/mg piotein 을 RLE 로 설정하였다.
075 ng/L 증가시켰다. 이것은 정상 에스트로겐 농도의 15.37% 정도에 해당하여 농약에 의한 위해성이 다소 문제가 있을 것으로 평가되었으나, 농약 모니터링 자료에 의한 위해성 평가 결과 혈중에 존재하는 에스트로겐 농도의 증가는 0.01938 ng/L로 정상농도에 비해 0.09693% 정도 증가하여 농약에 의한 위해성은 문제되지 않을 것으로 판단되었다(표 5). 이와 같은 결과는 영국의 MAFF(Ministry of Agriculture, Fisheries & Food) 자료를 이용하여 영국인 식이섭취량을 통한 농약의 에스트로겐성 위해성평가 결과 농약에 의한 에스트로겐성 영향은 없을 것으로 평가한 것과 차이가 없었다(Shaw와 McCully, 2002).
후속연구
이와 같은 결과는 영국의 MAFF(Ministry of Agriculture, Fisheries & Food) 자료를 이용하여 영국인 식이섭취량을 통한 농약의 에스트로겐성 위해성평가 결과 농약에 의한 에스트로겐성 영향은 없을 것으로 평가한 것과 차이가 없었다(Shaw와 McCully, 2002). 그러나 이와 같은 평가가 식육, 음용수 등 모든 노줄을 다 고려하지 못했고, 또 다른 인자가 있을 수 있기 때문에 앞으로 더 많은 연구와 평가법이 개발되어야 정확한 평가가 가능할 것으로 판단되었다.
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