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문제 정의
- 2003). 따라서 본 연구에서는 국내 유명 고구마 품종인 신천미를 이용, 효과적인 식물체재분화시스템을 확립하기 위하여 정단분열 조직으로부터 배 발생 캘러스를 유도하고 고빈도의 체세포배발생 및 재분화에 미치는 casein hydrolysate의 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 2D , 4-를 처리하여 얻어진 배 발생 캘러스를 MS 기본 배지에 옮겨 상기의 형광등 하에서 배양하여 일차체세포배를 얻었고, 이중 어뢰형 배와 자엽형배를 이용하여 이차 배발생 캘러스 및 체세포배의 형성률을 조사하였다. 먼저 배 발생 캘러스로부터 유도된 체세포배를 크기에 따른 이차배와 체세포배 형성률을 비교하고자 2 mm이하, 2—4 mm, 4 mm 이상의 체세포배를 이, 삼등분 (1 ±0.
- 4 mg/L thiamine HC1 의 비타민과 30 g/L sucrose, 4 g/L gelrite를 넣어 MS-I 배지라고 하고, 배 발생 캘러스 유도시 사용하였다. MS-I 배지에 식물생장 조절물질로 2, 4- D를 0.1, 0.5, 1, 2 mg/L의 농도로 처리하고, 여기에 casein hydrolysate (이하 casein) 농도를 0, 50, 150, 300, 500 mg/L로 각각 첨가하였다. 이들 배지에 정단 및 측아분열 조직 절편체를 치상하고 암배양하였으며, 배양 4주 후 배발생 캘러스 및 체세포 배 발생을 조사하였다.
- 고구마의 효과적인 배 발생 캘러스 형성을 알아보기 위하여 배지는 MS (Murashige and Skoog 1962) 무기염에 100 mg/L myo-inositol , 0.4 mg/L thiamine HC1 의 비타민과 30 g/L sucrose, 4 g/L gelrite를 넣어 MS-I 배지라고 하고, 배 발생 캘러스 유도시 사용하였다. MS-I 배지에 식물생장 조절물질로 2, 4- D를 0.
- 2 mm)하고 1 mg/L 2, 4-D를 포함한 MS-I 배지에 치상하여 4주 배양한 후 조사하였다. 또한 casein 의 영향을 알아보기 위하여 1 mg/L 2, 4-D를 포함한 MS-I 배지에 0, 100, 300 mg/L casein 농도로 각각 첨가하고 상기실험 에서 얻어진 가장 효율적인 체세포배의 크기를 이용하여 이차 배발생 캘러스 및 체세포배의 형성률을 조사하였다.
- 2D , 4-를 처리하여 얻어진 배 발생 캘러스를 MS 기본 배지에 옮겨 상기의 형광등 하에서 배양하여 일차체세포배를 얻었고, 이중 어뢰형 배와 자엽형배를 이용하여 이차 배발생 캘러스 및 체세포배의 형성률을 조사하였다. 먼저 배 발생 캘러스로부터 유도된 체세포배를 크기에 따른 이차배와 체세포배 형성률을 비교하고자 2 mm이하, 2—4 mm, 4 mm 이상의 체세포배를 이, 삼등분 (1 ±0.2 mm)하고 1 mg/L 2, 4-D를 포함한 MS-I 배지에 치상하여 4주 배양한 후 조사하였다. 또한 casein 의 영향을 알아보기 위하여 1 mg/L 2, 4-D를 포함한 MS-I 배지에 0, 100, 300 mg/L casein 농도로 각각 첨가하고 상기실험 에서 얻어진 가장 효율적인 체세포배의 크기를 이용하여 이차 배발생 캘러스 및 체세포배의 형성률을 조사하였다.
- 배 발생 캘러스 형성에 효과적인 것으로 나타난 2 mm 이하의 체세포배를 이용하여 이차 배발생 캘러스 형성에 casein의 영향을 확인하고자 절단체를 1 mg/L2, 4-D와 casein이 첨가된 배지에 치상하였다. Casein 첨가시 90% 이상의 높은 배 발생 캘러스를 형성하였으며, 체세포배 발달도 45%까지 촉진시켰 다 (Figure 4).
- 5, 1, 2 mg/L의 농도로 처리하고, 여기에 casein hydrolysate (이하 casein) 농도를 0, 50, 150, 300, 500 mg/L로 각각 첨가하였다. 이들 배지에 정단 및 측아분열 조직 절편체를 치상하고 암배양하였으며, 배양 4주 후 배발생 캘러스 및 체세포 배 발생을 조사하였다.
- 5% sodium hypochlorite 용액에 15분간 진탕 소독한 후 멸균수로 4~5회 수세하였다. 이후 식물조직의 물기를 제거하고 해부현미경 하에서 정단 및 측아분열 조직을 1士0.2 mm 정도의 크기로 적출하여 잘린 면이 배지에 닿도록 치상하였다. 배양은 25±1°C의 배양실에서 실시하였으며 캘러스 형성 및 증식은 암배양, 체세포배와 식물체 형성은 50±5 /imol .
- 정단 및 측아 분열 조직으로부터 형성된 배 발생 캘러스로부터 효과적인 체세포배의 형성을 위하여 또한 체세포배발생 및 식물체재생을 위해서는 MS 기본배지에 30 g/L sucrose, 2.5 g/L gelrite를 넣어 배양에 사용하였으며 casein을 0, 100, 300, 500 mg/L 농도로 각각 첨가하여 4주간 배양하였다. 체세포배 형성률은 접종한 배 발생 캘러스의 수에 대한 신초를 형성시킨 캘러스수의 비로써 표기하였다.
대상 데이터
- 재료는 고구마 (Ipomoea batatas L.) “신천미” 품종을 사용하였으며, 온실에서 재배하여 정단 및 측지를 1 cm 정도 크기로 채취하였다. 채취한 시료를 70% 에탄올에 30초, 0.
성능/효과
- 4- D에 300 mg/L casein를 혼용한 경우 90% 이상으로 무처리와 비교할 때 현저히 높은 배 발생 캘러스 형성률을 나타냈으며, casein 50, 150 mg/L의 첨가구에서도 2, 4-D 단독 처리보다 높은 빈도를 보였다. 2 mg/L 2, 4-D의 첨가에 있어서 캘러스 생장 억제의 영향에 의해 1 mg/L 2, 4-D 첨가시보다 낮은 배 발 생 캘러스 형성률을 보였으나 casein 첨가에 대한 영향은 1 mg/L 2, 4-D 첨 가 시와 같게 나타났다. Kwon 등(2002)과 Min 등(1994)이 고구마의 여러 품종을 이용한 결과 1 mg/L 2, 4-D 에서 다른 식물생장 조절제의 처리보다 더 높은 배 발생 빈도를 유지하였으며, 이는 단지 2, 4-D의 처리만으로도 고구마의 배 발생 캘러스를 쉽게 유도할 수 있다는 것을 확인시켜주었다.
- Casein의 첨가에 의한 체세포배발생과 생장은 식물생장 조 절제를 첨가하지 않은 MS 기본 배지에 300〜500 mg/L 농도로 casein을 첨가하였을 때 93% 이상의 형성률을 나타내어 casein 무처리의 경우 보다 1.3배 높게 나타났다 (Figure 2). 또한 이들 경우에 초기 10일 이내에 무처리구에 비해 1.
- 1997). Medicago ariwea에 있어서도 배 발생 캘러스 생성에 좋은 효과를 나타낸 proline보다 100 mg/L의 casein 처리시 더 높은 빈도의 생성률을 나타냈다. 그러나 500 mg/L 이상에서는 다소 감소되는 경향을 보이기도 하였다 (Hitaetal.
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결과 및 고찰
고구마 신천 미 품종의 정단 분열 조직을 0.1 〜2 mg/L 2, 4-D 와 0〜500 mg/L casein를 조합하여 혼용 처리하고 배양한 결과 배양 30일 후, 1 mg/L2, 4-D 이하 첨가배지에서는 90% 이상 생존하였으며, 2 mg/L 첨가한 경우에는 80% 이상의 생존율을 보였다 (Table 1).캘러스의 형태는 1 mg/L 2, 4-D 이하에서는 캘러스가 크고 백색을 띠는 비배 발생 캘러스가 대부분을 차지하였다.
- 고구마 정단분열 조직은 1 mg/L 2,4- D가 첨가된 MS 배지에서 배양 4주경에 최적의 배 발생 캘러스가 형성되었다. 또한 2,4-D가 첨가된 배지에 casein을 첨가함으로써 고구마 신천 미 품종의 배 발생 효율을 최고 90% 이상으로 2,4-D 단독 처리보다 현저하게 증가시켰다. 배 발생 캘러스로부터 체세포배의 유도는 식물생장조절제가 제거된 MS 기본배지에서 효과적으로 형성되었으며 300 〜500 mg/L casein을 첨가한 배지에서는 더 높은 형성빈도와 녹색의 단단한 체세포배가 발달하였다.
- Min 등(1994)도 부여재래 및 율미품종에 있어서 1 mm 이하 체세포배를 이용한 경우에 가장 높은 이차 배발생 캘러스를 얻었으며, 체세포배의 크기가 큰 것은 낮은 빈도를 나타내어 신천미와 일치하였다. 또한 부여재래 및 율미에 있어서 상부가 하부 절단체보다 2배 높은 이차배를 형성하였나, 신천미에 있어서 2 mm 이하에서는 구분 없이 같은 빈도로 나타났다. 이는 2 mm 이하에서는 배발생할 수 있는 세포로 구성되어 있는 반면 자엽형 세포로 발달할수록 상부로 생장점이 구분되어져 나타나는 형상으로 생각된다.
- 신천미의 배 발생 캘러스의 형태는 표면이 매끈하면서 단단하고, 처음에는 노란색의 배 발생 캘러스가 형성되고, 배양기간이 지나면서 이들 캘러스에서 적자색의 캘러스가 형성되어 비배 발생 캘러스와 쉽게 구분되었다. 또한 신천미는 2, 4-D를 포함하고 있는 캘러스유도배지에서 형성된 배 발생 '캘러스를 배지조건의 변화 없이 계속적으로 유지하였을 때 바로 체세포배가 형성되었으며, 1 mg/L 2, 4-D 이하에서는 전혀 체세포배의 형성이 없었으나, 그 이상의 농도에서는 최고 26% 체세포 배 발생 빈도를 나타냈다.
- 2002)을 이용하였을 때 가장 효과적인 배 발생 캘러스와 체세포배가 유도되는 것으로 나타났다 . 또한 여러 식물체에서 casein과 같은 질소 영양원을 첨가함으로써 세포 발달과 재분화률을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 배 발생 캘러스로부터 체세포배를 유도하기 위해 2, 4-D의 농도를 순차적으로 낮추어 계대 배양을 하는 방법이 아닌 식물생장조절제를 전혀 첨가하지 않은 MS 기본 배지에 바로 옮기고 광조건 하에서 배양한 결과 쉽게 체세포배의 형성을 보였으며, 이와 같은 배지에 자엽형 단계의 체세포배를 배 발생 캘러스로부터 각각 분리하여 치상한 결과 효과적으로 건전한 식물체로 성장하였다 (Figure 1). 또한 선별된 거의 모든 배발 생 캘러스는 90% 이상 체세포배를 형성시켰다 (Figure IE).
- 한편 배양 중인 절편체가 도중에 갈변되고 생장하지 못하는 것들이 있었는데 이는 생장점적출과정에서 생장점 부위에 상처가 가해져 나타나는 현상으로 상처를 주지 않는다면 적정2, 4-D 농도에서 높은 생존율을 유지할 수 있을 것으로 본다. 배양 4주 후 배발생 캘러스의 형성률은 전체적으로 1 mg/L 2, 4-D가 기본적으로 첨가된 배지에서 77% 이상의 빈도를 나타냈으며, 2.4- D 단용 처리보다 casein를 첨가해준 경우가 배 발생 캘러스의 형성빈도를 높여주는 경향을 보였다. 이중 특히 1 mg/L 2.
- Casein 첨가시 90% 이상의 높은 배 발생 캘러스를 형성하였으며, 체세포배 발달도 45%까지 촉진시켰 다 (Figure 4).이의 결과로부터 신천미는 일차체세포배로부 터 이차 배발생 캘러스 및 체세포배를 쉽게 형성시킬 수 있으며, casein의 첨가로 그 빈도를 높일 수 있다는 것이 확인되었다. 식물체재분화시에 casein 이 기관 형성과 세포분화 등의 여러 단계에 효과적인 영향을 미치고 있다.
- 4- D 단용 처리보다 casein를 첨가해준 경우가 배 발생 캘러스의 형성빈도를 높여주는 경향을 보였다. 이중 특히 1 mg/L 2.4- D에 300 mg/L casein를 혼용한 경우 90% 이상으로 무처리와 비교할 때 현저히 높은 배 발생 캘러스 형성률을 나타냈으며, casein 50, 150 mg/L의 첨가구에서도 2, 4-D 단독 처리보다 높은 빈도를 보였다. 2 mg/L 2, 4-D의 첨가에 있어서 캘러스 생장 억제의 영향에 의해 1 mg/L 2, 4-D 첨가시보다 낮은 배 발 생 캘러스 형성률을 보였으나 casein 첨가에 대한 영향은 1 mg/L 2, 4-D 첨 가 시와 같게 나타났다.
- 체세포배로부터 이차배 유도실험에서 일차 체세포배의 크 기별로 구분하고 일정 크기로 절단하여 치상하였을 때 2 mm 이하 크기의 체세포배로부터 배 발생 캘러스는 74%로 그 이 상의 크기 보다 1.5배 높은 형성률을 보였으며 (Figure 3), 치상한 체세포배의 크기가 클수록 이차배 발생률이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 한편 이차 체세포배의 발달에 있어서도 사용한 체세포배의 크기에 따라 배 발생 캘러스와 같은 경향을 나타냈으며, 4 mm 이상의 크기에서는 거의 발생되지 않았다.
후속연구
- 그러나 대부분은 낮은 재분화율에 의해서 형질전환에 어려움을 겪고 있다. 따라서 본 연구에서 보고된 재분화 방법은 효과적인 형질전환 수행에 도움을 줄 수 있을 것으로 보여지며, 또한 건전묘의 생산과 유전자원 보 존을 위한 동결보존 등에 효율적으로 이용될 수 있을 것으로 전망된다.
- 그러나 재분화 빈도가 매우 낮고, 한정된 유전형에만 적용되고 있다. 효과적인 조직 배양 기술을 이용하여 고구마의 고빈도 재분화 식물체를 얻기 위해서는 보다 다양한 연구가 요구된다. 최근 casein hydrolysate# 배지에 첨가하는 경우 배 발생 효율이 증가하거나, 식물체재분화가 증가한다는 보고가 있다 (Smith히 al.
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