[논문]Lactobacillus brevis의 고정화 균체에 의한 γ-aminobutyric acid의 연속 생산

류병호; 전재호

doi:10.5352/jls.2004.14.1.167

Lactobacillus brevis의 고정화 균체에 의한 γ-aminobutyric acid의 연속 생산
Continuous Production of γ-aminobutyric Acid by Immobilization of Lactobacillus brevis 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.14 no.1 = no.62, 2004년, pp.167 - 173

초록
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Lactobacillus brevis BH-21의 균체를 고정화하여 column형 reactor를 이용하여 $\gamma$-aminobutyric acid의 연속적 생산을 검토하였다. Lactobacillus brevis BH-21에 의한 $\gamma$-aminobutyric acid 생산조건은 고정화 담체로는 3.0% sodium alginate가 좋았고 직경 2.2 mm의 bead를 사용하여 기질의 주입속도는 10 mL/h이 최적 조건이었다. Lactobacillus brevis BH-21의 고정화 균체와 유리 균체를 사용하여 $\gamma$-aminobutyric acid의 생산을 최적 조건하에서 1, 2, 3, 및 4차 발효 동안 48시간마다 신선한 기질을 주입하면서 비교ㆍ조사한 결과 고정화 균체를 사용 시에 생산량이 더 많았다. Column형 reactor에 의한 연속 발효 시 발효 25일까지 생산이 우수하였고 발효 30일까지는 $\gamma$-aminobutyric acid를 생산할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The optimal conditions for the continuous production of $\gamma$-aminobutyric acid by immobilization of Lactobacillus brevis BH-21 using column type reactor were investigated. The optimal conditions of operation were 2.2 mm diameter bead of 3.0% sodium alginate at 10 mL/h of substrate feeding rate. Continuous production by immobililzed cells showed the highest productivity with replacement of fresh medium in every 48h for fourth fermentatoin cycle following the rendition of $\gamma$-aminobutyric acid productivity. A productivity of $\gamma$-aminobutyric acid could be obtained for 25 days by continuous column type reactor under optimal conditions.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

미생물의 고정화 담체의 선택은 목적하는 발효 생산물의 수율을 높이는데 큰 영향을 미친다[2]. 균체 고정화 발효 시스템의 고정화에 이용되는 담체로는 agar, sodium alginate, polyacryamide 및 K-carrageenan등이 사용되고 있으므로 본 실험에서 고정화 담체의 종류에 따른 GABA생산의 활성을 검토하였다. Lactobacillus brevis BH-21 를 배양한 후 얻은 균체를 각종 담체를 이용하여 고정화시킨 후 담체의 종류와 농도에 따른 GABA의 활성을 측정하였다.
이러한 발효기법은 고정화 균체를 장기간 사용할 수 있으며 연속 발효가 가능하고, 제조공정을 단축시키며 생산성을 높일 수 있고 오염을 방지할 수 있는 특징이 있다. 따라서 본 연구는 유산균으로부터 GABA을 대량 생산하기 위하여 젓갈로부터 Lactobacillus를 분리, 동정하였고, 이균체를 고정화하여 column형 반응조로서 GABA의 생산을 시도 하였다.

가설 설정

A: Immobilized cells spheres before fermentation.
B: Immobilized cells spheres after 15 days fermentation.
C: Immobilized cells spheres after 30 days fermentation.

제안 방법

3.0% Sodium alginate로 Lactobacillus brevis BH-21 를 고정시켜 적정 기질 공급량을 산출하였다. Column형 reactor에서 기질의 주입 속도를 시간당 5, 10, 15 및 20 ml씩 각각 주입하면서 GABA의 생산능과 유출액의 균수를 측정한 결과를 Fig.
5분간 끓인 후 반응을 정지시킨 다음 생성된 GABA를 측정하였다. 상기 조건하에서 1분간에 1 μmol의 GABA를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 하였다[18].
담체중 K-canageenane gel의 상태가 sodium alginate에 비하여 쉽게 붕괴되기 쉽고 고온에서는 녹는 현상이 일어나므로 gel의 형성능이 약하였다[2]. Agar 와 polyacrylamide의 고정화 gele 형태와 크기가 고르지 못하여 일정한 활성을 갖지 못하며 장시간 발효 시는 gel이 붕괴되기 쉬운 단점이 있으나 ca-alginate는 산성 또는 알칼리성에서도 안정하고 장기간 고온에서 발효하여도 gel의 붕괴가 쉽게 일어나지 않고 일정한 압력에도 견디므로 본 실험에서는 균체 고정화 담체로 sodium alginate를 사용하기로 결정하였다[2,19,25].
고정화 담체로서 균체를 고정화할 때 담체의 농도에 따라 gel의 형성이 달라지며 균체의 고정화 및 발효의 효율에도 경향을 미치게 된다. Fig. 2에 나타난 바와 같이 sodium alginate를 2.5, 3.0, 3.5, 4.0%의 농도로 구분하여 GABA의 생산능을 조사한 결과 sodium alginate 농도가 3.0%로 했을 때 균체의 증식이 제일 좋았으며, GABA의 생성도 낮았으므로 본 실험에서는 3.0%의 sodium alginate로 균체를 고정화하여 사용하였다. 이와 같이 목적하는 발효 생성물에 따라 다르지만 균체를 고정화할 때 담체의 농도가 발효 시 크게 작용하였다.
GABA를 생산하기 의하여 회분법에서 산출된 적정 발효 조건 및 발효속도를 기초로 하여 column형 reactor를 사용하여 연속발효를 실시하였다. Lactobacillus brevis BH-21 을 3.
GABA를 연속적으로 생산하기 위하여 아크릴제로 만든 column형(높이 100 cm, 직경 6 cm, 3단식, 용량 0.8 l)의 column 반응조에 고정화된 균체를 총 용량의 50%되게 무균적으로 충진한 다음 peristalic pump로 사용하여 밑에서 위로 배양액을 주입하면서 연속 발효하였다(Fig. 1).
Laciobacillus brevis BH-21 을 액체배지에서 배양한 후 균체를 원심·분리한 다음 멸균 증류수로 2회 세정한 균체를 3.0 % sodium alginate로 고정화시킨 다음 전자현미경(manifi- cation, ×10,000)으로 관찰하였다. Fig.
균체 고정화 발효 시스템의 고정화에 이용되는 담체로는 agar, sodium alginate, polyacryamide 및 K-carrageenan등이 사용되고 있으므로 본 실험에서 고정화 담체의 종류에 따른 GABA생산의 활성을 검토하였다. Lactobacillus brevis BH-21 를 배양한 후 얻은 균체를 각종 담체를 이용하여 고정화시킨 후 담체의 종류와 농도에 따른 GABA의 활성을 측정하였다. Table 1에서 보는 바와 같이 3.
Lactobacillus brevis BH-21 유리 균체와 고정화 담체에 의한 GABA 생산 등을 비교하기 위하여 각각의 균주를 일정조건으로 배양하면서 발효는 24시간 마다 새로 만든 배양액을 공급해주면서 조사하였다. Fig.
GABA를 생산하기 의하여 회분법에서 산출된 적정 발효 조건 및 발효속도를 기초로 하여 column형 reactor를 사용하여 연속발효를 실시하였다. Lactobacillus brevis BH-21 을 3.0% sodium alginate로 고정화하여 column형 reactor에 고정화 균체를 250 g씩 충진한 후 하부에서 peristaltic pump로 기질을 시간당 10 ml씩, 체류시간은 10시간으로 하여 공급하면서 30일간 발효하였을 때 발효액 중의 GABA생산, pH의 변화 및 생균수를 측정하였다. Fig.
담체내의 생균수의 측정은 인산완충용액(pH. 7.2)에 용해시킨 후 생균수를 측정하였다.
그리고 Lactobacillus brevis BH-21 균체를 sodium alginate로 고정화시킨 다음 column reacts.에서 24시간, 15일 및 30일간 발효시킨 후 현미경으로 관찰하였다. Column reactor 에서 발효시작 24사간 후에는 Lactobacillus brevis BH-21는 담체에 붙어있는 균체의 상태가 매우 치밀하였고(Eig.
Lactobacillus brevis BH-21 를 MRS 배지에서 배양한 후 원심분리(3, 000xg, 15 min, 4℃)한 후 상등액을 원심분리 (12,000x& 15 min, 4℃)하였다. 침전물에 멸균증류수를 가하여 남아있을지도 모르는 GABA를 2차 추출하였고, 1, 2차 원심분리로부터 얻은 상등액을 합하여 냉동·건조하였다. 이어 소량의 물로 용해한 후 0.

대상 데이터

본 연구에 사용된 균주는 GABA를 분비하는 Lactobacillus brevis BH-21 를 사용하였다[12].

데이터처리

Column으로부터 유도체를 용출시키 기 위해서는 AccQ·Tag Eluent A와 69% acetonitrile을 98:2의 비율로 분당 1 mL의 유속으로 흘려주었다. GABA 및 아미노산 함량은 표준 GABA 분석 결과와 비교하여 산출하였다[27].

성능/효과

에서 24시간, 15일 및 30일간 발효시킨 후 현미경으로 관찰하였다. Column reactor 에서 발효시작 24사간 후에는 Lactobacillus brevis BH-21는 담체에 붙어있는 균체의 상태가 매우 치밀하였고(Eig. 7, A), 발효 15일 경과 후에는 담체에 붙어있는 균체가 발효 24시간 보다는 약간 탈락되는 현상을 나타내고 있으며(Fig. 7, B), 그리고 30일 발효 후에는 Lactobacillus brevis BH-21 균체가 상당량이 탈락해 있는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 7, C).
Lactobacillus brevis BH-21의 고정화 균체와 유리 균체를 사용하여 Y-aminobutyric acid의 생산을 최적 조건하에서 1, 2, 3, 및 4차 발효 동안 48시간마다 신선한 기질을 주입하면서 비교·조사한 결과 고정화 균체를 사용시에 생산량이 더 많았다. Column형 reactor에 의한 연속 발효시 발효 25일까지 생산이 우수하였고 발효 30일 까지는 γ-aminobutyric acid를 생산할 수 있었다.
Lactobacillus brevis BH-21 유리 균체와 고정화 담체에 의한 GABA 생산 등을 비교하기 위하여 각각의 균주를 일정조건으로 배양하면서 발효는 24시간 마다 새로 만든 배양액을 공급해주면서 조사하였다. Fig. 3에 나타낸 바와 같이 유리 균체에 의한 발효와 고정화 균체에 의한 발효를 비교시 1차 발효시기인 24시간까지는 GABA생산능은 유리 균체를 이용하여 발효할 때 약간 높았다. 그러나 2차 발효에서는 고정화 균체의 활성은 초기 활성을 유지한 반면 유리 균체의 경우는 GABA의 생산능은 많이 떨어졌으며 3차 및 4차 발효시 고정화 균체에 의한 GABA의 생산은 거의 변화가 없었으나 유리 균체에 의한 GABA의 생산능은 급격히 저하하였다.
0% sodium alginate로 고정화하여 column형 reactor에 고정화 균체를 250 g씩 충진한 후 하부에서 peristaltic pump로 기질을 시간당 10 ml씩, 체류시간은 10시간으로 하여 공급하면서 30일간 발효하였을 때 발효액 중의 GABA생산, pH의 변화 및 생균수를 측정하였다. Fig. 5에서 나타낸 바와 같이 발효를 시작하여 2~3일 경과 시 GABA의 생산능은 약 2.6 mg/ 100 mL로 생산되었으나, 5일째에는 2.8 mg/100 mL였으며 10일째에서는 GABA의 생산능이 3.0 mg/100 mL로 최고치에 달하였고, 발효 20일까지 GABA생산이 유지되다가 25일 경과 시에는 2.5 mg/100 mL로 떨어지기 시작하여 30일 경과 시에는 2.2 mg/100 mL의 GABA생성능을 나타내었다. 발효 시 gel의 생균수는 발효경과 5일부터는 1.
2 mm의 bead를 사용하여 기질의 주입속도는 10 mL/h이 최적 조건이었다. Lactobacillus brevis BH-21의 고정화 균체와 유리 균체를 사용하여 Y-aminobutyric acid의 생산을 최적 조건하에서 1, 2, 3, 및 4차 발효 동안 48시간마다 신선한 기질을 주입하면서 비교·조사한 결과 고정화 균체를 사용시에 생산량이 더 많았다. Column형 reactor에 의한 연속 발효시 발효 25일까지 생산이 우수하였고 발효 30일 까지는 γ-aminobutyric acid를 생산할 수 있었다.
Lactobacillus brevis BH-21 를 배양한 후 얻은 균체를 각종 담체를 이용하여 고정화시킨 후 담체의 종류와 농도에 따른 GABA의 활성을 측정하였다. Table 1에서 보는 바와 같이 3.0% sodium alginate에 의한 고정화 균체에 의한 GABA의 생성량은 100%로 가장 높았으며, 65% K-carrabee-nan는 87.6%, 3.5% polyacrylamidee 66.3% 및 2.5% agar는 72.8%로 다소 낮았다. 담체중 K-canageenane gel의 상태가 sodium alginate에 비하여 쉽게 붕괴되기 쉽고 고온에서는 녹는 현상이 일어나므로 gel의 형성능이 약하였다[2].
3에 나타낸 바와 같이 유리 균체에 의한 발효와 고정화 균체에 의한 발효를 비교시 1차 발효시기인 24시간까지는 GABA생산능은 유리 균체를 이용하여 발효할 때 약간 높았다. 그러나 2차 발효에서는 고정화 균체의 활성은 초기 활성을 유지한 반면 유리 균체의 경우는 GABA의 생산능은 많이 떨어졌으며 3차 및 4차 발효시 고정화 균체에 의한 GABA의 생산은 거의 변화가 없었으나 유리 균체에 의한 GABA의 생산능은 급격히 저하하였다. 이는 유리 균체를 4회 계속 사용함으로써 균주의 활성이 떨어지기 때문으로 사료된다.
2 mg/100 mL의 GABA생성능을 나타내었다. 발효 시 gel의 생균수는 발효경과 5일부터는 1.4×10⁷cells/mL정도로 발효경과에 따라 약간 증가하였고, 25일까지 일정한 생균수를 유지하다가 30일 경과 시에는 1.0×cel0⁷cells/100mL 으로 약간 감소하였다. 그리고 유출액의 생균수는 4.
4에 나타내었다. 이러한 조건하에서 시간당 10 ml의 유속으로 기질을 주입했을 때 GABA의 생산능은 가장 높았고 시간당 5 ml에서는 약간 낮았다. 그러나 기질의 주입 유량이 시간당 15 ml에서는 GABA 생산능이 낮았고 시간당 20 ml에서는 제일 낮았다.

참고문헌 (26)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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