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문제 정의
- 본 연구에서는 한외여과막 생물반응기에서 제조된 분자량이 서로 다른 3종류의 키토산올리고당을 제조하여 양식넙치의 세균성 질병의 주요 원인균, 즉 Vibrio sp, Edwardsiella tarda, Streptococcus sp. 등에 대한 in vitro 항균활성을 조 사하여 , 양식 사료의 품질 개 선 및 식 중독의 예 방을 위한 천연 항균제로서의 키토산 및 키토산올리고당의 이용 가능성을 검토하였다.
- 한편, 3종의 병원성 세균에 대한 키토산올리고당의 처리 후 배양 시간을 1일~7일까지 수행하였을 때의 세균의 성장곡선을 관찰하였으며, 또한 세균에 대한 키토산올리고당의 처리시 간(혹은 접종시간에 따른 항균활성을 검 토하기 위 하여, 각각의 처리 혹은 접 종시간을 0 ~ 180분까지 한 후 24시간 배 양 하여 콜로니 계수법 (colony count method)으로 항균활성을 측정하였다. 본 연구에서는 여러가지 분자량 크기에 따라 분획된 키토산올리고당의 항균활성을 키토산과 함께 비교 하면서 실험을 진행하였다.
제안 방법
- , Edwar- dsiella tarda 및 Streptococcus sp.를 제주산 양식 넙치로부터 직접 분리하였으며, 이들 세균에 대하여 키토산 및 분자량 크기에 따라 분획된 3종류의 키토산올리고당(HMW-COS, MMW-COS, LMW-COS)의 항균활성을 검토하였다. 키토 산과 HMW-C0S는 모든 세균에 대한 항균활성이 우수하였으며, 특히 Vibrio sp.
- 이 배양액으로부터 1 mL를 취하여 10배 희 석 한 후, 그 중 1 mL를 tryptic soy 한천 평 판배 지 에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시간 후에 한천평판 배지위에 형성된 colony들의 수를 측정한 후 대조구의 colony 수와 비교하여 세균에 대한 항균활성을 살 균률(bactericidal activity, %)로 나타내었다. 키 토산 시료의 세균성장의 억제활성 에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration: MIC)는 키 토산올리고당의 10, 000 ppm 용액을 2배 희석법으로 하여 만든 용액으로부터 1 mL를 취 하고 여기에 5 mL의 배지와 0.
- 본 연구에서의 항균활성에 사용된 3종의 양식넙치 유래 병 원성 세균들 중 E. tarda에 대한 키 토산올리고당의 항균기 작을 확인하기 위하여 , 각각의 키토산올리 고당 용액을 1,000 ppm 농도로 제조하여 E. tarcfcz에 첨가한 후 상온에서 3시간 동안 배양하여 병원균의 형태적 변화를 주사형 전자현미경 (scanning electron microscopy: SEM)을 통하여 관찰하였다. 즉, 키토산올리고당으로 처리한 E.
- 키 토산올리고당은 전보의 방법 (28)에 따라 한외 여 과막 생 물반응기에서 키토산 가수분해효소를 이용한 효소적 가수분 해 방법으로 제 조되었다. 생 산된 키 토산올리 고당은 MWCO 가 서로 다른 한외 여과막의 한계범 위에 따라 3종류의 획분 으로 분리되어져 얻어졌으며, 상대적으로 고분자량의 키토 산올리 고당(high molecular weight chitosan oligosaccharides: HMW COS), 중간 분자량의 키토산올리고당(medium molecular weight chitosan oligosaccharides: MMW-COS), 저 분자량의 키 토산올리 고당(low weight chitosan oligosaccharides: LMW-COS)이다. 전보에서의 방법(28)에 따라 Bio-Gel P-30/P-4 gel 및 TSKgel NH2-6O column 등을 사" 용하여 각각의 키토산올리고당의 분자량 분포를 분석한 결과 HMW-COS는 7, 000-24, 000 Da, MMW-COS는 1,500~ 6, 000 Da, 그리고 LMW-COS는 1,000-1,500 Da이었다.
- 이것을 다시 후고정을 위해 1시간동안 1% osmium tetroxide(OsC)4)로 처리한 후 PBS로 다시 세 척하였다. 세척된 세균들은 50~100%의 농도로 조절된 에탄 올에 침적하여 순차적으로 탈수한 후 다시 60~100%의 농도 로 조절된 isoamyl acetate-f- 이용하여 치환시키고 임계점 건조기 (critical point dryer; HITACHI, HCP-2, Japan)를 이용하여 CO로 건조한 후 골드코팅 (HITACHI, E-1010, Ja- pan)하여 SEM으로 관찰하였다. 키토산으로 처리한 E.
- tarda 그리고 Streptococcus sp.의 항균효과를 검토하였다. Fig.
- 키토산 및 키토산올리고당의 항균활성 측정은 전보에서 의 방법 (20)에 따라 콜로니 계수법 (colony count method)으 로 수행하였다. 즉 위의 제주산 양식넙치로부터 분리된 3종 의 세균들을 영양액체배지(nutrient broth; NB)에서 배양한 균액 0.5 mL(2x IO? ~1。3 colony/mL), 여러 가지 농도의 키 토산올리 고당 0.5 mL 및 0.05 M 초산완충액 (pH 5.5) 4.0 mL 를 각각 혼합하여 37℃에서 1시간동안 진탕 배양하였다. 이때 대조구로서 는 키 토산올리 고당 용액 대신 0.
- 배양 24시간 후에 한천평판 배지위에 형성된 colony들의 수를 측정한 후 대조구의 colony 수와 비교하여 세균에 대한 항균활성을 살 균률(bactericidal activity, %)로 나타내었다. 키 토산 시료의 세균성장의 억제활성 에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration: MIC)는 키 토산올리고당의 10, 000 ppm 용액을 2배 희석법으로 하여 만든 용액으로부터 1 mL를 취 하고 여기에 5 mL의 배지와 0.05 mL의 균배양액(10, ~10*3 colony/mL)를 각각 첨가하여 37℃에서 24시간 배양한 후 육 안으로 관찰하여 균의 콜로니가 전혀 형성되지 않는 100% 항균활성을 나타내는 시료의 농도를 MIC로 결정 하였다. 한편, 3종의 병원성 세균에 대한 키토산올리고당의 처리 후 배양 시간을 1일~7일까지 수행하였을 때의 세균의 성장곡선을 관찰하였으며, 또한 세균에 대한 키토산올리고당의 처리시 간(혹은 접종시간에 따른 항균활성을 검 토하기 위 하여, 각각의 처리 혹은 접 종시간을 0 ~ 180분까지 한 후 24시간 배 양 하여 콜로니 계수법 (colony count method)으로 항균활성을 측정하였다.
- 키토산올리고당 및 키토산을 E. tarcfai에 3시 간동안 배양 한 후 키토산의 항균기작을 살펴보기 위해 SEM을 통하여 세균의 형태학적 관찰을 실시하였다. Fig.
- 세척된 세균들은 50~100%의 농도로 조절된 에탄 올에 침적하여 순차적으로 탈수한 후 다시 60~100%의 농도 로 조절된 isoamyl acetate-f- 이용하여 치환시키고 임계점 건조기 (critical point dryer; HITACHI, HCP-2, Japan)를 이용하여 CO로 건조한 후 골드코팅 (HITACHI, E-1010, Ja- pan)하여 SEM으로 관찰하였다. 키토산으로 처리한 E. tarda 에 대해서도 SEM으로 관찰하여 키토산올리고당으로 처리 된 세균과 비교하였다.
- 05 mL의 균배양액(10, ~10*3 colony/mL)를 각각 첨가하여 37℃에서 24시간 배양한 후 육 안으로 관찰하여 균의 콜로니가 전혀 형성되지 않는 100% 항균활성을 나타내는 시료의 농도를 MIC로 결정 하였다. 한편, 3종의 병원성 세균에 대한 키토산올리고당의 처리 후 배양 시간을 1일~7일까지 수행하였을 때의 세균의 성장곡선을 관찰하였으며, 또한 세균에 대한 키토산올리고당의 처리시 간(혹은 접종시간에 따른 항균활성을 검 토하기 위 하여, 각각의 처리 혹은 접 종시간을 0 ~ 180분까지 한 후 24시간 배 양 하여 콜로니 계수법 (colony count method)으로 항균활성을 측정하였다. 본 연구에서는 여러가지 분자량 크기에 따라 분획된 키토산올리고당의 항균활성을 키토산과 함께 비교 하면서 실험을 진행하였다.
대상 데이터
- 키토산올리고당의 효소적 가수분해 에 의한 생 산을 위해 사용한 한외 여 과막 생 물반응기 에서의 한외 여과막은 Millipore Co.(Billerica, USA) 로부터 각각의 서로 다른 한계분자량 범위를 가진 멤브레인 들(molecular weight cut off(MWCO): 1,000; 5,000; 10, 000) 을 구입 하여 사용하였다. 본 연구에서 사용된 모든 시 약들은 분석용 특급시약들을 구입하여 사용하였다.
- (Billerica, USA) 로부터 각각의 서로 다른 한계분자량 범위를 가진 멤브레인 들(molecular weight cut off(MWCO): 1,000; 5,000; 10, 000) 을 구입 하여 사용하였다. 본 연구에서 사용된 모든 시 약들은 분석용 특급시약들을 구입하여 사용하였다. 본 연구의 항균 활성 검색 에 사용된 균주는 Vibrio sp.
- , Edwardsiella tarda 및 Streptococcus sp.이며, 제주도 양식장의 양식넙치CPara- lichthys a〃Daceus)로부터 각각 분리, 동정 한 후 사용하였다.
- 키토산올리고당의 생산을위해 사용된 키토산기질은 (주) 키토라이프에서 제공받은 것으로서 탈아세틸화도가 89%이 며, 점도는 20 cps였다. 키토산의 효소적 가수분해를 위해 사용된 키 토산 분해효소는 Bacillus pumilus BN-262종에서 분리 한 것으로서 분자량은 약 30, 000 Da, 최적 pH 5.
이론/모형
- 키 토산올리고당은 전보의 방법 (28)에 따라 한외 여 과막 생 물반응기에서 키토산 가수분해효소를 이용한 효소적 가수분 해 방법으로 제 조되었다. 생 산된 키 토산올리 고당은 MWCO 가 서로 다른 한외 여과막의 한계범 위에 따라 3종류의 획분 으로 분리되어져 얻어졌으며, 상대적으로 고분자량의 키토 산올리 고당(high molecular weight chitosan oligosaccharides: HMW COS), 중간 분자량의 키토산올리고당(medium molecular weight chitosan oligosaccharides: MMW-COS), 저 분자량의 키 토산올리 고당(low weight chitosan oligosaccharides: LMW-COS)이다.
- 키토산 및 키토산올리고당의 항균활성 측정은 전보에서 의 방법 (20)에 따라 콜로니 계수법 (colony count method)으 로 수행하였다. 즉 위의 제주산 양식넙치로부터 분리된 3종 의 세균들을 영양액체배지(nutrient broth; NB)에서 배양한 균액 0.
성능/효과
- 생 산된 키 토산올리 고당은 MWCO 가 서로 다른 한외 여과막의 한계범 위에 따라 3종류의 획분 으로 분리되어져 얻어졌으며, 상대적으로 고분자량의 키토 산올리 고당(high molecular weight chitosan oligosaccharides: HMW COS), 중간 분자량의 키토산올리고당(medium molecular weight chitosan oligosaccharides: MMW-COS), 저 분자량의 키 토산올리 고당(low weight chitosan oligosaccharides: LMW-COS)이다. 전보에서의 방법(28)에 따라 Bio-Gel P-30/P-4 gel 및 TSKgel NH2-6O column 등을 사" 용하여 각각의 키토산올리고당의 분자량 분포를 분석한 결과 HMW-COS는 7, 000-24, 000 Da, MMW-COS는 1,500~ 6, 000 Da, 그리고 LMW-COS는 1,000-1,500 Da이었다.
- 3종의 세균에 대하여 키토산올리고당 및 키토산을 각각 0~180분까지 처리시간(혹은 접종시간)을 달리하였을 때의 항균활성을 측정한 결과, Fig. 5에서 보는 것과 같이 시료의 처리시간이 길어질수록 세균의 성장은 억제되었다. Vibrio sp.
- 키토산은 500 ppm의 농도에서 약 75%의 항균 활성을 보였으며 , 1,000 ppm의 농도에서도 약 80%의 매우 완만한 활성 증가 만을 보여 주었다. E. 仞广出에 대한 MIC값 에 대하여도 키토산이 5,000 ppm을 나타내었을 뿐, 3종류의 키토산올리고당은 모두 10, 000 ppm을 나타내었다. Streptococcus sp.
- 이들에 대한 결과는 키토산의 항균활 성은 분자량에 따라 크게 의존한다는 사실을 보여주었다. E. 如汕에 대한 키토산 및 HMW-C0S의 항균활성은 처리시간을 증가시킴으로써 항균활성이 증가함을 보였으며, 이들 의 항균기 작을 조사하기 위한 SEM의 관찰에서, 세균들은 키 토산에 의해 응집되어 서로 엉켜있는 형태를 보여주고 있었다. 이러한 현상은 키토산 및 HMW-C0S7} 세균의 증식을 명확하게 억제하고 있음을 보여주는 증거라 할 수 있다.
- 한편 MMW-COS와 LMW-COS는 모두 측정된 농도범 위 에서 항균활성이 60%를 넘지 못하였다. 그리고 이들 두 키토산올리고당의 MIC값도 모두 10, 000 ppm 을 나타내어 항균활성이 미 약한 것으로 확인되었다. HMW- COS의 MIC값은 5,000 ppm으로서 키토산의 MIC값 1, 250 ppm 보다는 높게 나타났지 만, Vibrio sp.
- 와 Streptococcus sp.는 키토산 및 HMW-C0S의 처리시간이 1시간 이후에는 큰 변화가 없었던 것과 달리 E. tarda는 1시간 처리 에서는 약 60%의 항균활성을 보이 던 것이 2시간 의 처리에서는 약 80%의 항균활성을 보여 시료의 처리시간의 증가에 따라 항균활성이 증가함을 보였다. 처리시간이 3시간으로 길어졌을 때에는 키토산 처리시 항균활성이 약간 더 증가하였으나, HMW-COS 처리에서는 항균활성이 거의 증가하지 는 않았다.
- 이러한 사실은 키 토산 의 탈아세틸화도를 변화시 킴으로써 간접적으로 증명되었다 (24, 25, 48). 따라서 본 연구에서 제시한 키토산의 항균활성에 대한 SEM 관찰에서 보면 지금까지 알려진 항균기 작을 뒷 받 침하는 결과라 판단된다.
- 처리시간이 3시간으로 길어졌을 때에는 키토산 처리시 항균활성이 약간 더 증가하였으나, HMW-COS 처리에서는 항균활성이 거의 증가하지 는 않았다. 본 실험에서 알 수 있듯이 , 세균에 대하여 키토산 및 키토산올리고당의 처리시간(혹은 접종시간)이 길어질 경우 세균의 성장을 효율적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
- 하지만 키토산올리고 당의 처리에 의해서 세균은 서로 응집되기 시작하였으며, 비교적 분자량이 큰 키 토산올리고당인 HMW-COS 처리 세균 에서는 많은 부분들이 그들의 형 태가 서로 엉켜져 있음을 알 수 있었다. 앞의 실험결과에서 밝혀진 것처럼, E. tarda의 성 장에 대하여 가장 항균활성이 높은 것으로 나타난 키토산으 로 처리하였을 경우, 대부분의 세균들이 정상적으로 성장하고 있지 않음을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 키토산 혹은 키토산올리고당의 분자구조에서 양이온 전하를 띠고 있는 아민들이 E.
- 의 성장을 매우 효과적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다. 양식넙 치로부터 분리한 3종의 병 원성 세균에 대하여 키토 산올리고당을 처리한 후 배양시간의 경과에 따른 세균의 성 장곡선을 측정한 결과, Fig. 4에서 보는 것과 같이 모든 세 균 들은 배양 3~5일까지는 성장이 증가하였으나 그 이후로는 감소하였다. Vibrio sp.
- Streptococcus sp.에 대한 키토산올리고당의 항균활성을 측정한 결과, Fig. 3에서 보는 것과 같이 키 토산 뿐만 아니라 비교적 고분자의 키토산올리고당인 HMW-COS의 모든 농도범위 에서 100%의 항균활성을 보였다. 하지만 MMW-C0S와 LMW-COS는 모든 농도범위 에서 20% 이하의 매우 낮은 항 균활성을 보였다.
- 에 대해서 높은 항 균활성을 나타내었다. 이들에 대한 결과는 키토산의 항균활 성은 분자량에 따라 크게 의존한다는 사실을 보여주었다. E.
- tarda는 1시간 처리 에서는 약 60%의 항균활성을 보이 던 것이 2시간 의 처리에서는 약 80%의 항균활성을 보여 시료의 처리시간의 증가에 따라 항균활성이 증가함을 보였다. 처리시간이 3시간으로 길어졌을 때에는 키토산 처리시 항균활성이 약간 더 증가하였으나, HMW-COS 처리에서는 항균활성이 거의 증가하지 는 않았다. 본 실험에서 알 수 있듯이 , 세균에 대하여 키토산 및 키토산올리고당의 처리시간(혹은 접종시간)이 길어질 경우 세균의 성장을 효율적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
- 의 성 장을 거의 100% 저 해하였다. 키토 산올리고당 중 비교적 분자량이 큰 HMW-COS는 시료의 농도가 500 ppm에서 약 80% 정도의 항균활성을 보였으며 1,000 ppm까지 농도를 증가시 켜도 항균활성의 뚜렷한 증가 는 보이지 않았다. 한편 MMW-COS와 LMW-COS는 모두 측정된 농도범 위 에서 항균활성이 60%를 넘지 못하였다.
- 키토산을 제외한 3종류의 키 토산올리고당을 1,000 ppm까지 첨가하였을 때 50% 정도의 항균활성을 보였으며, 키토산올리고당들 사이 에는 유의 성은 없었다. 키토산은 500 ppm의 농도에서 약 75%의 항균 활성을 보였으며 , 1,000 ppm의 농도에서도 약 80%의 매우 완만한 활성 증가 만을 보여 주었다. E.
- 2에 나타내었다. 키토산을 제외한 3종류의 키 토산올리고당을 1,000 ppm까지 첨가하였을 때 50% 정도의 항균활성을 보였으며, 키토산올리고당들 사이 에는 유의 성은 없었다. 키토산은 500 ppm의 농도에서 약 75%의 항균 활성을 보였으며 , 1,000 ppm의 농도에서도 약 80%의 매우 완만한 활성 증가 만을 보여 주었다.
- 따라서 키토산 및 키토산올리고당을 이용한 어류 유래 연쇄구균증에 대한 항균활성에 관한 좀 더 구체적인 효과를 다양하게 검색할 필요가 있을 것으로 보인다. 한편, 본 연구에서 사용된 균주 중 키토산 및 키토산올리고당에 가장 내성이 강한 것으로 밝 혀진 E. tarda의 경우, 처리시간을 3시간으로 증가시킴으로 써 항균활성을 높일 수 있었으며, 이에 대한 결과를 SEM을 통하여 관찰하여 명확하게 세균의 성장이 억제됨을 확인할 수 있었다. 이러한 사실은 키토산 및 HMW-COS이 E.
후속연구
- 따라서 천연물로부터 어류의 세균성 질병을 예방하기 위한 천연 항균성 물질을 탐색하는 연구가 요구되고 있으며, 이러한 천연 항균물질은 식품 보존제나 병원성 미생물 살균 제로서 기존의 합성제품을 대체할 수 있을 것이다.
- 에 키 토산 및 HMW-C0S의 접 종 시간이 10분 이상만 되면 항균활성은 거의 100%에 도달한 다는 사실은 매우 놀라운 결과라 할 수 있다. 따라서 키토산 및 키토산올리고당을 이용한 어류 유래 연쇄구균증에 대한 항균활성에 관한 좀 더 구체적인 효과를 다양하게 검색할 필요가 있을 것으로 보인다. 한편, 본 연구에서 사용된 균주 중 키토산 및 키토산올리고당에 가장 내성이 강한 것으로 밝 혀진 E.
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