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문제 정의
- 본 연구는 우리나라에서 육성된 인삼천풍 종자를 재료로 하여 식물생장 조절제 처리에 의하여 부정근을 유도하고 특정 성분의 생리활성물질을 기내 조 직 배 양으로 대량생산하기 위하여 수행하였다. 우선적 으로 인삼 부정 근의 생 장량과 ginsenosides의 함량을 높이기 위하여 다양한 배지를 종류별로 처 리하여 부정 근 생장량과 ginsenosides의 함량이 가장 양호한 배지조건을 확립하고, kinetin과 KHJQ를 추가적으로 처리하여 인삼 부정근의 생장량과 사포닌의 생산성 향상을 검 토하였다.
제안 방법
- 사포닌 화합물의 확인 및 정량에 사용된 개별 사포닌 성분인 ginsenosides 표준품(Rg1, Rf, Re, Rd, Rc, Rb2 Rb1)은 한국인삼연초 연구원에서 분양받은 것을 사용하였다. Chromatogram의 각peak는 표준품사포닌의 chromatography에 의하여 동정되었고, 각 ginsenosides의 함량은 표준품과 비교하여 peak 높이로 계산하였다.
- Ginsenosides의 함량은 수포화 n-butanol 추출법인 Ando등(1971)의 방법을 참조하였다. 건조시킨 분말 시료 0.5 g을 취하여 85C에서 메탄올 30 ml로 3회 추출하여 건조시킨 후 메탄올 엑기스를 얻은 다음에 테르로 추출하여 탈지시키고 수포 화 wbutanol로 3회 추출하고 이들을 모두 합하여 증류수로 1회 세척 한 후 수층은 버리고 n-butanol층만 감압. 농축시킨 후 HPLC용 메탄올 500 ul에 용해한 후 0.
- 고체 배지에서 부정근의 생장이 가장 효과적이었던 kinetin을 0~0.5 mg/L을 조합하여 처리한 배지에서 인삼 부정근을 배양하여 생장량과 ginsenosides 함량을 조사하였다. 그 결과 부정근의 생장은 kinetin 0.
- 인삼 부정근 생장율은 1/2 SH 액체배지 40 ml를 함유한 100 ml 삼각플라스크에 증식된 인삼 부정근 근단을 2-3 cm 길이로 잘라내어 5개씩 접종하여 암실에서 4주간 진탕배양기(100 rpm, 25℃)로 배양하였다. 수확된 인삼 부정근은 증류수로 세척하고 여과지로 건조시킨 후 생 체중(fresh weight)을 측정 하 였으며, 이들 시료들은 건조시켜 건중량(dry weight) 을 측정하였다.
- 본 연구는 우리나라에서 육성된 인삼천풍 종자를 재료로 하여 식물생장 조절제 처리에 의하여 부정근을 유도하고 특정 성분의 생리활성물질을 기내 조 직 배 양으로 대량생산하기 위하여 수행하였다. 우선적 으로 인삼 부정 근의 생 장량과 ginsenosides의 함량을 높이기 위하여 다양한 배지를 종류별로 처 리하여 부정 근 생장량과 ginsenosides의 함량이 가장 양호한 배지조건을 확립하고, kinetin과 KHJQ를 추가적으로 처리하여 인삼 부정근의 생장량과 사포닌의 생산성 향상을 검 토하였다.
- 인삼 부정근 생장율은 1/2 SH 액체배지 40 ml를 함유한 100 ml 삼각플라스크에 증식된 인삼 부정근 근단을 2-3 cm 길이로 잘라내어 5개씩 접종하여 암실에서 4주간 진탕배양기(100 rpm, 25℃)로 배양하였다. 수확된 인삼 부정근은 증류수로 세척하고 여과지로 건조시킨 후 생 체중(fresh weight)을 측정 하 였으며, 이들 시료들은 건조시켜 건중량(dry weight) 을 측정하였다.
- 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량에 미치는 KfLPO, 의 영향을 조사하고자 2 mg/L IBA가 함유된 B5배지 를 대조구로 하고 KH2PO4를 1.25, 2.50, 5.00 mM을 2 mg/L IBA가 함유된 B5배지 에 첨가한 후 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량을 측정하였다.
- 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량에 미치는 kinetin의 영향을 조사하고자 2 mg/L IBA가 함유된 B5 배지를 대조구로 하고 kinetin을 각각 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 mg/L를 2m/L IBA가 함유된 B5 배지에 첨가한 후 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량을 측정하였다.
- 인삼천풍의 배(embryo)로부터 부정근을 유도하고 배양배지조성, 식물 호르몬과 인삼염의 농도가 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 배지 종류별 인삼부정 근의 생장 량 은 B5, WPM, MS 배 지 순 으 로 높 았 으 며 , ginsenosides 함량은 B5배지에서 가장 높았으며 panaxa triol계 사포닌보다 panaxa di이계 사포닌이 증가하였다.
- 천풍종자로 부터 부정근을 유도하기 위하여 표면살균하고, 무균적으로 적출하여 5 mg/L IBA가 첨가된 1/2 SH 고체 배지에 2513암조건에서 4주간 배양하여 부정근을 유도하였다(Fig. 5A, B). 유도된 부정 근은 2 mg/L IBA가 첨가된 1/2 SH 고체배지 에 계대배양하여 25℃ 암 조건에서 1개월간 증식시킨 후, 동일 액체배지 에 25℃ 암 조건 하에서 100rpm으로 4주 간격으로 계대 배양하여 유지 였다 (Fig.
- 물기를 제거한 종자는 무균적으로 배를 적출하여 5 mg/L IBA(Indole 3- butyric acid)가 함유된 1/2 SH 고체배지 에 옮긴 후 25 ±1 ℃ 에서 암배양하여 부정근을 유도하였다. 천풍종자로부터 유도한 부정근은 근단을 2~3 cm 길이로 잘라 2 mg/L IBA가 첨가된 1/2 SH 액체배지로 옮기고 암조건 하에서 진탕배양기(100 rpm, 25P)기로 배 양하면서 4주 간격으로 계대 배양하여 유지 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 천풍(Fawx ginseng C.A. Meyer "Chunpoong")종자는 포장에서 수확하여 개갑한 것을 "한국인삼연초연구원"으로 부터 분양받아 개갑종자를 흐르는 물에 3일간 침지한 후 1주일간 그늘에서 건조한 후 사용하였다.
- 사포닌 화합물의 확인 및 정량에 사용된 개별 사포닌 성분인 ginsenosides 표준품(Rg1, Rf, Re, Rd, Rc, Rb2 Rb1)은 한국인삼연초 연구원에서 분양받은 것을 사용하였다. Chromatogram의 각peak는 표준품사포닌의 chromatography에 의하여 동정되었고, 각 ginsenosides의 함량은 표준품과 비교하여 peak 높이로 계산하였다.
- 실험에 사용된 SH(Schenk and Hidebrandt, 1972), MS(Murashige and Skoog, 1962), WPM(Lloyd and McCown, 1981), B5(Gamborg et al., 1968) 배지는 stock solution을 각각 해당량씩 첨가한 후 3% sucrose 를 넣어 제조한 후에 0.5 N HC1 용액을 사용하여 pH 를 5.8로 조절하고 100 ml 삼각플라스크에 40 ml씩 분주한 후, 121 P에서 15분간 고압멸균하여 사용하였다.
이론/모형
- Ginsenosides의 함량은 수포화 n-butanol 추출법인 Ando등(1971)의 방법을 참조하였다. 건조시킨 분말 시료 0.
성능/효과
- 6 이하로 감소하였다. Ginsenosides 생산성은 3 처리구 모두 유사하였으나, 1.25 mM 처리구 에서 다소 양호한 경향으로 나타났다.
- 3A). Ginsenosides 함량은 전체적으로 대조구에 비하여 모두 높았다. Kinetin 0.
- 01 mg/L 첨가에서 ginsenoside R0의 함량이 크게 증가하였다. KHPCh 를 추가 첨가할때에는 부정근의 생장에 2.5 mM에서 대조구에 비해 양호하였으나, ginsenosides의 함량은 1.25 mM에서 높았으며, 특히 ginsenosides Re의 급격한 증가로 인하여 panaxa triol계 사포닌의 함량이 증가되었다.
- Ginsenosides 함량은 전체적으로 대조구에 비하여 모두 높았다. Kinetin 0.01 mg/L 처리구에서 총 ginsenosides 함량이 11.65 mg/g 로 가장 높게 나타났으며, PD/PT 조성비 가 kinetin의 농도가 증가함에 따라 panaxa triol계 사포닌의 비율 이 증가하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 3B). 생장량을 고려한 ginsenosides 생산성 은 kinetin 0.
- 4B). PD/PT 조성 비율은 control에서 L66으로 가장 높았고, KH2PO4를 첨가한 처리구에서 PD/PT 조성비가 0.6 이하로 감소하였다. Ginsenosides 생산성은 3 처리구 모두 유사하였으나, 1.
- 5 mg/L을 조합하여 처리한 배지에서 인삼 부정근을 배양하여 생장량과 ginsenosides 함량을 조사하였다. 그 결과 부정근의 생장은 kinetin 0.1 mg/L의 조합에서 가장 양호하였으나, 농도가 가장 높았던 0.5 mg/L에서는 인삼 부정근의 생장이 오히 려 저하되 었다(Fig. 3A). Ginsenosides 함량은 전체적으로 대조구에 비하여 모두 높았다.
- 그 결과 인삼 부정근은 액체배지에서 진탕배양하는 것이고체배지에서 배양할 때보다 빠르게 생장하였다(Fig. ID). 이렇게 증식된 인삼 부정근의 형태는 Agrobaterium rhizogenes에 의 해 유도된 모상근과 유사하였으며 , 새로 자라는 부정근은 가늘며 흰색을 띄고배 양기간이 경과함에 따라 부정근의 굵기가 두 꺼워지고 노란색이 진해지는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 인삼천풍의 배(embryo)로부터 부정근을 유도하고 배양배지조성, 식물 호르몬과 인삼염의 농도가 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 배지 종류별 인삼부정 근의 생장 량 은 B5, WPM, MS 배 지 순 으 로 높 았 으 며 , ginsenosides 함량은 B5배지에서 가장 높았으며 panaxa triol계 사포닌보다 panaxa di이계 사포닌이 증가하였다. 식물생장조절제 처리구에서의 인삼 부정근의 생장량은 kinetin 0.
- 3B). 생장량을 고려한 ginsenosides 생산성 은 kinetin 0.01 mg/L의 조합에서 12.89 mg/flask로 가장 높은 함량을 나타내었 으나, 0.05 및 0.1 mg/L 조합에서도 각각 12.68, 12.39 mg/flask로 거의 차이가 나지 않았다. 이상의 결과로 보면 인삼의 부정근 배양에 있어서 오옥신 계열인 IBA 호르몬 단독 처리구 보다는 kimetin을 병용처리 하는 것이 부정근의 생장과 사포닌의 생산에 더 효율적 인 것으로 사료된다.
- 배지 종류별 인삼부정 근의 생장 량 은 B5, WPM, MS 배 지 순 으 로 높 았 으 며 , ginsenosides 함량은 B5배지에서 가장 높았으며 panaxa triol계 사포닌보다 panaxa di이계 사포닌이 증가하였다. 식물생장조절제 처리구에서의 인삼 부정근의 생장량은 kinetin 0.1 mg/L에서 높게 나타났으며 , ginsenosides 함량은 kinetin 0.01 mg/L에서 오히려 높게 나타났다. 특히 kinetin 0.
- ID). 이렇게 증식된 인삼 부정근의 형태는 Agrobaterium rhizogenes에 의 해 유도된 모상근과 유사하였으며 , 새로 자라는 부정근은 가늘며 흰색을 띄고배 양기간이 경과함에 따라 부정근의 굵기가 두 꺼워지고 노란색이 진해지는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. ID).
- 39 mg/flask로 거의 차이가 나지 않았다. 이상의 결과로 보면 인삼의 부정근 배양에 있어서 오옥신 계열인 IBA 호르몬 단독 처리구 보다는 kimetin을 병용처리 하는 것이 부정근의 생장과 사포닌의 생산에 더 효율적 인 것으로 사료된다.
- 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량에 미치 는 KBPO, 의 영향을 조사하기 위하여 B5 기본 배지 에 1.25, 2.5, 5.0 mM로 각각 첨가하여 배양한 결과 인삼 부정근의 생장은 2.5 mM 첨가 배지 에서 12.16 g/flask로 1.25 mM 첨가배지의 11.78 g/flask보다 양 호하였다(Fig. 4A). Ginsenosides의 함량은 1.
- 인삼 부정근의 생장과 사포닌 생산에 가장 효과적 인 배지를 선택하기 위하여 1/2 MS, MS, 1/2 SH, 3/4 SH, SH, B5, WPM 등 7종의 배지에서 배양하여 비교한 결과 인삼 부정근의 생장, ginsenosides의 함량 및 생산성이 B5 배지에서 가장 양호하였다(Fig. 2). 인삼부정근의 생장은 B5 배지에서 배양하였을 때 919 mg/flask로 MS 배지 의 658 mg/flask 및 1/2 MS 배 지 의 639 mg/flask, WPM 배 지 의 742 mg/flask 등보다 생장량이 높게 나타났다(Fig.
- 2). 인삼부정근의 생장은 B5 배지에서 배양하였을 때 919 mg/flask로 MS 배지 의 658 mg/flask 및 1/2 MS 배 지 의 639 mg/flask, WPM 배 지 의 742 mg/flask 등보다 생장량이 높게 나타났다(Fig. 2A).
- Yamakawa 등(1983)은 Vitis callus 배양 에서 phosphate 농도가 증가할수록 생장은 증가 하나 2차 대사 산물인 anthocyanin 생산이 감소된다고 보고하였다. 즉 인삼 부정근과 Vitis callus는 식물종이 다른데도 불구하고 유사한 결과를 보인 것은 phosphate가 2차 대사 산물의 생산에 영향을 미치는 조절인자로서 작용하는 것으로 보이며, phosphate의 부족으로 인한 2차대사산물의 증대 효과는 주요 효소의 활성 변화에 기인하는 것으로 사료된다. 따라서 인삼 부정근의 액체 배양을 통한 대량생산을 위해서는 phosphate의 첨가량을 적정량 선발하여 사용하여야 할 것으로 사료된다.
후속연구
- 이러한 결과는 Fujita 등(1981)의 연구결과에서 지치의 캘러스에서 shikonin을 생산하기 위하여 도입한 생장용 최적 배지 MG-5와 색소 합성을 위한 최적 배지 M-9를 서로 다르게 사용한 것에서도 알 수 있으며, Yonemitsu 등(1990)도 Lobelia inflafa에서 유도한 모상근 배양시 MS, 1/2MS, B5 배지에서 배양한 모상근이 생장이 빠르고, NN 배지에 배양한 모상근의 생장은 1/3 정도로 떨어지지만 단위 그램당 lobeline 함량은 오히려 3배 정도 높아진다고 하였다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때 인삼 부정근에 있어서도 생장과 유용물질 생산을 위한 2단계 의 배양을 통하여 부정 근 생 장과 ginsenosides의 생성에 적절한 배 지 조건을 선발한다면 보다 효율적으로 인삼 부정 근 을 대량으로 생산할 수 있을 것으로 사료된다.
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