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문제 정의
- 본 연구에서는 모기 유충 방제에서 Bt 내독소 단백질의 야외적용에서 제기되고 있는 단점들을 개선하기 위하여, Amaranthus 의 광합성에 관여하는 psbA promoter를 이용하여, PCR로 증폭된 cryl lAa 유전자를 발현하는 형질전환된 Synechocystis PCC6803 을 제작하고, 모기 유충에 대한 살충효과를 정량적으로 조사하였다.
제안 방법
- 발현 벡터 pSyn4D를 제작하기 위해, "유전자에 특이적인 primer(cry-F와 cry-R)를 제작하고, 주형으로 cryllAa 유전자를 포함하고 있는 pCG5 벡터를 이용하였다(Fig. 1A). cryllAa 유전자를 증폭시키기 위해, 0.
- S. PCC6803의 형질전환은 Dzelzkans와 Bogorad의 방법(1986)을 변형하여 수행하였다. S.
- Synechocystis PCC6803 에서 모기 살충성 cryllAa 유전자를 발현시키기 위해, pCG5 벡터를 주형으로 하 여 cryllAa 유전자를 PCR을 이용해 증폭하였다. 증폭 된 cryllAa 유전자를 H诚加I와 &小으로 처리하고, Amaranthus hybridusS] 광합성에 관여하는 psbA promoter/]- 조절하는 위치에 클로닝하여 pSyn4D 벡 터를 제작하였다(Fig.
- 3B). Tr2C의 모기유충에 대한 살충효과 발현시간을 알아 보기 위하여, 시간 경과에 따른 살충력을 반수치사시 간(LT50)으로 분석하였다(Table 1). 형질전환체 Tr2C 는 작은빨간집모기 유충에 비해서 중국얼룩날개모기 유 충에 더 빠른 살충효과를 보였으며, 자연형 S.
- 1A). cryllAa 유전자를 증폭시키기 위해, 0.2 |_iM PCR primer, 0.1 |ig pCG5 벡터, 200 |1M dNTP, 1 卩 1 Taq polymerase(5 units, Promega Co., USA), 10X 반응 완충액을 넣고, 멸균증류수를 이용하여 전체 부피를 50 卩1로 맞춘 후, polymerase chain reaction (PCR) 을 수행하였다. PCR 반응은 94°C에서 1분 55°C에서 1분, 72°C에서 2분 30초간 반응시키는 주기로 40회 반복하였다.
- Bt subsp. morrisoni PG-14와 Escherichia coli 균주는 각각 28°C와 37°C에서 Luria-Bertani 배지를 이용하여 배양하였다.
- 1 N이 되도록 첨가하고 37°C에서 30분간 방치하였다. 단백질 시료 완충 액(0.25 M Tris-HCl, pH6.8, 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% Sucrose, 0.004% Bromophenol blue)을 첨가하고, 3분간 중탕하고 3, 000 g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 시료로 사용하였다.
- Goat anti-mouse IgG-alkaline phosphatase conjugate를 10, 000배 희석하여, NC membrane과 1시간 동안 반응시키고, PBST 완충액으로 5분간 5회 씻어 주었다. 단백질 탐지는 ECL detection kit (Amersham Co., USA)를 이용하여 X-ray 필름을 현상하였다.
- 선발된 형질전환체 Tr2C를 BG-11 배지에 접종하고, OD730 측정값이 1.5-2.0이 될 때까지 배양한 다음, 2, 500 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 세포의 농도를 106cells/ml 조정하고, 3 반복으로 처리하였다 실험 곤 충으로 작은빨간집모기 (CWex tritaeniorhynchus)와 중국얼룩날개모기 sinensis) 3령 유충을 사용하였다.
- 03 에서 모기 살충성 cryllAa 유전자를 발현시키기 위해, pCG5 벡터를 주형으로 하 여 cryllAa 유전자를 PCR을 이용해 증폭하였다. 증폭 된 cryllAa 유전자를 H诚加I와 &小으로 처리하고, Amaranthus hybridusS] 광합성에 관여하는 psbA promoter/]- 조절하는 위치에 클로닝하여 pSyn4D 벡 터를 제작하였다(Fig. 1A). pSyn4D 벡터를 %cl과 Fwdl로 처리하였을 때, 각각 9.
- PCC6803을 이용하였다. 치사율은 24시간마다 조사하였으며, probit 분석을 통해서 중간 치사 시간(LT50)을 계산하였다.
대상 데이터
- 5% BG-11 top agar와 섞고, 1% BG니 1 평판배지에 도말하여, 12시간 후에 kanamycin (20 卩g/ml)로 선발하였다. 2주일 후에 평판배지에 나타난 11개 콜로니들을 선발하고 kanamycin 이 첨가된 BG-U 평판배지에 도말하여 성장하는 3개 콜로니들 을 재선발하였다. 생물검정을 통해 작은빨간집모기 3령 유충에 가장 높은 독성을 보인 형질전환체 Tr2C 를 본 연구에 이용하였다.
- 단백질을 Nitrocellulose (NC) membrane (Advantec, USA)으로 옮긴 후, 50 ml PBST 완충액에 넣고, 10% blocking (5 g skim milk/50 ml PBST 완충액) 용액에 상 온에서 2시간 동안 처리하였다. Cry 11 Aa 단백질의 탐지는 쥐에서 얻은 polyclonal 항체를 이용하였다. CryllAa 항체를 1, 000배 희석하여 3시간 동안 반응시키고, PBST 완충액으로 5분간 3회 씻어주었다.
- Data are the mean±SD of triplicate assays from two independent experiments. Each measurement was done with 20 larvae.
- , USA)와 Gill 박시《Univ, of California, Riverside, USA)로부터 분양받았다. S. PCC6803은 30 °C에서 장일 과 단일조건을 16:8 비율로 BG-11 과 Medium C (Cote and Ghema, 1994)를 이용하여 배양하였다. Bt subsp.
- PCC6803의 형질전환은 Dzelzkans와 Bogorad의 방법(1986)을 변형하여 수행하였다. S. PCC6803을 BG-11 배지에서 OD730 측정값이 0.8-1.2가 될 때까지 배양하고, 2, 500rpm에서 25°C, 5분 동안 원심분리하였다. 침전물을 BG-11 배지로 현탁한 후 세포의 농도가 108/ml이 되도록 조정하였다.
- 양 성대조구로 Bt subsp. morrisoni PG 14의 내독소 단백 질을, 음성대조구로 자연형 S. PCC6803의 단백질을 사용하였다. 약 72-kDa 크기의 CryllAa 단백질이 Bt subsp.
- 03 와 Bacillus thuringiensis (Bt) subsp. morrisoni PG-14 균주는 각각 Bogorad 박사 (Harvard Univ., USA)와 Gill 박시《Univ, of California, Riverside, USA)로부터 분양받았다. S.
- 세포의 농도를 106cells/ml 조정하고, 3 반복으로 처리하였다 실험 곤 충으로 작은빨간집모기 (CWex tritaeniorhynchus)와 중국얼룩날개모기 sinensis) 3령 유충을 사용하였다. 대조 구로 자연형 S. PCC6803을 이용하였다. 치사율은 24시간마다 조사하였으며, probit 분석을 통해서 중간 치사 시간(LT50)을 계산하였다.
- 8 kb를 나타내 어 유전자가 클로닝된 것을 확인하였 다(미제시 자료). 발현벡터 pSyn4D를 S. PCC6803에 형질전환하여 형성되는 콜로니를 2회에 걸쳐 kana mycin 저항성을 띠는 콜로니들을 선발하고, 이들 중 작은빨간집모기 (CWex tritaeniorhynchus) 유충에 가장 높은 독성을 보인 형질전환체 Tr2C를 최종 선발하였 다. 형질전환체 Tr2C에서 cryllAa 유전자를 확인하기 위하여, 자연형 S.
- 2주일 후에 평판배지에 나타난 11개 콜로니들을 선발하고 kanamycin 이 첨가된 BG-U 평판배지에 도말하여 성장하는 3개 콜로니들 을 재선발하였다. 생물검정을 통해 작은빨간집모기 3령 유충에 가장 높은 독성을 보인 형질전환체 Tr2C 를 본 연구에 이용하였다.
- 0이 될 때까지 배양한 다음, 2, 500 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 세포의 농도를 106cells/ml 조정하고, 3 반복으로 처리하였다 실험 곤 충으로 작은빨간집모기 (CWex tritaeniorhynchus)와 중국얼룩날개모기 sinensis) 3령 유충을 사용하였다. 대조 구로 자연형 S.
- 형질전환체 Tr2C의 모기유충에 대한 살충효과를 검 정 하기 위해 , 작은빨간집 모기 와 중국얼룩날개 모기 유충을 이용하였다. 음성대조구로 자연형 S. PCC6803 을 사용하였다. 작은빨간집모기 3령 유충에 대한 살충 성은 형질전환체 처리 후 1-2일 사이에 가장 높게 증 가하였으나, 자연형 S.
- PCR로 증폭된 cryllAa 유전자를 //诚加1와 으로 처리한 후, cyanobacteria-E. 전이 벡터인 pOV81 에 클로닝 하여 pSyn4D를 제작하였다(Fig. 1A). PCR primer 서열은 cry-F (sense pri mer): 5/-cccaagc?raggaggttatatggaagatagttctttag (이탤릭체는 Hindlll 인식 부위, 밑줄 친 부분은 개시코 돈)과 cry-R (anti-sense primer): S'-acgcgfcgacattacaagaggagc- cacaatac (이탤릭체는 Sall 인식부위, 밑줄 친부*은 정 지코 돈)이다.
- 형질전환체 Tr2C의 모기유충에 대한 살충효과를 검 정 하기 위해 , 작은빨간집 모기 와 중국얼룩날개 모기 유충을 이용하였다. 음성대조구로 자연형 S.
이론/모형
- Bt subsp. moTTis。, " PGT 4의 내독소 단백질의 분리 는 Kim 标 以 (1998)의 방법을 이용하였다. 선발된 형질전환체 Tr2C는 20 卩g/ml kanamycin 이 첨가된 BG- 11 배지에서 OD730에서 측정값이 1.
- 형질전환체 Tr2C에서 cryllAa 유전자가 발현되는 것을 조사하기 위하여, 쥐에서 생산한 CryllAa 단백 질의 항체를 이용하여 Western blot을 수행하였다. 양 성대조구로 Bt subsp.
성능/효과
- c湖의 T7)를 이용하여 cry4Aa와 유전자를 동시에 A PCC7120에서 발현시켰다 tandem promoter를 이용하여 발현된 CryllAa와 Cry4Aa 단백질은 Bt에서 보고된 것처럼 Ae. aegypti 유충에 대해 살충상승효과를 보였으며, 반수치사농도 (LD50)는 약 ICPcells/ml이었으며, 가장 높은 치사율을 보인 농도는 5 X IO, cells/ml이 었다. Soltes-Lak et al.
- 이들 형질전환체들 중에서 Cx. resfwms 유충에 대 해 petFl promoter^- 이용한 형 질전환체가 가장 높은 살충력을 보였으며, 살충력의 증가는 Tr2C와 비슷하게 1-2일사이에 가장 높게 나 타났다. Wu et al.
- (1997) 이 보고한 형질전환체가 4년간 선택압이 없는 조건에서도 모기 유충에 대한 독성이 유지되며, 형질전환체의 살충효과 유지는 내독소 단백질 유전자가 형질전환체의 genomic DNA에 존재함으로써 가능하다고 보고하였 다. 이 결과는 모기 유충에 독성을 보이는 cryHAa 유 전자가 형질전환체의 genomic DNA에 존재함으로써, 제작된 형질전환체가 안정적인 내독소 단백질을 발현 할 수 있음을 보여준다(Fig. IB).
- (1987)과 Murphy and Stevens (1992)가 보卫한 형질전환체의 살충력보다 높 았으며, Tr2C의 살충력 발현시간은 접종 후 3일부터 빨간집모기 유충에 독성효과가 나타났다는 결과 (Murphy and Stevens, 1992)에 비해 살충효과가 매우 빠르게 나타났다. 이상의 결과들은 Tr2C에서 A. hybri- dt/s의 psbA promoter가 cyanobacteria에서 cryllAa -n- 전자를 안정적으로 발현시키며, 발현된 CryllAa 단백 질은 모기 유충에 높은 살충력을 가진다는 것을 보여 준다.
- PCC6803 을 사용하였다. 작은빨간집모기 3령 유충에 대한 살충 성은 형질전환체 처리 후 1-2일 사이에 가장 높게 증 가하였으나, 자연형 S. PCC6803은 조사기간 동안 살 충성을 보이지 않았다(Fig. 3A). 중국얼룩날개모기 3 령 유충의 경우에서도 형질전환체는 접종 후 1일 이 내에 높은 살충력을 보였으나, 자연형은 조사기간 동 안 유의성 있는 살충력을 보이지 않았다(Fig.
- Tr2C의 모기유충에 대한 살충효과 발현시간을 알아 보기 위하여, 시간 경과에 따른 살충력을 반수치사시 간(LT50)으로 분석하였다(Table 1). 형질전환체 Tr2C 는 작은빨간집모기 유충에 비해서 중국얼룩날개모기 유 충에 더 빠른 살충효과를 보였으며, 자연형 S. PCC6803 의 경우, 살충력을 보이지 않아 값을 추정할 수 없었 다. 모기 유충 간의 살충효과의 차이는 모기 유충의 이동, 호흡, 형질전환체의 깊이에 따른 분포에 의한 차 이 인 것으로 생각된다.
- 형질전환체 Tr2C는 소규모의 야외 포장 실험에서 살충효과 조사기간 동안(6주) 모기 유충의 개체 증가를 억제하는 것으로 조사되어, 야외환경에서도 살충효과가 안정적임을 확인하였다 (미제시 자료). 이것은 형질 전환체 Tr2C는 야외 조건에서 자외선에 대해서 영향을 받지 않고, 환경에 적응하고 증식하여, 모기 유충이 형질전환체를 먹이로 이용함으로써, 발현된 CryllAa 단백질이 모기 유충의 수적 증가를 지속적으로 억제하는 것으로 생각된다.
- PCC6803에 형질전환하여 형성되는 콜로니를 2회에 걸쳐 kana mycin 저항성을 띠는 콜로니들을 선발하고, 이들 중 작은빨간집모기 (CWex tritaeniorhynchus) 유충에 가장 높은 독성을 보인 형질전환체 Tr2C를 최종 선발하였 다. 형질전환체 Tr2C에서 cryllAa 유전자를 확인하기 위하여, 자연형 S. PCC6803과 Tr2C에서 genomic DNA를 분리하고 cry〃而 유전자에 특이적인 primer (cry-F, -R)를 이용하여 PCR을 수행한 결과, Tr2C오) 양성대조구로 쓰인 pCG5 벡터에서만 cry]lAa 유전자 에 특이적인 PCR 산물을 얻었으며, 그 크기는 약 2.0 kb였다(Fig. IB). Wu et al.
후속연구
- 이상의 결과들을 종합하면, cryllAa 유전자를 발현하는 형질전환체 Tr2C가 작은 빨간집모기와 중국 얼룩 날개 모기 유충에 대하여 높은 독성, 야외 살충력 검정에서 높은 살충효력과 지속적인 살충효과를 보임으로써, Bt 내 독소 단백질의 모기 유충 방제에서 제기된 단점들을 극복하고, 생물학적인 방제수단으로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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