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문제 정의
- 본 연구의 목적은 HSV-2의 표면 항원들 중에서 체액성 면역반응을 가장 강하게 일으킨 항원이 바이러스 어느 위치에 어떻게 분포하는지를 immunogold를 붙여서 투과 전자현미경 기법으로 관찰하여 가장 강하게 유발하는 항원의 위치를 규명하고 분석, 연구하는데 있다. 이 연구는 결과적으로 HSV-2의 백신 개발과 중화항체를 개발하는 기초가 되고자 한다.
- 연구하는데 있다. 이 연구는 결과적으로 HSV-2의 백신 개발과 중화항체를 개발하는 기초가 되고자 한다.
- 이 연구는 면역전자현미경 기법으로 HSV-2 감염에서 항체 생산을 유발하는 주요 항원의 위치를 확인해 주었으며, 향후 백신 개발을 위한 한 목표 항원을 제시하였다는데 의의가 있다고 사려 된다.
제안 방법
- 15분 동안 고정하였다. 37℃ 항온기에서 HSV-2에 대한 항체를 PBS에 1:100으로 희석하여 1시간 반응시킨 다음 PBS로 3분씩 3회 세척한 후 FITC (Fluorescein-Isothiocyanate)가 붙어 있는 goat anti-mouse IgG+IgM+IgA(Cappel, West Chester) 2차 항체를 PBS에 1:1,000으로 희석하여 슬라이드 글라스 위에 100㎕씩 분주하고 37℃ 항온기에서 1시간 반응시켰다. PBS로 3 분씩 3회 세척한 후 mounting buffer (PBS:glycerol=5:l)를 도말 부위에 1방울 떨어뜨리고 커버 글라스를 덮은 후에 기포를 완전히 제거하여 형광현미경(Olympus BH-2, Japan)으로 검경하였다.
- 6~8주 된 BALB/c 마우스를 암·수 구별 없이 한 그룹당 3마리씩 3 그룹에 각각 1 X 10 virus/mio] 되도록 PBS(pH 7.4)로 희석하여 HSV-2형 바이러스 0.5 ml을 복강으로 주사하였고, 음성 대조군으로 PBS(pH 7.4) 0.5 ml을 복강 주사하여 면역 처리하였다.
- 37℃ 항온기에서 HSV-2에 대한 항체를 PBS에 1:100으로 희석하여 1시간 반응시킨 다음 PBS로 3분씩 3회 세척한 후 FITC (Fluorescein-Isothiocyanate)가 붙어 있는 goat anti-mouse IgG+IgM+IgA(Cappel, West Chester) 2차 항체를 PBS에 1:1,000으로 희석하여 슬라이드 글라스 위에 100㎕씩 분주하고 37℃ 항온기에서 1시간 반응시켰다. PBS로 3 분씩 3회 세척한 후 mounting buffer (PBS:glycerol=5:l)를 도말 부위에 1방울 떨어뜨리고 커버 글라스를 덮은 후에 기포를 완전히 제거하여 형광현미경(Olympus BH-2, Japan)으로 검경하였다.
- )에 전이시켰다. Standard marker 가 전이된 nitrocellulose paper를 amido black 염색액 (Sigma Chemical Co., U.S.A.)으로 10분간 염색한 다음 탈색용액 (Isopropanol 25 ml, acetic acid 10 ml, H2O 65 ml)으로 탈색하여 단백질 전이를 확인한 다음 Western blot을 진행하였다. 전이된 nitrocellulose paper를 3% BSA/TBS (Tris-Buffered Saline; 2 M Tris-HCL 5 ml, 4 M NaCl 37.
- Vero 세포에 바이러스가 침투한 후 세포파괴 현상(cytopathic effect)이 나타날 때까지 위상차 현미경으로 매일 관찰하였다. 위상차 현미경상에서 2일 후 세포파괴 현상이 관찰되었고, 8일 후에 바이러스 역가를 측정하였다.
- 완전히 건조 후에 2차 염색인 lead citrate로 3 분간 염색 후 멸균증류수로 1분씩 15회 세척하였다. 건조 후 transmission electron microscopy (Hitachi -7100. Japan)로 관찰하였다.
- 멸균증류수로 1분씩 5회 세척 후 건조시켰다. 건조된 검체 Grid를 transmission electron microscopy (Hitachi-7100. Japan)로 관찰하였다.
- 단층으로 자란 Vero 세포를 PBS로 세척한 다음 5 ml의 PBS에 0.1-0.01 M.O.I (Multiplicity of Infection)가 되게 바이러스를 감염하여 HSV-2에 의해 감염된 Vero 세포를 cytopatFic effect (CPE)가 완전히 끝날 때까지 배양하였으며, -70℃ deep freezer에서 냉동과 해동을 3회 반복한 후 1, 400 Xg에서 20분간 원심 분리하여 가라앉은 pellet을 PBS 16㎕로 희석한 후 샘플을 만든 다음 5X sample buffer를 1:4 (v/v) 비율로 희석하여 100℃에서 약 5분간 중탕한 후 SDS-PAGE를 위한 시료로 사용하였다. SDS-PAGE는 12%의 Seperating gel과 5% stacking gel로 구성된 불연속 전기영동 시스템을 이용하여 120 Valt에서 전개하였다.
- MD)을 사용하였다. 바이러스는 EMEM 배지에 2% FBS를 첨가하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 증식 후 50% Tissue Culture Infection Dose (TCID50)에 의해 바이러스의 역가를 측정하였다(18).
- 숙주세포 배양에 사용된 기본 배지는 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)을 사용하고 fetal bovine serum (FBS)를 5%을 첨가하여 37℃에서 배양하고 항생물질 용액을 첨가하였다.
- 위상차 현미경상에서 2일 후 세포파괴 현상이 관찰되었고, 8일 후에 바이러스 역가를 측정하였다. 세포 배양액을 polyethylene glycol을 이용한 탈수작용(hydroextractiorD과 ultracentrifugatioirir 실시하여 바이러스의 50% endpoint 역가를 측정한 결과 1 X 109 virus/ml를 얻을 수 있었다.
- 3 kDa)로 종 8개의 단백질로 구성되어 있다. 전개 후 gel을 Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma-Chemical Co., U.S.A.)로 30분간 염색하고 탈색용액 (methanol 100 ml, 잉acial acetic acid 100 ml, H2O 800 ml)으로 30분씩 2번 탈색하여 Vero 세포에 감염된 HSV-2의 단백질 밴드와 위치를 확인하였다.
대상 데이터
- Vero 세포주(African green monkey kidney cell, ATCC CCL 81)는 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에서 분양 받았다. 숙주세포 배양에 사용된 기본 배지는 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)을 사용하고 fetal bovine serum (FBS)를 5%을 첨가하여 37℃에서 배양하고 항생물질 용액을 첨가하였다.
- 실험에 사용된 바이러스는 건국대학교 유전공학연구소에서 분양 받은 Hperpes simples virus type 2 strain G (ATCCVR-734, Rockvill, MD)을 사용하였다. 바이러스는 EMEM 배지에 2% FBS를 첨가하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 증식 후 50% Tissue Culture Infection Dose (TCID50)에 의해 바이러스의 역가를 측정하였다(18).
이론/모형
- Immunoblote Towin(31)의 빙"법에 따라 Western blotting kit (NOVEX, Japan)를 사용하여 전기영동한 gel을 transfer buffer (Trise base 1.93 g, glycine 9 g, H2O 11)로 250 mA에서 1시간 30분 동안 nitrocellulose paper (Hybridization transfer membranes, Hybond-C, Amersharm, U.S.A.)에 전이시켰다. Standard marker 가 전이된 nitrocellulose paper를 amido black 염색액 (Sigma Chemical Co.
- HSV-2형 바이러스에 대한 항체가 바이러스에 감염되어진 숙주 세포에 표현된 바이러스 항원을 인식하는지를 조사하기 위해서 간접 면역형광 항체 법을 시행하였다. HSV-2에 감염된 Vero 세포가 원형의 봉입체를 형성한 숙주세포를 검체로 하여 항체를 반응시킨 결과 Vero 세포의 표면에 원형의 형광 반응을 나타내었다(Fig.
- SDS-PAGE는 Laemmli(9)의 방법을 따라 실시하였다. 단층으로 자란 Vero 세포를 PBS로 세척한 다음 5 ml의 PBS에 0.
- 음성 염색을 하기 위해서 준비해 둔 바이러스 검체를 drop-to- drop 방법으로 Grid film에 검체를 흡착시켰다(17). 탈수와 PEG 침전을 통해서 농축한 바이러스 10 pl을 parafilm 위에 한 방울 떨어뜨린 후, Fonnvar-Carbon coated 300-mesh nickle grid(Electron Microscopy Science, U.
성능/효과
- 수 있었다. 31, 43, 59, 69 kDa의 분자량을 가진 항원들이 공통으로 나타났으며, 감염 48시간 후에 측정한 43, 59 kDa 의 두 항원이 가장 두드러진 발현을 보였다(Fig. 1). 감염 후 48 시간에 측정한 SDS-PAGE에서 훨씬 선명하고 진한 밴드를 확인할 수 있었다.
- HSV-2 G strain이 감염된 Vero 세포에서는 감염 후 24시간 후에 발현 단백질 분자량을 측정한 결과 19 kDa과 161 kDa 사이에서 총 12개의 밴드가 관찰되었고, 48시간 후에 단백질 분자량을 측정한 결과 21 kDa과 171 kDa 사이에서 총 17개의 밴드를 관찰할 수 있었다. 31, 43, 59, 69 kDa의 분자량을 가진 항원들이 공통으로 나타났으며, 감염 48시간 후에 측정한 43, 59 kDa 의 두 항원이 가장 두드러진 발현을 보였다(Fig.
- 간접 면역형광 항체 법을 시행하였다. HSV-2에 감염된 Vero 세포가 원형의 봉입체를 형성한 숙주세포를 검체로 하여 항체를 반응시킨 결과 Vero 세포의 표면에 원형의 형광 반응을 나타내었다(Fig. 3).
- 4). HSV-2형을 감염시킨 마우스로부터 채취한 polyclonal anti-HSV-2의 혈청을 37℃에서 1시간 항온 시킨 후 그 위에 anti-mouse IgG+IgM과 10nm의 금 입자가 표지된 2차 항체를 1 시간 항온 하여 전자 현미경으로 관찰한 결과 바이러스의 nucleocapsid와 2중막의 외투막이 뚜렷하게 구분되어 있는 것을 볼 수 있었다. 외투막 곳곳에 tegument을 확인할 수 있었고, colloidal gold 입자가 표면에 반응한 것으로 보아 항체 반응을 유발하는 항원들이 바이러스 표면에 위치하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 1). 감염 후 48 시간에 측정한 SDS-PAGE에서 훨씬 선명하고 진한 밴드를 확인할 수 있었다.
- 성숙한 형태의 gB, gC,gD, gE의 분자량은 각각 120, 115-130, 59-65, 80 kDa의 분자량 을 가지고 이들의 전구체는 110, 86-105, 51, 66 kDa의 분자량 을 가진다(26, 28, 30, 33). 따라서 본 실험에서 SDS-PAGE 결과가 43 kDa와 59 kDa의 분자량을 가진 밴드가 진하게 반응하였으며, 성숙한 형태의 gD의 정상범위인 59-65 kDa 범위에 포함 되는 것으로 보아 성숙한 gD 형태와 매우 밀접하게 나타났으며, HSV-2에 대한 항혈청으로 Western-blot에서는 51 kDa이 가장 진하게 발현하는 것으로 보아 이것은 비록 gD 범위보다는 약간 벗 어난 분자량이지만, 그것은 면역반응을 가장 강하게 유발했으며 glycoprotein D와 관련이 있는 것으로 추정되어진다. SDS-PAGE 상에서는 43, 59 kDa의 단백질 분자량을 가진 밴드가 가장 진하 게 발현되었으나 Westem-blot에서는 51 kDa의 분자량을 가진 항 원이 가장 강한 항체 반응을 보인것은, in vivo 상에서는 51 kDa 의 분자량을 지닌 항원이 가장 강하게 항원 항체 결합을 하는 것을 보여 주었다.
- 면역전자 현미경상에서 HSV-2의 음성염색에서는 nucleocapsid 와 외투막을 확실하게 구별할 수 있었고 외투막에서는 두·세 군데 돌출된 모양을 확인할 수 있었지만 spike는 확인할 수 없었다 (Fig. 4). HSV-2형을 감염시킨 마우스로부터 채취한 polyclonal anti-HSV-2의 혈청을 37℃에서 1시간 항온 시킨 후 그 위에 anti-mouse IgG+IgM과 10nm의 금 입자가 표지된 2차 항체를 1 시간 항온 하여 전자 현미경으로 관찰한 결과 바이러스의 nucleocapsid와 2중막의 외투막이 뚜렷하게 구분되어 있는 것을 볼 수 있었다.
- 위상차 현미경상에서 2일 후 세포파괴 현상이 관찰되었고, 8일 후에 바이러스 역가를 측정하였다. 세포 배양액을 polyethylene glycol을 이용한 탈수작용(hydroextractiorD과 ultracentrifugatioirir 실시하여 바이러스의 50% endpoint 역가를 측정한 결과 1 X 109 virus/ml를 얻을 수 있었다.
- HSV-2형을 감염시킨 마우스로부터 채취한 polyclonal anti-HSV-2의 혈청을 37℃에서 1시간 항온 시킨 후 그 위에 anti-mouse IgG+IgM과 10nm의 금 입자가 표지된 2차 항체를 1 시간 항온 하여 전자 현미경으로 관찰한 결과 바이러스의 nucleocapsid와 2중막의 외투막이 뚜렷하게 구분되어 있는 것을 볼 수 있었다. 외투막 곳곳에 tegument을 확인할 수 있었고, colloidal gold 입자가 표면에 반응한 것으로 보아 항체 반응을 유발하는 항원들이 바이러스 표면에 위치하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 어떤 곳은 3~5개의 금이 모여 있는 것을 볼 수 있었고(Fig.
후속연구
- SDS-PAGE 상에서는 43, 59 kDa의 단백질 분자량을 가진 밴드가 가장 진하 게 발현되었으나 Westem-blot에서는 51 kDa의 분자량을 가진 항 원이 가장 강한 항체 반응을 보인것은, in vivo 상에서는 51 kDa 의 분자량을 지닌 항원이 가장 강하게 항원 항체 결합을 하는 것을 보여 주었다. 이 분자량을 지닌 단백질이 HSV-2 백신 개발에 한 목표 단백질로 이용될 수 있을 것이다.
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