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문제 정의
- 보고되었다 [9, 28, 29]. 따라서 zeolite에 의한 암모늄 이온의 제거가 돼지유행성설사병 바이러스의 숙주세포인 Vero 세포성장에 어떠한 영향을 미치는지 먼저 조사하였다. Cultispher-G 미립담체에 고정 된 Vero 세포를 100 mL spinner flask에서 배양하면서, 배양 48 시간에 spinner flask의 impeller shaft를 zeolite가 부착된 impeller shaft로 교환하여 zeolite가 부착되지 않은 대조군과 세포성장을 비교하였다.
제안 방법
- 따라서 zeolite에 의한 암모늄 이온의 제거가 돼지유행성설사병 바이러스의 숙주세포인 Vero 세포성장에 어떠한 영향을 미치는지 먼저 조사하였다. Cultispher-G 미립담체에 고정 된 Vero 세포를 100 mL spinner flask에서 배양하면서, 배양 48 시간에 spinner flask의 impeller shaft를 zeolite가 부착된 impeller shaft로 교환하여 zeolite가 부착되지 않은 대조군과 세포성장을 비교하였다. 그 결과 Fig.
- Seed 바이러스를 생산하기 위하여 ^100 mm tissue culture dish 에 1乂105 cells/mL의 농도로 10 mL씩 Vero 세포를 접종하여 3일간 배양한 후, 배지를 제거하고, 0.1 MOI (Multiplicity of Infection) 로감염시켜 37 oC, 5% CO2 incubatoi에서 간헐적으로 흔들어주며 1 시간 동안 흡착시켰다. 흡착 1시간 후 바이러스가 포함된 배지를 제거하고, 바이러스 생산 배지를 세포배양 부피와 동일하게 넣어주었다.
- Zeolite 처리군과 대조군에서의 바이러스의 감염은 세포배양 72시간에 spinner flask의 교반을 멈추어 미립담체를 침강시킨 후 배지의 80% 를 제거하고, PEDV를 0.01 M이로 감염 시켜 1시간 동안 세포와 바이러스를 접촉시켜 바이러스를 감염한 후 PEDV를 생산하여 바이러스 역가를 측정하였다. Fig.
- 앞선 zeolite를 이용한 연구들에서 tPA나 단일클론항체와 같은 생성물의 수율이 암모늄 이온 제거에 의해 증가함에 따라 zeolite를 바이러스 백신 생산에도 적용해 보았다. Zeolite를 바이러스 백신 생산 시스템에 가장 효율적으로 적용하기 위하여 막 형태 고정화 흡착제가 부착된 Carberry type 생물반응기를 사용하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신을 생산하였다. 그 결과 zeolite는 바이러스 생산에 주로 이용되는 Vero 세포 성장에 독성을 나타내지 않았으며, 탁월한 암모늄 이온 제거 능을 보여주었다.
- Agarose 염색배지가 굳은 후 37 oC, 5% CO2 incubator에서 overnight하여 neutral red dye가 세포에 염색되도록 하였다. 다음날 계수하기에 적합한 희석배수에서의 plaque를 계산하여 역가를 측정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 투석막에 zeolite를 고정화한 흡착제를 적용한 Carberry type의 생물반응기를 이용하여 세포배양과 바이러스 생산 과정에서 암모늄 이온을 제거해 줌으로써 바이러스 백신의 역가 향상을 시도하였다.
- 본 연구에서는 Table 1과 같은 물리적 성질을 갖는 분말 형태인 Phillipsite-Gismondine synthetic zeolite(IW-85, UOP)를 Park 등 [28, 29]이 사용한 방법 중막 형태로 고정화하여 이용하였다. 막 형태의 고정화흡착제는 투석막 (retain M.
- 따라서 배양액 내에 생성 축적된 암모늄 이온을 제거한다면 세포 성장 및 생성물의 수율을 촉진할 것으로 예측할 수 있다. 앞선 zeolite를 이용한 연구들에서 tPA나 단일클론항체와 같은 생성물의 수율이 암모늄 이온 제거에 의해 증가함에 따라 zeolite를 바이러스 백신 생산에도 적용해 보았다. Zeolite를 바이러스 백신 생산 시스템에 가장 효율적으로 적용하기 위하여 막 형태 고정화 흡착제가 부착된 Carberry type 생물반응기를 사용하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신을 생산하였다.
- 17 g을 Ca2+, Mg2+- free PBS 로 overnight 팽윤시켰다. 팽윤 된 Cultispher-G를 121 oC, 20분간 가압멸균하였다. 멸균된 Cultispher-G를 10% FBS-DMEM: F12 배지로 3회 세척 후 37 oC, 5% CO2 incubator에서 1시간 동안 배양하였다.
- 포도당은 YSI 2700(YSI, USA)을 이용하여 분석하였고, 젖산과 암모늄 이온은 lactate assay kit(sigma, 735)오丰 ammonia assay kit(sigma, 171-B)를 이용하여 microplate reader에서 각각 540 nm와 340 nm 로 분석하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 바이러스 주는 돼지 유행성 설사병을 일으키는 약독화된 돼지 유행성 설사병 바이 러 스주(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, KPED-9)로써, (주)대성미생물연구소의 생독백신을 구입하여사용하였으며 , -80 oC deep freezer에 보관하였다.
- 본 실험에 사용한 세포주로 백신 생산에 널리 사용되는 Vero 세포 (African Green Monkey Kidney cell, ATCC CCL-81)를 사용하였匸上 세포배양을 위하여 10% Fetal Bovine Serum(FBS, JRS), 30 mM N아ICOeSigma), Streptomycin sulfate(100 μg/mL, Sigma), Penicillin G (100 units/mL, Sigma)가 첨가된 DMEM:F-12(Sigma)를 사용하여, 37 oC, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포의 계대배양을 위하여 ^100 mm tissue culture dish에 1乂105 cells/mL의 농도로 10 mL 씩 배양하며, 3일 간격으로 계대하였다.
이론/모형
- 세포의 계대배양을 위하여 ^100 mm tissue culture dish에 1乂105 cells/mL의 농도로 10 mL 씩 배양하며, 3일 간격으로 계대하였다. Heamocytometer를 이용한 trypan blue exclusion method를 이용하여 세포 농도를 즉정하였다.
- PEDV의 역가를 확인하기 위해 plaque assay를 사용하였다. 먼저 6 well culture plate에 Vero 세포를 b105 cells/mL의 농도로 각 well 에 2 mL씩 접종하고, 37 oC, 5% CO2 incubator에서 3일간 배양하여 세포가 culture vessel 표면을 80~90% 이상 덮으면 배지를 제거하고, 10배씩 serial dilution 한 바이러스 희석액을 접종하고, 1시간 동안 간헐적으로 흔들어서 바이러스가 세포에 흡착되도록 하였다.
성능/효과
- Zeolite를 바이러스 백신 생산 시스템에 가장 효율적으로 적용하기 위하여 막 형태 고정화 흡착제가 부착된 Carberry type 생물반응기를 사용하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신을 생산하였다. 그 결과 zeolite는 바이러스 생산에 주로 이용되는 Vero 세포 성장에 독성을 나타내지 않았으며, 탁월한 암모늄 이온 제거 능을 보여주었다. 또한 바이러스 생산에 있어서도 zeolite를 처리하지 않은 대조군과 비교해 2배 이상의 높은 바이러스 역가를 보여주었다.
- 바이러스 생산에 있어서는 zeolite 처리군의 경우 zeolite의 암모늄 이온 제거에 의해 대조군과 비교하여 2배 이상의 바이러스 역가가 향상됨을 보였다. 따라서 본 연구에서 적용한 막 형태의 고정화흡착제가 부착된 Carberry type 생물반응기는 CHO 세포나 hybridoma 세포배양뿐만 아니라 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 등 바이러스 백신의 생산에도 효율적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
- 그 결과 zeolite는 바이러스 생산에 주로 이용되는 Vero 세포 성장에 독성을 나타내지 않았으며, 탁월한 암모늄 이온 제거 능을 보여주었다. 또한 바이러스 생산에 있어서도 zeolite를 처리하지 않은 대조군과 비교해 2배 이상의 높은 바이러스 역가를 보여주었다. 이로써 zeolite가 암모늄 이온의 생성 축적에 의해 세포 성장 및 생산 수율이 저해되는 다양한 생물학적 공정을 개선할 수 있는 유용한 수단임을 확인하였고, 본 연구에서 사용한 변형된 Carberry type 생물반응기는 미립담체 응집의 축적과 같은 문제가 약간 있었지만 다양한 바이러스 백신 생산에 유용하게 사용될 가능성을 확인하였다.
- 8^106 pfu/mL의 역가를 보인 후에 계속 감소함을 보였다. 바이러스 생산에 있어서는 zeolite 처리군의 경우 zeolite의 암모늄 이온 제거에 의해 대조군과 비교하여 2배 이상의 바이러스 역가가 향상됨을 보였다. 따라서 본 연구에서 적용한 막 형태의 고정화흡착제가 부착된 Carberry type 생물반응기는 CHO 세포나 hybridoma 세포배양뿐만 아니라 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 등 바이러스 백신의 생산에도 효율적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
- 2(d)에서 zeolite 처리 군의 암모늄 이온 농도는 흡착으로 인해 세포배양 96시간을 기준으로 대조군 대비 57%의 암모늄 이온 농도를 보였다. 이 결과로 zeolite가 CHO, hybridoma 세포배양 외에 Vero 세포배양에서도 뛰어난 암모늄 이온 흡착능을 보여준다고 할 수 있다.
- 두 번째는 암모늄 이온이 생성되는 즉시 시스템으로부터 동시 제거하여 암모늄 이온의 축적을 방지하는 방법이다 [9, 21, 22]. 이 두 가지 방법 모두 암모늄 이온의 생성 저해 및 축적 방지의 장점을 보였으나 세포의 성장이나 여러 동물 세포에 각각 적용하는데 문제가 있거나 경제성이 떨어지는 등의 단점을 보였다. 이들 여러 방법 중 Jeong과 Wang[9]에 의해 소개된 합성 zeolite인 Phillipsite- Gismondinee 암모늄 이온에 대한 선택성과 흡착 용량이 높고 동물 세포에 무해하며 세포 배양액으로부터 암모늄 이온을 동시 제거함으로써 세포 성장 및 생산성 향상을 도모할 수 있다는 점과 배양 중간에 손쉽게 적용할 수 있다는 점에서 다른 방법들보다 장점이 있었다.
- 또한 바이러스 생산에 있어서도 zeolite를 처리하지 않은 대조군과 비교해 2배 이상의 높은 바이러스 역가를 보여주었다. 이로써 zeolite가 암모늄 이온의 생성 축적에 의해 세포 성장 및 생산 수율이 저해되는 다양한 생물학적 공정을 개선할 수 있는 유용한 수단임을 확인하였고, 본 연구에서 사용한 변형된 Carberry type 생물반응기는 미립담체 응집의 축적과 같은 문제가 약간 있었지만 다양한 바이러스 백신 생산에 유용하게 사용될 가능성을 확인하였다. 향후 zeolite가 단일 세포나 미립담체에 고정된 세포 모두에 범용적으로 적용될 수 있는 흡착제 시스템의 개발이 암모늄 이온의 축적 문제를 안고 있는 동물 세포 배양 시스템의 효율 향상을 위해 절실히 요구된다.
후속연구
- 이로써 zeolite가 암모늄 이온의 생성 축적에 의해 세포 성장 및 생산 수율이 저해되는 다양한 생물학적 공정을 개선할 수 있는 유용한 수단임을 확인하였고, 본 연구에서 사용한 변형된 Carberry type 생물반응기는 미립담체 응집의 축적과 같은 문제가 약간 있었지만 다양한 바이러스 백신 생산에 유용하게 사용될 가능성을 확인하였다. 향후 zeolite가 단일 세포나 미립담체에 고정된 세포 모두에 범용적으로 적용될 수 있는 흡착제 시스템의 개발이 암모늄 이온의 축적 문제를 안고 있는 동물 세포 배양 시스템의 효율 향상을 위해 절실히 요구된다.
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