[국내논문]Donor 세포의 종류 및 세포처리에 따른 소 체세포 핵이식란의 체외발육 Development of Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos Following Donor Cell Type and Cell Treatment in Cattle원문보기
본 연구는 체세포의 종류, 세포 제공 개체, 계대배양 수 및 세포의 trypsin 처리시간이 소 체세포 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 세 종류의 체세포(피부, 근육 및 난구세포) 와 암소 3 개체를 실험에 공시하였으며, 한 개체 유래의 피부세포는 5∼30회 계대배양하였고, 핵이식 전에 1∼3분간 trypsin처리하여 핵이식에 사용하였다. 핵이식과정은 상법에 따라 전기융합법을 이용하였다. 핵이식란의 배반포 발육율은 세포의 종류(16.5∼23.9%)나 개체 간(16.4∼19.5%)에 차이가 없으나, 30회 계대 배양한 세포를 사용한 경우(5.8%)에는 5회(25.3%) 또는 15회(23.5%) 계대 배양한 세포를 사용한 경우에 비해 유의적으로 낮았다(P＜0.05). 또한, 1분간 trypsinization 한 세포를 사용한 경우(30.7%)는 3분간 trypsinization 한 경우에 비해 배반포 발육율이 유의적으로 높게 나타났다(P＜0.05). 본 연구의 결과는 소 체세포 핵이식란의 발육이 체세포의 종류 및 세포 제공 개체에 따라서는 영향을 받지 않으나, passage 수 및 체세포의 trypsinization 시간에 따라서는 영향을 받을 수 있음을 시사한다.
본 연구는 체세포의 종류, 세포 제공 개체, 계대배양 수 및 세포의 trypsin 처리시간이 소 체세포 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 세 종류의 체세포(피부, 근육 및 난구세포) 와 암소 3 개체를 실험에 공시하였으며, 한 개체 유래의 피부세포는 5∼30회 계대배양하였고, 핵이식 전에 1∼3분간 trypsin처리하여 핵이식에 사용하였다. 핵이식과정은 상법에 따라 전기융합법을 이용하였다. 핵이식란의 배반포 발육율은 세포의 종류(16.5∼23.9%)나 개체 간(16.4∼19.5%)에 차이가 없으나, 30회 계대 배양한 세포를 사용한 경우(5.8%)에는 5회(25.3%) 또는 15회(23.5%) 계대 배양한 세포를 사용한 경우에 비해 유의적으로 낮았다(P＜0.05). 또한, 1분간 trypsinization 한 세포를 사용한 경우(30.7%)는 3분간 trypsinization 한 경우에 비해 배반포 발육율이 유의적으로 높게 나타났다(P＜0.05). 본 연구의 결과는 소 체세포 핵이식란의 발육이 체세포의 종류 및 세포 제공 개체에 따라서는 영향을 받지 않으나, passage 수 및 체세포의 trypsinization 시간에 따라서는 영향을 받을 수 있음을 시사한다.
This study was conducted to investigate the effects of donor cell type, individual, passage number and trypsinization time on the in vitro development of bovine somatic cell nuclear transfer embryos. Three cell types (skin, muscle and cumulus cells) and cells from 3 individuals were used for nuclear...
This study was conducted to investigate the effects of donor cell type, individual, passage number and trypsinization time on the in vitro development of bovine somatic cell nuclear transfer embryos. Three cell types (skin, muscle and cumulus cells) and cells from 3 individuals were used for nuclear transfer. Cell were passaged by 5, 15 or 30 times, and cell were trypsinized for 1 or 3 min before injection. Nuclear transfer were performed by conventional fusion method. Development rates to the blastocyst stage were not significantly different among three cell types (16.5∼23.9%) and individuals (16.4∼19.5%). Blastocyst formation rate of cloned embryos reconstituted with cells at passage 30 (5.8%) was significantly lower than those of embryos reconstituted with 5- and 15-passaged cells (25.3 and 23.5%, respectively, P＜0.05). The rate of embryos developed to the blastocyst stage was higher in embryos reconstituted with cells trypsinized for 1 min (30.7%) compared to embryos reconstituted with cells trypsinized for 3 min (P＜0.05). The result of the present study indicates that different donor cell types and individuals used in this study did not affect the development of cloned bovine embryos. However, passage number and trypsinization time of donor cells affect the in vitro development of cloned bovine embryos.
This study was conducted to investigate the effects of donor cell type, individual, passage number and trypsinization time on the in vitro development of bovine somatic cell nuclear transfer embryos. Three cell types (skin, muscle and cumulus cells) and cells from 3 individuals were used for nuclear transfer. Cell were passaged by 5, 15 or 30 times, and cell were trypsinized for 1 or 3 min before injection. Nuclear transfer were performed by conventional fusion method. Development rates to the blastocyst stage were not significantly different among three cell types (16.5∼23.9%) and individuals (16.4∼19.5%). Blastocyst formation rate of cloned embryos reconstituted with cells at passage 30 (5.8%) was significantly lower than those of embryos reconstituted with 5- and 15-passaged cells (25.3 and 23.5%, respectively, P＜0.05). The rate of embryos developed to the blastocyst stage was higher in embryos reconstituted with cells trypsinized for 1 min (30.7%) compared to embryos reconstituted with cells trypsinized for 3 min (P＜0.05). The result of the present study indicates that different donor cell types and individuals used in this study did not affect the development of cloned bovine embryos. However, passage number and trypsinization time of donor cells affect the in vitro development of cloned bovine embryos.
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문제 정의
본 연구는 체세포의 종류, 세포 제공 개체, 계대 배양 수 및 세포의 trypsin 처리 시간이 소 체세포 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 세 종류의 체세포(피부, 근육 및 난구세포)와 암소 3개체를 실험에 공시하였으며, 한 개체 유래의 피부세포는 5~30회계대배양하였고, 핵이식 전에 1~3분간 trypsin 처리하여 핵이식에 사용하였다.
따라서, 본 연구는 체세포의 종류, 세포 제공 개체, passage 수 및 tiypsinization 시간에 따른 소 체세포 핵이식란 의 체외발육 능을 검토하였다.
Arat 등 (2001)도 소의 과립세포를 15회 계대 배양한 경우 10~13회 계대 배양된 경우보다 복제란의 발육율이 더 높았다고 보고하였다. 본 연구에서는 Donor 세포의 passage 수가 15회까 지는 발육 능에 차이가 없어 위의 연구들과 다소 다른 결과를 보였다. 또한, passage를 30회까지 반복할 경우에는 발육 능이 유의적으로 저하되었고, 세포의 형태에도 악영향을 미치는 것으로 확인되었다.
제안 방법
피부 및 근육세포는 한우 암소의 귀 조직으로부터 회수하였고, 난구 세포는 동일 개체 유래의 성숙된 난자-난구 세포 복 합체로부터 회수하였다. 회수된 세포는 10% FBS, 0.
모든 미세조작은 실온에서 DIC 장치와 Narishige 미 세조 작기가 갖춰진 도립현미경을 이용하여 mineral oil로 피복된 cytochalasin B(CB)를 함유한 TCM-199 + 3 mg/ml BSA의 배양 소적(50 ml) 내에서 실시하였다. 체외에서 18~20시간 성숙시킨 난포란의 난구세포를 제거한 후, 세포질의 색조가 균일 하고 제 1극체가 확인된 난자만을 선별하여 제 1극체와 주변의 세포질을 약 1/3 정도 흡입하여 제2 유사분열 중기 염색체를 제거하는 방법으로 탈핵을 실시하였다.
모든 미세조작은 실온에서 DIC 장치와 Narishige 미 세조 작기가 갖춰진 도립현미경을 이용하여 mineral oil로 피복된 cytochalasin B(CB)를 함유한 TCM-199 + 3 mg/ml BSA의 배양 소적(50 ml) 내에서 실시하였다. 체외에서 18~20시간 성숙시킨 난포란의 난구세포를 제거한 후, 세포질의 색조가 균일 하고 제 1극체가 확인된 난자만을 선별하여 제 1극체와 주변의 세포질을 약 1/3 정도 흡입하여 제2 유사분열 중기 염색체를 제거하는 방법으로 탈핵을 실시하였다. 탈핵 조작된 세포질은 1 ug/ml의 Hoechst 33342(Sigma)를 함유한 TCM-199 액에 15분간 염색(Westhusin 등, 1992)하여 형광현미경으로 탈핵 여부를 검사하였다.
체외에서 18~20시간 성숙시킨 난포란의 난구세포를 제거한 후, 세포질의 색조가 균일 하고 제 1극체가 확인된 난자만을 선별하여 제 1극체와 주변의 세포질을 약 1/3 정도 흡입하여 제2 유사분열 중기 염색체를 제거하는 방법으로 탈핵을 실시하였다. 탈핵 조작된 세포질은 1 ug/ml의 Hoechst 33342(Sigma)를 함유한 TCM-199 액에 15분간 염색(Westhusin 등, 1992)하여 형광현미경으로 탈핵 여부를 검사하였다.
재구축란의 전기 융합은 BTX 세포융합 장치 (BTX San Diego, CA, USA) 및 0.5-mm 폭의 wire chamber를 이용하여 실시하였다. 재구축란은 0.
5-mm 폭의 wire chamber를 이용하여 실시하였다. 재구축란은 0.1 mM MgSd, 0.05 mM CaCl2, 0.05 mg/ml BSA를 첨가한 0.3 M mannitol 용액을 넣은 wire chambers] 양 전극 사이로 옮겨, 1.5 kV/cm의 직류(DC)전류를 30 us 간 1회 통전하여 융합을 유기하였다. 융합이 확인된 핵이식란은 융합 1시간 후 10 uM의 Ca**-ionophore (A23187; Sigma)로 5분간 처리 후 즉시 10 ug/ml 농도의 2 mM의 6-dimethylaminopurine(6-DMAP, Sigma)을 함유한 체외배양액의 drop 내로 옮겨 4시간 동안 배양하여 활성화를 유기하였다.
활성화 처리 후 핵이식란은 3 mg/ml BSA가 함유된 CRlaa 배양액의 50 ul drop으로 옮겨 5% CCh 및 39℃의 조건하에서 48시간 배양하여, 극체 방출 유무 및 분할율을 검사하였 다 분할된 핵이식 란은 10% FBS를 함유한 CRlaa 내로 옮겨 5~7일간 추가 배양하여 배반포 형성율을 검사하였다.
실험 1) 성체 피부세포, 난구 세포 및 근육세포를 이용하여 핵이식 후 세포 형태별 복제란의 체외 발육 능을 검토하였다.
실험 2) 한우 3개체의 피부세포를 이용하여 핵이식 후 복 제란의 개체별 체외 발육 능을 검토하였다.
실험 3) 동일 개체로부터 얻어진 피부세포를 각각 5, 15 및 30 passage 별로 나누어 핵 이식하여 passage 수에 따른 복제란의 발육능을 검토하였다.
실험 4) Donor 세포를 0.05% ttypsin-EDTA 용액에 각각 1분 과 3분 처리 후 핵 이식하여 trypsin 처리 시간에 따른 복제란의 발육능을 검토하였다.
대상 데이터
본 연구는 체세포의 종류, 세포 제공 개체, 계대 배양 수 및 세포의 trypsin 처리 시간이 소 체세포 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 세 종류의 체세포(피부, 근육 및 난구세포)와 암소 3개체를 실험에 공시하였으며, 한 개체 유래의 피부세포는 5~30회계대배양하였고, 핵이식 전에 1~3분간 trypsin 처리하여 핵이식에 사용하였다. 핵이식과정은 상법에 따라 전기융합법을 이용하였다.
, 39P의 조건하에서 16~24시간 성숙 배양하였다. 난포란의 성숙배양액은 TCM-199액(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에 10% FBS(Gibco-BRL), 0.2 mM Na- pyruvate, 0.02 U/ml FSH(Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 /zg/mC 17f-estradiol(Sigma) 및 50 iig/'snl gentamicin(Gibco*BRL)을 첨가한 것을 사용하였다.
데이터처리
실험의 결과는 Duncan의 다중검정 및 LSD 검정에 의해 유의성을 검정하였다.
이론/모형
세 종류의 체세포(피부, 근육 및 난구세포)와 암소 3개체를 실험에 공시하였으며, 한 개체 유래의 피부세포는 5~30회계대배양하였고, 핵이식 전에 1~3분간 trypsin 처리하여 핵이식에 사용하였다. 핵이식과정은 상법에 따라 전기융합법을 이용하였다. 핵이식란의 배반포 발 육율은 세포의 종류(16.
핵이식 조작은 Campbell 등(1996)의 방법에 준하여 실시하였다. 배양 체세포는 0.
성능/효과
결론적으로, 본 연구의 결과는 소 체세포 핵이식란의 발 육이 체세포의 종류 및 세포 제공 개체에 따라서는 영향을 받지 않으나, passage 수 및 체세포의 trypsinization 시간에 따라서는 영향을 받을 수 있음을 시사한다. 따라서 donor 세포는 passage 수가 15회를 넘지 않는 체세포를 되도록 짧은 시간 동안 trypsin 처리하여 회수한 후 사용하는 것이 바람직할 것으로 사료된다.
소의 피부세포, 난구 세포 및 근육세포를 이용하여 핵이식 한 결과, 난구 세포를 이용한 경우 2세포기(84.8%) 및 상실배 (38.0%)의 발육율이 피부세포를 이용한 경우보다 유의적으로 높게 나타났으나(P<0.05), 배반포 발육율에서는 각각 17.9%, 23.9% 및 16.5%로 유의적인 차이가 인정되지 않았다 (Table 1).
한우 3개 체 (YS, TW 및 Kuk) 에서 피부세포를 회수하여 핵 이식한 결과, 분할율에서는 Kuk(84.8%)으로부터 회수한 피 부세포를 이용한 경우 YS(74.8%)보다 유의적으로 높은 비율을 나타냈다(F<0.05). 그러나 상실배기 발육율은 21.
Donor 세포의 passage 수를 5회 (P5)와 15회(?15)까지 반복한 경우, 핵이식 후 배반포 형성율(23.5~25.3%)이 저하되지 않았으나, 30회(P30)까지 반복하였을 경우에는 P5 및 P15에 비하여 유의적(, <0.05)으로 낮은 배반포 형성율(5.8%)을 나타내었다(Table 3). 또한 passage를 오래 반복할 경우에는 세포의 doubling time 및 형태에 나쁜 영향을 미치는 것으로 나타났다(미제 시).
동일 개체의 체세포를 0.05% trypsin-EDTA 용액으로 각각 1분과 3분간 처리한 결과, 1분간 처리하였을 때(30.7%)가 3분간 처리하였을 때(19.2%) 보다 배반포 형성율이 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 한편, tiypsin으로 1분간 처리 하였을 때의 융합율(43.
한편, 본 연구에서는 개체 간의 비교에 있어서도 동일한 종류의 세포를 사용할 경우에는 핵이식란의 발육율에 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 Kato 등 (1998)의 연구 결과에서 보듯이 동일 개체의 세포 line 간에도 발육 능에 차이가 있는 점으로 볼 때 개체 간 차이도 존재할 수 있는 것으로 판단된다.
본 연구에서는 Donor 세포의 passage 수가 15회까 지는 발육 능에 차이가 없어 위의 연구들과 다소 다른 결과를 보였다. 또한, passage를 30회까지 반복할 경우에는 발육 능이 유의적으로 저하되었고, 세포의 형태에도 악영향을 미치는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 판단 지표로 삼은 passage 수는 세포의 population doubling(PD)과는 일치하지 않으며, 실제 PD 수는 passage 수의 2~3배에 이를 것으로 추산된다.
결론적으로, 본 연구의 결과는 소 체세포 핵이식란의 발 육이 체세포의 종류 및 세포 제공 개체에 따라서는 영향을 받지 않으나, passage 수 및 체세포의 trypsinization 시간에 따라서는 영향을 받을 수 있음을 시사한다. 따라서 donor 세포는 passage 수가 15회를 넘지 않는 체세포를 되도록 짧은 시간 동안 trypsin 처리하여 회수한 후 사용하는 것이 바람직할 것으로 사료된다.
결론적으로, 본 연구의 결과는 소 체세포 핵이식란의 발 육이 체세포의 종류 및 세포 제공 개체에 따라서는 영향을 받지 않으나, passage 수 및 체세포의 trypsinization 시간에 따라서는 영향을 받을 수 있음을 시사한다. 따라서 donor 세포는 passage 수가 15회를 넘지 않는 체세포를 되도록 짧은 시간 동안 trypsin 처리하여 회수한 후 사용하는 것이 바람직할 것으로 사료된다.
핵이식과정은 상법에 따라 전기융합법을 이용하였다. 핵이식란의 배반포 발 육율은 세포의 종류(16.5~23.9%)나 개체 간(16.4~ 19.5%) 어〕차이가 없으나, 30회계대 배양한 세포를 사용한 경우 <5.8%)에는 5회(25.3%) 또는 15회(23.5%)계대 배양한 세포를 사용한 경우에 비해 유의적으로 낮았다 (F< 0.05). 또한, 1분간 trypsinization 한 세포를 사용한 경우(30.
05). 또한, 1분간 trypsinization 한 세포를 사용한 경우(30.7%)는 3분간 trypsinization 한 경우에 비해 배반포발육율이 유의적으로 높게 나타났다(F<0.05).본 연구의 결과는 소 체세포 핵이식란의 발육이 체세포의 종류 및 세포 제공 개체에 따라서는 영향을 받지 않으나, passage 수 및 체세포의 trypsinization 시간에 따라서는 영향을 받을 수 있음을 시사한다.
후속연구
그러나 Kato 등 (1998)이 진행한 최초의 체세포 복제 소생 산 연구에서 난구 세포가 난관 세포에 비하여 배반포 발육율 이 높은 것으로 보고하고 있어 세포의 종류에 따른 발육능 의 차이가 어느 정도 인정된다고 판단된다. 다만, 본 연구에서는 체세포의 종류에 따른 복제 수정란의 생산에서 피부세 포, 난구 세포 및 근육세포의 핵이식 결과, 유의적인 차이를 나타내지 않았으며 타 세포에 대한 난구 세포의 비교우위도 확인할 수 없었다.
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