두릅열수추출물이 당뇨유발 흰쥐의 간조직 중 유해 활성산소 대사효소계 활성에 미치는 영향 Effects of Aralia elata Water Extracts on Activities of Hepatic Oxygen Free Radical Generating and Scavenging Enzymes in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats원문보기
Wistar계 흰쥐에게 두릅열수추출물을 7주간 급여하였으며 당뇨유발은 희생 2주전 streptozotocin을 투여하여 혈당이 300 mg/dL 이상인 흰쥐를 대상으로 유해 활성 산소 대사계에 미치는 영향을 구명하였다. 간조직 중의 유해 활성산소 생성계인 P-450 함량과 XO 및 AD 활성은 정상군에 비하여 당뇨대조군에서 유의적으로 감소된 반면, AH 활성은 증가 되었다. 두릅열수추출물 급여로 이들 유해 활성 생성계 효소 활성 변화가 완화되는 것으로 나타났다. 또한 SOD, CAT, GSH-Px 및 GST, GR과 같은 유해 활성산소 제거계와 G6PD 효소들은 당뇨유발로 유의적인 증가를 보였으나, 두릅열수추출물 급여군에서는 이들 효소 활성이 낮았다. 당뇨유발로 항산화물질인 글루타티온 함량은 유의적으로 감소된 반면 지질과산화물 생성은 유의적으로 증가되었다. 그러나 두릅열수추출물 급여는 당뇨대조군의 이들 함량 변화를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 두릅열수추출물 급여는 STZ 투여로 인한 유해 활성산소 대사계 변화를 완화시킬 뿐만 아니라 지질과산화물 생성을 억제함으로써 산화적 스트레스로 인한 당뇨합병을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
Wistar계 흰쥐에게 두릅열수추출물을 7주간 급여하였으며 당뇨유발은 희생 2주전 streptozotocin을 투여하여 혈당이 300 mg/dL 이상인 흰쥐를 대상으로 유해 활성 산소 대사계에 미치는 영향을 구명하였다. 간조직 중의 유해 활성산소 생성계인 P-450 함량과 XO 및 AD 활성은 정상군에 비하여 당뇨대조군에서 유의적으로 감소된 반면, AH 활성은 증가 되었다. 두릅열수추출물 급여로 이들 유해 활성 생성계 효소 활성 변화가 완화되는 것으로 나타났다. 또한 SOD, CAT, GSH-Px 및 GST, GR과 같은 유해 활성산소 제거계와 G6PD 효소들은 당뇨유발로 유의적인 증가를 보였으나, 두릅열수추출물 급여군에서는 이들 효소 활성이 낮았다. 당뇨유발로 항산화물질인 글루타티온 함량은 유의적으로 감소된 반면 지질과산화물 생성은 유의적으로 증가되었다. 그러나 두릅열수추출물 급여는 당뇨대조군의 이들 함량 변화를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 두릅열수추출물 급여는 STZ 투여로 인한 유해 활성산소 대사계 변화를 완화시킬 뿐만 아니라 지질과산화물 생성을 억제함으로써 산화적 스트레스로 인한 당뇨합병을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
Oxidative stress is currently suggested as a mechanism underyling diabetes. Accordingly, the present study was designed to evaluate the effect of Aralia elate water extracts (AEW) on activities of hepatic oxygen free radical generating and scavenging enzymes in streptozotocin (STZ)-induced diabetic ...
Oxidative stress is currently suggested as a mechanism underyling diabetes. Accordingly, the present study was designed to evaluate the effect of Aralia elate water extracts (AEW) on activities of hepatic oxygen free radical generating and scavenging enzymes in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats. Male Wistar rats divided into nondiabetic group, diabetic group, and diabetic-AEW supplemented group. The extract was supplemented in 1.14% of raw Aralia elata/kg diet for 7 weeks. Diabetes was induced by injecting STZ (55 mg/kg BW, ip) once 2 weeks before sacrifying. The hepatic cytochrome P-450 content, xanthine oxidase and aminopyrine N-demethylase activities were significantly lowered in the diabetic group compared to the nondiabetic group. Whereas, the activities of aniline hydroxylase and oxygen free radical scavenging enzymes, superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and glutathione S-transferase, were significantly higher in the diabetic group than in the nondiabetic group. However, the supplementation of AEW normalized these enzyme activities in STZ-induced diabetic rats. When the AEW was supplemented with the diabetic rats, hepatic glutathione content was markedly elevated as well as lipid peroxide level was significantly lowered compared to those of the diabetic group. Thus, these results suggested that AEW supplement enhanced the activities of oxygen species metabolizing enzymes in STZ-induced diabetic rats.
Oxidative stress is currently suggested as a mechanism underyling diabetes. Accordingly, the present study was designed to evaluate the effect of Aralia elate water extracts (AEW) on activities of hepatic oxygen free radical generating and scavenging enzymes in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats. Male Wistar rats divided into nondiabetic group, diabetic group, and diabetic-AEW supplemented group. The extract was supplemented in 1.14% of raw Aralia elata/kg diet for 7 weeks. Diabetes was induced by injecting STZ (55 mg/kg BW, ip) once 2 weeks before sacrifying. The hepatic cytochrome P-450 content, xanthine oxidase and aminopyrine N-demethylase activities were significantly lowered in the diabetic group compared to the nondiabetic group. Whereas, the activities of aniline hydroxylase and oxygen free radical scavenging enzymes, superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and glutathione S-transferase, were significantly higher in the diabetic group than in the nondiabetic group. However, the supplementation of AEW normalized these enzyme activities in STZ-induced diabetic rats. When the AEW was supplemented with the diabetic rats, hepatic glutathione content was markedly elevated as well as lipid peroxide level was significantly lowered compared to those of the diabetic group. Thus, these results suggested that AEW supplement enhanced the activities of oxygen species metabolizing enzymes in STZ-induced diabetic rats.
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문제 정의
Seifulla⑼는 알록산으로 유발한 당뇨흰 쥐에 있어 두릅나무 껍질의 항당뇨 효능을 보고하였으며, Meshcherskaya 등(10)은 저혈당작용, Lee와 Kim(11)은 당뇨 유발 토끼에서 혈당강하작용을 보고하였다. 따라서 본 연구에서는 두릅열수 추출물이 당뇨 유발 흰쥐의 유해 활성산소 생성계와 제거계 효소 활성 변화에 미치는 영향을 살펴봄으로써 두릅의 항당뇨 효능을 검증하고자 하였다.
제안 방법
Wistai계 흰 쥐에게 두릅열수 추출물을 7주간 급여하였으며 당뇨 유발은 희생 2주 전 streptozotocin을 투여하여 혈당이 300 mg/dL 이상인 흰쥐를 대상으로 유해 활성산소대사계에 미치는 영향을 구명하였다. 간 조직 중의 유해 활성산소 생성계인 P-450 함량과 XO 및 AD 활성은 정상군에 비하여 당뇨 대조군에서 유의적으로 감소된 반면, AH 활성은 증가되었다.
기포 생성이 끝난 후 분광광도계를 사용하여 파장 400- 500 nm에서 마이크로 소옴 분획과 CO 결합마이크로소옴 상호간 스펙트럼 차이를 그려 P-450 CO-complex에 의한 흡광량으로 하고, P-450 CO-complex의 몰흡광계수( e =91 mMTcmT)를 이용하여 함량을 계산하였다. P-450 함량은 마이크로 소옴 단백질 1 mg당 nmol로 나타내었다.
실험동물은 Wistar계의 이유한 웅성 흰쥐 30마리를 10일간 기본식이로 적응시킨 후 평균 체중이 120±10 g인 것을 난 괴법에 의해 정상군(Nondiabetic), 당뇨 대조군(Diabetic) 및 두릅열수 추출물군(Diabetic-AEW)으로 나누어 7주간 사육하였다. 당뇨 유발(12)은 실험 종료 2주 전에 streptozotocin (STZ, Sigma Chemical Co.
25 M 수크로오스 용액 을가하여 균질기로 빙냉하에서 마쇄하여 얻은 균질액(20%, w/v)을600Xg에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상층액을 얻었다. 이를 IQOOOXg에서 20분간 원 심분리(Hitachi 20PR-520) 하여 미토콘드리아 분획을 취하였으며, 분리된 상층액을 105,000Xg에서 1시간 동안 초원 심 분리하여 시토졸분획과 마이크로 소옴 분획을 취하였다.
희생 전 16시간 절식시킨 후에테르로 가볍게 마취시켜 개복하고 복부 대동맥으로 채혈한 후 빙냉의 0.25 M 수크로오스 용액으로 간을 관류하여 혈액을 제거한 다음 간 조직을 적출하였다. 간 조직 1 g당 4배량의 0.
대상 데이터
3)에 녹여 체중kg당 55 mg을 1회복강주사하였다. 당뇨 유발 3일 후 꼬리의 정맥혈을 취하여 비공복시 혈당이 300mg/dL 이상인 동물 8마리를 사용하였다. 사육실 온도는 20±2℃로 유지하였으며 조명의 주기는 12시간(。8:00~20:00) 으로 조절하였다.
대구 약령시장에서 구입한 두릅의 뿌리를 세척하여 건조시킨 후 균질기로 조직을 파쇄하여 분말화하였다. 뿌리분말 100 g에 증류수 1000 mL를 가한 후 가열 맨 틀에서 3시간 진탕하여 여과한 다음 상층액을 진공회전증발기로 감압농축한 후 동결건조하여 사용하였다.
데이터처리
실험 결과는 SPSS package 프로그램을 이용하여 실험군 당 평균土표준편차로 표시하였고 각 군 간의 평균치의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test에 의해 검정하였다.
이론/모형
간 조직 중 P-450 함량은 Omura와 Sato의 방법(23)에 준하여 시험관 내에 마이크로 소옴 분획을 넣고 바늘을 통해 1분간 일산화탄소 가스를 발생시킨 후 환원제로 디터 오니트 나트륨 30 mg을 넣고 혼합하여 1분간 일산화탄소 가스를 발생시켰다. 이상의 조작은 4℃ 이하에서 행하였다.
간 조직 중의 AD와 AH 활성은 Imai 등의 방법(15), XO 활성은 Stirpe와 Della의 방법(16), SOD 활성도는 Marklund 와 Marklund의 방법(17)으로, CAT 활성도는 Aebi의 방법(18), GSH-Px 활성도는 Paglia와 Valentine의 방법(19), GST 활성도는 Habig 등의 방법(20), GR 활성은 Pinto와 Bartley 의 방법 (21), 그리고 G6PD 활성은 Pitkanen 등의 방법(22)에 준하여 측정하였다.
글루타티온 함량은 Elhnan의 방법(24), 과산화지질 함량은 Ohkawa 등의 방법(25)에 의하여 측정하였다.
본 실험에 사용한 기본식이는 AIN-76H3)의 식이 조성 (Table 1)에 준하였으며, 단백질 급원으로는 카제인(Murray, UK)을 공급하고, 탄수화물 급원은 옥수수 전분(신동방), 지방 급원으로는 옥수수기름(제일제당)을 사용하였다. 실험 식 이는 사람이 섭취하는 양을 고려하여 기본식 이 의 kg당 건조중량 기준으로 1.
효소.의 활성도는 소의 혈청알부민을 표준품으로 하여 Lowry 등의 방법(14)에 준해 측정한 단백질 mg 당의 고유 활성도로 나타내었다.
성능/효과
2)Means within a row with same superscript are not significantly different between the groups (p<0.05).
STZ를 투여한 당뇨 대조군의 P-450 함량은 정상군에 비해 60%의 유의적인 감소가 나타났으나 두릅열수 추출물 급여시 당뇨 대조군에 비해 유의적인 증가를 관찰하였다. P- 450은 체내로 유입된 이물질을 산화시키는 소포체의 mixed function oxidase(MFO)계 막 결합 효소로서 간세포의 소포체막에 지방산, 스테로이드 등의 내인성 물질과 약물이나 발암물질 등 외부로부터 유입된 물질을 대사하는 효소이다.
간 조직 중과산화지질 함량은 STZ만을 투여한 당뇨 대조군이 정상군에 비하여 1.8배의 유의적인 증가를 나타낸 반면 두릅열수 추출물 급여시 당뇨 대조군에 비해 그 함량이 유의적으로 감소하였다. 과산화지질 함량은 세포 내 산화적 스트레스의 증가, 즉 활성산소종의 생성 증가 및 항산화적 방어력 약화로 축적되는데 이 반응은 독성화합물과 약물에 의한 간 손상의 기전으로 알려져 있다 (44).
간 조직 중의 AD 활성은 정상군에 비하여 당뇨 대조군에서 유의적으로 감소된 반면 AH 활성은 당뇨 대조군이 정상군에 비하여유의 적인 증가를 보였다. 그러나, 7주간 두릅 열 수 추출물 급여는 이들 효소의 활성 변화를 억제하는 것으로 나타났다.
당뇨의 경우 항산화 방어계의 손상으로 SOD, GSH-Px, GR 과 같은 항산화 효소의 활성이 변화되고 글루타티온 대사가 손상을 받는 것으로 보고(39) 되어 있다. 간 조직 중의 GR 활성은 정상군에 비하여 당뇨 대조군에서 유의적으로 증가되었으나 실험식이 급여 시 유의적으로 감소되었다.GRe직접적으로 과산화물을 소거하지는 않으나 과산화수소나 유기과산화물환원에 사용되는 글루타티온의 재생산에 관여하는 것으로 알려져 있다 (40).
간 조직 중의 GSH-Px 활성은 당뇨 대조군에 비하여 두릅 열수 추출물 급여군에서 유의적인 감소가 나타났다. 이는 CAT의 활성 변화와 유사한 경향이었다.
간 조직 중의 GST 활성은 정상군에 비하여 당뇨 대조군에서 유의적으로 증가되었으나 두릅열수 추출물 급여시 당뇨로 증가된 활성이 유의적으로 억제되었다. 당뇨로 인해 생성된 활성산소는 GST에 의해 글루타티온과 포합되어 제거되는데 글루타티온이 고갈되면 지질과 산화물이 증가되어 독성을 일으키기 때문에 본 실험 결과는 STZ에 의한 산화적 스트레스의 방어작용으로 GST 활성이 증가된 것으로 생각 된다.
Wistai계 흰 쥐에게 두릅열수 추출물을 7주간 급여하였으며 당뇨 유발은 희생 2주 전 streptozotocin을 투여하여 혈당이 300 mg/dL 이상인 흰쥐를 대상으로 유해 활성산소대사계에 미치는 영향을 구명하였다. 간 조직 중의 유해 활성산소 생성계인 P-450 함량과 XO 및 AD 활성은 정상군에 비하여 당뇨 대조군에서 유의적으로 감소된 반면, AH 활성은 증가되었다. 두릅열수 추출물 급여로 이들 유해 활성 생성계 효소 활성 변화가 완화되는 것으로 나타났다.
당뇨 유발로 항산화물질인 글루타티온 함량은 유의적으로 감소된 반면 지질과 산화물 생성은 유의적으로 증가되었다. 그러나 두릅 열수 추출물 급여는 당뇨 대조군의 이들 함량 변화를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 두릅 열수 추출물 급여는 STZ 투여로 인한 유해 활성 산소 대사계 변화를 완하시킬 뿐만 아니라 지질과 산화물 생성을 억제함으로써 산화적 스트레스로 인한 당뇨 합병을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
간 조직 중의 AD 활성은 정상군에 비하여 당뇨 대조군에서 유의적으로 감소된 반면 AH 활성은 당뇨 대조군이 정상군에 비하여유의 적인 증가를 보였다. 그러나, 7주간 두릅 열 수 추출물 급여는 이들 효소의 활성 변화를 억제하는 것으로 나타났다. 두릅열수 추출물 급여군의 AD활성은 당뇨대조군 에 비해 증가하였고 AH 활성은 감소하는 것으로 나타났다.
CAT는 지방의 자동산화와 유기물의 산화 및 SOD에 의해 생성된 과산화수소를 GSH-Px와 함께 산소나물로 분해하여 배설시킴으로써 유리기로부터 조직의 손상을 방어하는 효소(33)이다. 당뇨 대조군에서 증가된 CAT의 활성은 두릅 열수 추출물 급여 시 유의적으로 감소되었는데 본 실험에서 당뇨에 의한 CAT의 활성 증가는 STZ 투여로 과산화수소와 같은 활성산소종이 증가된 때문이며 두릅열수 추출물 급여시 CAT 활성이 당뇨대조군에 비하여 감소된 것으로 보아 SOD 활성이 유의적이지는 않으나 당뇨 대조군에 비해 낮은 결과와 관련이 있을 것으로 사료된다.
또한 SOD, CAT, GSH-Px 및 GST, GR과 같은 유해 활성산소 제거계와 G6PD 효소들은 당뇨 유발로 유의적인 증가를 보였으나, 두릅 열수 추출물 급여군에서 는 이들 효소 활성이 낮았다. 당뇨 유발로 항산화물질인 글루타티온 함량은 유의적으로 감소된 반면 지질과 산화물 생성은 유의적으로 증가되었다. 그러나 두릅 열수 추출물 급여는 당뇨 대조군의 이들 함량 변화를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다.
그러나, 7주간 두릅 열 수 추출물 급여는 이들 효소의 활성 변화를 억제하는 것으로 나타났다. 두릅열수 추출물 급여군의 AD활성은 당뇨대조군 에 비해 증가하였고 AH 활성은 감소하는 것으로 나타났다. Chen 등(28) 역시 STZ<H] 의한 당뇨 실험에서 간 조직의 마이크로솜내 AH 활성이 증가된다고 보고 함으로써 본 실험 결과와 일치 한다.
GST는 변이乙 물질, 발암물질, 독성물질 등의 대사산물과 내인성 독소 중 친전자성체물질 등에 환원형 글루타티 온을 포합시켜 글루타티온 티오에스테르 형성반응을 촉매하여 무독화하는 효소이다(38). 따라서 본 실험에서 STZ 단독투여군의 GST 활성이 증가된 것은 STZ으로 유도된 산화적 손상으로부터 간 조직을 보호하기 위한 적응반응이 며 또한 두릅열수 추출물 급여시 GST의 활성감소는 고혈당에 대한 산화적 반응을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.
두릅열수 추출물 급여로 이들 유해 활성 생성계 효소 활성 변화가 완화되는 것으로 나타났다. 또한 SOD, CAT, GSH-Px 및 GST, GR과 같은 유해 활성산소 제거계와 G6PD 효소들은 당뇨 유발로 유의적인 증가를 보였으나, 두릅 열수 추출물 급여군에서 는 이들 효소 활성이 낮았다. 당뇨 유발로 항산화물질인 글루타티온 함량은 유의적으로 감소된 반면 지질과 산화물 생성은 유의적으로 증가되었다.
G6PD는 GSH-Px가 GSSG를 GSH로 환원 시 키 는데 필요한 NADPH를 생성하는 효소이다 (41). 본 실험에서 G6PD 활성은 STZ 투여 시 유의적으로 증가되었으며 두릅열수 추출물 급여시 STZ 단독 투여 에 비하여 유의적인 억제효과가 나타났다. STZ 으로 유도된 당뇨는 연령에 상관없이 G6PD 의 mRNA 수준을 증가시키며 혈당과의 상관성을 나타낸다 는 Liu 등(42)의 보고에서처럼 본 실험에서 두릅열수 추출물 급여로 인한 G6PD 활성 감소는 혈당강하와 관련될 것이라 생각한다.
본 실험에서 SOD 활성은 STZ만을 투여한 당뇨 대조군이 정상군에 비하여유의적으로 증가되었으나 두릅열수 추출물 급여에 따른 변화는 관찰되지 않았다. STZ 투여로 SOD 활 성 이 유의적으로 증가되었는데 이는 당뇨 유발로 증가된 활성산소를 소거하려는 생리적 적응 현상으로 당뇨병의 경우 활성산소 생성이 현저흐}.
과산화지질 함량은 세포 내 산화적 스트레스의 증가, 즉 활성산소종의 생성 증가 및 항산화적 방어력 약화로 축적되는데 이 반응은 독성화합물과 약물에 의한 간 손상의 기전으로 알려져 있다 (44). 본 실험에서 STZ 투여시 당뇨의 특징인 글루타티온의 고갈과 과산화지질의 함량 증가라는 결과를 관찰할 수 있었으며 실험식이 급여로 글루타티온의 함량이 정상 수준 가까이 회복되었고 과산화물 지 질의 함량 증가가 억제되는 것이 관찰됨으로써 두릅열수 추출물이 당뇨로 인한 산화적 스트레스의 예방과 개선에 효과적일 것으로 생각된다.
또한 MFO계의 생성물질은 대부분 생물학적으로 비활성이므로 체내에서 중요한 해독기전으로 알려져 있다 (26). 본 실험에서 STZ투여로 정상군에 비해 당뇨 대조군의 P-450 함량이 감소된 것은 phase I 단계가 손상된 결과로 사료되며 , 두릅열수 추출물 급여로 P-450 함량이 증가되는 것으로 보아 STZ 투여에 의해 억제된 유리기 방어계인 phase I 단계를 두릅열수 추출물이 활성화할 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
그러나 두릅 열수 추출물 급여는 당뇨 대조군의 이들 함량 변화를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 두릅 열수 추출물 급여는 STZ 투여로 인한 유해 활성 산소 대사계 변화를 완하시킬 뿐만 아니라 지질과 산화물 생성을 억제함으로써 산화적 스트레스로 인한 당뇨 합병을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
생체 내 유리기 생성계의 하나인 XO는 퓨린, 피리미딘, 알데하이드류, 헤테로 사이클릭 화합물 등의 대사에 관여하는 비특이적 효소로서 생체에서 주로 퓨린 체의 대사산물인 하이포크산틴을 크산틴으로, 크산틴을 다시 산화시켜 요산을 생성하는 반응의 촉매로 작용하며 이 과정에서 유리기를 생성한다(27)고 알려져 있다. 이와 같이 본 실험에서 당뇨로 감소된 P-450 함량과 XO 활성이 두릅열수 추출물 급여 시 유의적으로 증가됨으로써 STZ 투여로 인한 체내 유해 활성산소대사계의 비정상적 활성 변화를 완화시킬 수 있을 것으로 생각된다.
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