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문제 정의
- 해조류의 많은 기능적 특성은 sulfate기가 중요한 역할을 한다고 알려져 있는데 alginate는 황산기를 가지고 있지 않아 그 기능성이 황산기를-함유한 다당류에 비해 부족하다고 할 수 있다. 따라서 알긴산에 인위적으로 sulfate를 부착하도록 한 후 이들이 Lactobacillus의 성장에 미치는 영향을 알아보았다. MRS broth와 peptone water 배지에 있어서 S-al- ginate와 alginate를 0.
- 알긴산은 장내 유해 미생물을 억제 시키고 Bifidobacterium과 Lactobacillus의 증식을 촉진한다고 하였으며 (11, 12), 다시 마 알긴산의 가열 가수분해에 따른 분자량 50, 000 Da의 저분자 알긴산은 쥐의 장내세균 중 유해균의 증식을 억제하고 유익균의 증식을 촉진 시 켜 장내 미생물 균총을 개선시키는 역할을 하였다(13). 본 연구의 목 적은 황산기를 함유하는 다당류가 여러 가지 생리적인 기능이 있다는 것이 알려져 있으므로 이를 토대로 알긴산에 황을 인위적으로 붙여 Lactobacillus acidophilluse} 성장에 어 떠 한 영향을 미 치는 지에 대하여 알아보았고 sulfated alginate의 돌연변이원성과 항돌연변이성에 대하여 살펴보았다.
제안 방법
- 따라서 알긴산에 인위적으로 sulfate를 부착하도록 한 후 이들이 Lactobacillus의 성장에 미치는 영향을 알아보았다. MRS broth와 peptone water 배지에 있어서 S-al- ginate와 alginate를 0.25, 1, 2% 농도별로 첨가하여 Lactobacillus aczdophiZ庭를 접 종한 후 배양하면서 유산균의 성장에 대한 영향을 Fig. 1에 나타내었다. 비록 초기 접종균수에서 차이는 있지만 Lactobacillus는 peptone water 배지보다 도 MRS broth에서 빠른 성장을 보였고 대조구와 비교하여 alginate의 첨가는 확실히 Lactobacillus의 성장에 영향이 있음을 보여주고 있다.
- 본 실험에 사용된 균주는 한국종균협회에서 분양받은 Lactobacillus acidophilus KCTC 3151를 사용하였고 MRS broth에 균을 접종해서 35℃ 수욕 조에서 18시간 배양하였다. Sulfate가 부착된 알긴산(S-Alginate)을 MRS broth(Oxoid Co., England)에 각각 0.25, 1, 2% 농도가 되게 준비하였다. 대조 구로서 MRS broth에 sulfate가 부착되지 않은 톳에서 추출한 알긴산을 사용하였다.
- 대조 구로서 MRS broth에 sulfate가 부착되지 않은 톳에서 추출한 알긴산을 사용하였다. 배양한 균주를 멸균된 각각의 배지에 0.1 mL씩 접종하고 35℃ 수욕 조에서 100 rpm으로 진탕하면서 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24시간 별로 배양하면서 미생물 수를 측정하였다. 한편 유산균의 배지로 많이 이용되는 MRS broth는 Mg2SO4가 0.
- 5 mL를 넣었다. 이를 His/Bio이 첨가된 2.5 mL Top Agar(45℃)에 넣고 잘 혼합한 후 미리 조제해 놓은 minimal glucose agar plate 위에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀 돌연변이 (His* revertant colony) 수를 세어서 대조구에 대한 mutagenicity ratio(MR)로 돌연변이 원성의 유무를 판정하였다. 항 돌연변이원성 실험은 Ames Assay를 개량한 pre-incubation 법에 따라 행하여졌고 돌연변이 유발물질로 TA98과 TA100 균주에 대해서는 2-NF와 MMS가 각각 사용되어 졌다.
- 항 돌연변이원성 실험은 Ames Assay를 개량한 pre-incubation 법에 따라 행하여졌고 돌연변이 유발물질로 TA98과 TA100 균주에 대해서는 2-NF와 MMS가 각각 사용되어 졌다. 준비된 S-alginate는 직접 돌연변이 원과 함께 30분간 배양한 후 돌연변이원성 실험과 동일한 조건으로 실시하여 생긴 복귀 돌연변이 수를 세어 항 돌연 변이작용을 살펴보았다. 항돌연변이 활성은 변이 원 물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition %)로 표현하였다.
- 1 mL씩 접종하고 35℃ 수욕 조에서 100 rpm으로 진탕하면서 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24시간 별로 배양하면서 미생물 수를 측정하였다. 한편 유산균의 배지로 많이 이용되는 MRS broth는 Mg2SO4가 0.2 g/L의 비율로 함유되어 있기 때문에 sulfate가 전혀 함유되어 있지 않는 Peptone water 배지를 이용하여 S-alginate를 농도별로 준비한 후 균주를 접종하고 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 30, 36, 40시간 별로 Lactobacillus acidophillus의 성장에 미치는 영향을 조사하였다.
- 준비된 S-alginate는 직접 돌연변이 원과 함께 30분간 배양한 후 돌연변이원성 실험과 동일한 조건으로 실시하여 생긴 복귀 돌연변이 수를 세어 항 돌연 변이작용을 살펴보았다. 항돌연변이 활성은 변이 원 물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition %)로 표현하였다. 각각의 실험은 2회 반복 4 plates 씩 실시하였다.
대상 데이터
- 25, 1, 2% 농도가 되게 준비하였다. 대조 구로서 MRS broth에 sulfate가 부착되지 않은 톳에서 추출한 알긴산을 사용하였다. 배양한 균주를 멸균된 각각의 배지에 0.
- 본 실험에 사용된 균주는 Salmonella Typhimurium의 frame shift 변이 균주인 TA98과 base-pair substitution 변 이 균주인 TA100을 Moltox회사(Boone, NC, USA)로부터 구입하여 Marson과 Ames의 방법 (15)에 따라 histidine 요구 성, deep rough(rfa) 돌연변이, crystal violet 감수성, UV 감 수성(如rB), R-factor에 의한 ampicillin 내성, 자연 발생 복귀 돌연변이 수 등의 유전적 특징을 확인한 후에 본 실험에 이용하였다. 직접 돌연변이 원으로 사용된 2-nitro fluorene (2-NF)와 methyl methane sulfonate(MMS), 균주 및 양성 돌연변이 물질을 용해 및 희석하는데 사용된 DMSO는 Sigma 사(St.
- 본 실험에 사용된 균주는 한국종균협회에서 분양받은 Lactobacillus acidophilus KCTC 3151를 사용하였고 MRS broth에 균을 접종해서 35℃ 수욕 조에서 18시간 배양하였다. Sulfate가 부착된 알긴산(S-Alginate)을 MRS broth(Oxoid Co.
- 전남 완도에서 6월에 수확된 건조된 톳(Hizikia fusi- forme) 분말로부터 Acid Alkali Soluble Alginate(AASA) 추 출방법(14)에 의해 얻어진 알긴산을 3%의 용액으로 만든 후 0.1 M Na2S04에 첨가하여 실온에서 6시간 동안 교반 하면서 반응하였다. 반응이 끝난 후 1 : l(w/v)의 비율로 ethyl al- cohol을 첨가해서 sulfate를 흡착한 알긴산 겔을 원심 분리해서 회수한 다음 ethyl alcohol로 여러 번 세척해서 정제된 침전물만 얻어 건조하였다.
- 본 실험에 사용된 균주는 Salmonella Typhimurium의 frame shift 변이 균주인 TA98과 base-pair substitution 변 이 균주인 TA100을 Moltox회사(Boone, NC, USA)로부터 구입하여 Marson과 Ames의 방법 (15)에 따라 histidine 요구 성, deep rough(rfa) 돌연변이, crystal violet 감수성, UV 감 수성(如rB), R-factor에 의한 ampicillin 내성, 자연 발생 복귀 돌연변이 수 등의 유전적 특징을 확인한 후에 본 실험에 이용하였다. 직접 돌연변이 원으로 사용된 2-nitro fluorene (2-NF)와 methyl methane sulfonate(MMS), 균주 및 양성 돌연변이 물질을 용해 및 희석하는데 사용된 DMSO는 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고 Vogel-Bonner minimal glucose agar plate, top agar, nutrient broth 및 bacto agar 는 Difco(Detroit, MI, US A)에서, nutrient agar No 2는 Oxoid(Hampshire, England)에서 구입 하였다. 멸균된 glass cap tube에 0.
성능/효과
- 25% 첨가한 경우 유산균의 성장은 비슷한 값을 나타내었으나 농도가 증가할수록 S- alginate# 첨가한 군이 alginate만 첨가한 군보다는 유산균의 성장을 늘리는 것으로 나타났다. Ames test를 통해서 S- alginate는 돌연변이성을 전혀 나타내지 않았으며 항 돌연변 이성는 직접 변이 원에 대하여 TA98 균주는 14-19%, TA100 균주에 대해서는 12~17%까지의 억제율을 보였으며 2%의 S-alginate가 가장 높은 억제율을 나타내었다.
- 61 x 109 CFU/mL로서 al- ginate의 농도가 높을수록 많은 균수를 나타내었다. MRS broth와 peptone water 배지 모두에서 S-alginate를 첨가한 것도 유산균의 성장을 증가시키는 것으로 나타났으며, 0.25% 농도에 있어서는 S-alginate와 alginate를 첨가한 경우 유산 균의 성장은 비슷한 값을 나타내었으나 peptone water 배지에서 S-alginate의 첨가는 8시간 경과 후 1%와 2% 농도의 경우 균수가 각각 1.35xiO8 CFU/mL와 2.24 x 伊 CFU/mL 를 나타내어 alginate의 첨가 시 균수 7.08 xlO7 CFU/mLe 7.94 X IO’CFU/mL에 비해 높게 나타났다. Zac切bac沮必의 성장 과정에서 대 수기에서는 S-alginate 첨가가 alginate에 비해 균의 성장이 약간 빠르게 나타났으며 균의 성장이 정지 기에 도달한 후에는 큰 차이를 보이지 않았다.
- 25, 1, 2% 농도별로 첨가하여 Lactobacillus acidophilus를 접 종한 후 배양하면서 유산균의 성장에 대한 영향을 살펴본 결과 모든 농도에서 이들 배지에 S-alginate를 첨가한 것이 유산균의 성장을 증가시키는 것을 알 수 있었다. S-alginatee- alginate를 0.25% 첨가한 경우 유산균의 성장은 비슷한 값을 나타내었으나 농도가 증가할수록 S- alginate# 첨가한 군이 alginate만 첨가한 군보다는 유산균의 성장을 늘리는 것으로 나타났다. Ames test를 통해서 S- alginate는 돌연변이성을 전혀 나타내지 않았으며 항 돌연변 이성는 직접 변이 원에 대하여 TA98 균주는 14-19%, TA100 균주에 대해서는 12~17%까지의 억제율을 보였으며 2%의 S-alginate가 가장 높은 억제율을 나타내었다.
- 94 X IO’CFU/mL에 비해 높게 나타났다. Zac切bac沮必의 성장 과정에서 대 수기에서는 S-alginate 첨가가 alginate에 비해 균의 성장이 약간 빠르게 나타났으며 균의 성장이 정지 기에 도달한 후에는 큰 차이를 보이지 않았다.
- 본 실험에서는 쥐의 간에서 추출한 대사 활성 효소 시스템인 S-9 mix를 사용하지 않았다. 따라서 직접 변이 원으로서 TA98을 위해서는 2-NF, TA100을 위해서는 MMS를 사용하였는데 직 접변 이원에 S-alginate 첨가 구가 TA98에 대해서는 14~ 19%의 돌연변이 억제 효과를 나타내었고 TA100에 대해서는 12~17%의 억제를 보였다(Table 2). 그러나 S-alginate 농도에 따른 유의성은 크게 없었으며 이는 알긴산에 부착된 황의 함량이 본 실험의 농도 범위에서는 큰 차이가 없었기 때문으로 여겨진다.
- 알칼리 (AASA) 방법으로 추출한 알긴산에 인위적으로 sulfate를 흡착시킨 후 ICP-AES를 이용중H서 확인한 결과 3% alginate 용액에서 18435 ppm 농도의 sul- fate가 검출되었다. 배지 자체적으로 황을 함유하고 있는 MRS broth와 황이 없는 peptone water 배지에 S—alginate와 alginate를 0.25, 1, 2% 농도별로 첨가하여 Lactobacillus acidophilus를 접 종한 후 배양하면서 유산균의 성장에 대한 영향을 살펴본 결과 모든 농도에서 이들 배지에 S-alginate를 첨가한 것이 유산균의 성장을 증가시키는 것을 알 수 있었다. S-alginatee- alginate를 0.
- 톳으로부터 산. 알칼리 (AASA) 방법으로 추출한 알긴산과 반응시킨 sulfate가 얼마나 흡착되었는지 알아보기 위해서 표준 곡선을 구하고 ICP-AES로 측정을 한 결과 3% al- ginate 용액에서 18, 435 ppm의 농도의 sulfate가 검출되었다.
- 톳으로부터 산. 알칼리 (AASA) 방법으로 추출한 알긴산에 인위적으로 sulfate를 흡착시킨 후 ICP-AES를 이용중H서 확인한 결과 3% alginate 용액에서 18435 ppm 농도의 sul- fate가 검출되었다. 배지 자체적으로 황을 함유하고 있는 MRS broth와 황이 없는 peptone water 배지에 S—alginate와 alginate를 0.
- 비록 초기 접종균수에서 차이는 있지만 Lactobacillus는 peptone water 배지보다 도 MRS broth에서 빠른 성장을 보였고 대조구와 비교하여 alginate의 첨가는 확실히 Lactobacillus의 성장에 영향이 있음을 보여주고 있다. 최적 배지인 MRS broth에서는 8시간 경과 후 Lactobacillus의 수가 최고를 나타내었는데 0.25% alginate 첨가 배지에서 약는 약 5.37 X109 CFU/mL, 1%에서 는 5.75X109 CFU/mL, 2%에서는 6.61 x 109 CFU/mL로서 al- ginate의 농도가 높을수록 많은 균수를 나타내었다. MRS broth와 peptone water 배지 모두에서 S-alginate를 첨가한 것도 유산균의 성장을 증가시키는 것으로 나타났으며, 0.
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