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문제 정의
- 등에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 자극원이 될 수 있는 SLS, 주름개선 효과가 있지만 자극이 상대적으로 강한 RA, UVB에 의해 발생하는 proinflammatory cytokine들 중 ILTq 와 TNF a가 파슬리 추출물에 의해 어느 정도 감소하는지 알아보았다. 그 결과, 파슬리주줄물은 0.
- 주요 성분으로는 flavonoids에 속하는 apiin, luteolin-glyco- sides, apigenin-glycosides, essential oil 인 apiole, myri- sticin, cumarines인 bergapten, imperatorin과 vitamin C 등이 있다[2, 3]. 본 연구에서는 파슬리추출물의 노화 방지 및 자극완화 소재로서의 가능성을 파악하기 위하여, 피부 노화 증상의 하나인 주름 개선 효과와, 피부 미세염증의 개선 효과, 그리고 피부 자극물질에 대한 자극완화 효과를 검토하였으며, 그러한 과정을 통하여 파슬리 추출물이 노화 방지 및 자극완화 효능이 있음을 확인하였기에 이에 보고한다.
- 피부노화에 대한 파슬리추출물의 효능을 규명하기 위해, in vitro에서 total collagen 생합성, type I procollagen 생합성, 자외선 조사에 의한 PGE2 생합성에 미치는 영향, 여러 자극물질에 의한 proinflammatory cytokines의 생합성에 미치는 영향을 보고, 무모생쥐 피부에 대한 파슬리추출물의 피부 개선 효과를 실험하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 섬유아 세포를 L-[2,3,4,5-3]Proline과 시료를 함유한 배지로 갈아주고 24시간 동안 더 배양한 후 배지 중에 생합성되어 분비된 collagen을 trichloroacetic acid (TCA)로 침전시켜 그 양을 scintillation counter를 사용해서 측정하였다.
- 40주령의 자성, 무모생쥐(Skh: hr-1, Female albino, hairless mouse) 의 등에 적절한 기제로 용해시킨 시료를 2일간 폐쇄 첩포(occlusive patch)하고, 하루 휴식 후에 한번 더 폐쇄 첩포 처치를 하였다. 피부를 생검하여 Verhoeff Van Gieson 법으로 collagen에 대한 특수염색을 실시하였다.
- HaCaT 세포를 96-well plate에 2X104 cells/well의 밀도로 분주하고, 파슬리추출물이 포함된 DMEM 배지로 교체하여 1시간 전처리 후 자극원이 될 수 있는 SLS, 주름 개선 효과가 있지만 상대적으로 자극이 강한 RA와 UVB 30 mj/cm2를 각각 처리 또는 조사하여 2시간 배양한 후에 배지 중으로 분비된 IL-ltf 또는 TNFa 의 양을 Pharmingen사의 ILTa 또는 TNF a EIA kit을 이용하여 ELISA 방법으로 측정하였다.
- Fusenig 박사로부터 분양 받은 사람유래 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 96- well plate에 2x104 cells/well의 밀도로 분주하고, 500µM의 aspirin을 가한 뒤 2시간 CCh 배양기에서 배양하여 COX-1 을 불활성화 시켰다. PBS (pH 7.4)로 2회 세척한 다음, 새로운 PBS를 가하고 20 mj/cm2 용량의 WB를 조사하였다. 검색시료가 포함된 0.
- in vivo에서의 collagen 합성 촉진 효과를 조사하기 위해 1% 파슬리추출물을 무모생쥐의 등 부위에 4일간 폐쇄 첩포한 후 피부를 생검하여 Verhoeff Van Gieson 염색하여 표피와 진피의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 표피에서는 어떠한 변화도 관찰할 수 없었으며, 진피에서는 대조군에 비해 collagen 섬유 등의 밀도가 훨씬 더 촘촘해지고 1.
- 단기시험인 4day patch assay를 시행하였다. 40주령의 자성, 무모생쥐(Skh: hr-1, Female albino, hairless mouse) 의 등에 적절한 기제로 용해시킨 시료를 2일간 폐쇄 첩포(occlusive patch)하고, 하루 휴식 후에 한번 더 폐쇄 첩포 처치를 하였다.
- 또한 type I. procollagen 생합성에 미치는 파슬리 추출물의 영향을 조사하기 위하여 섬유아세포에 1 µg/mL로 파슬리 추출물을 처리한 후 24시간 후에 배양 상층액에서의 type I procollagen의 발현을 ELISA 방법으로 조사하였다. 그 결과, 파슬리추출물의 농도가 1 ug/mL일 경우 type I procollagen 생합성이 약 18% 증가하였다(Figure 2).
- 배양하였다. 배지 중에 유리된 procollagen의 양은 procollagen type 1 C-peptide EIA kit (MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였으며, 섬유아세포의 총 단백질 양으로 보정하였다.
- 실험에 사용된 섬유아세포는 정상포피의 지방층을 제거하고 잘게 잘라 collagenase로 표피와 친피를 분리한 후 진피조직을 각각 0.25% trypsin 용액에 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 10분간 처리하였다. 이후'vortex를 시행하여 섬유아세포(normal human fibroblast; NHFX 유리시키고, 유리된 세포를 모아 세척한 후 10% 우태아혈청 (FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다.
- 25% trypsin 용액에 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 10분간 처리하였다. 이후'vortex를 시행하여 섬유아세포(normal human fibroblast; NHFX 유리시키고, 유리된 세포를 모아 세척한 후 10% 우태아혈청 (FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 70〜80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3〜4차 계대배양한 세포를 실험에 이용하였다.
대상 데이터
- 6주령의 무모생쥐 (Female albino hairless mice, Skh: hr-l)를 Charles River Lavoratories (Wilmington, Mass., USA)에서 구입하여 실험에 사용되는 40주령까지 온도 22±2℃, 상대습도 55士5%로 유지되는 항온항습 사육실에서 사육하였다.
- 이후'vortex를 시행하여 섬유아세포(normal human fibroblast; NHFX 유리시키고, 유리된 세포를 모아 세척한 후 10% 우태아혈청 (FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 70〜80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3〜4차 계대배양한 세포를 실험에 이용하였다.
- 독일암연구소(DKFZ)의 Norbert E. Fusenig 박사로부터 분양 받은 사람유래 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 96- well plate에 2x104 cells/well의 밀도로 분주하고, 500µM의 aspirin을 가한 뒤 2시간 CCh 배양기에서 배양하여 COX-1 을 불활성화 시켰다. PBS (pH 7.
- 본 실험에 사용된 파슬리는 서울특별시 서초구 가락동 농수산물 시장에서 구입하였으며, 그늘에서 말린 뒤, 70% 에탄올로 3시간 동안 열탕추출한 추출물을 감압 건조하여 시험물질로 사용하였다. 실험에 사용된 시약으로서 pho sphate buffered saline (PBS), sodium lauryl sulfate (SLS), retinoic acid (RA) 등은 Sigma (USA)사 제품을 사용하였으며, trypsin/EDTA, penicillin/streptomicin, Dul- beccos Modification of Eagles medium (DMEM) 등은 Gibco (USA)사 제품을, L-[2, 3, 4, 5-3H]proline은 Amer- sham pharmacia biotech (UK) 제품을, procollagen type- 1 C-peptide EIA kit은 Takara (Japan) 제품을, PGEz EIA kit은 Cayman사 제품을, IL-1 a 및 TNFa EIA kit 은 Pharmingen사 제품을 사용하였다.
- 기타 일반 시약은 특급시약을 사용하였다. 사용된 기기는 ELISA reader (Dibiotech, Korea), scintillation counter (Pharmacia, USA) 자외선 B 조사기 등을 사용하였다.
- 사용하였다. 실험에 사용된 시약으로서 pho sphate buffered saline (PBS), sodium lauryl sulfate (SLS), retinoic acid (RA) 등은 Sigma (USA)사 제품을 사용하였으며, trypsin/EDTA, penicillin/streptomicin, Dul- beccos Modification of Eagles medium (DMEM) 등은 Gibco (USA)사 제품을, L-[2, 3, 4, 5-3H]proline은 Amer- sham pharmacia biotech (UK) 제품을, procollagen type- 1 C-peptide EIA kit은 Takara (Japan) 제품을, PGEz EIA kit은 Cayman사 제품을, IL-1 a 및 TNFa EIA kit 은 Pharmingen사 제품을 사용하였다. 기타 일반 시약은 특급시약을 사용하였다.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean 土 SEM으로 기록하였고, 유의성 검증은 Students t-test 분석 방법을 이용하여 결정하였다.
이론/모형
- 4)로 2회 세척한 다음, 새로운 PBS를 가하고 20 mj/cm2 용량의 WB를 조사하였다. 검색시료가 포함된 0.1% FBS 함유 phenol red-free DMEM을 가하여 24시간 배양한 후에 배지 중으로 분비된 PGE2의 양을 Cayman사의 PGE2 EIA kit을 이용하여 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 측정하였다.
- 40주령의 자성, 무모생쥐(Skh: hr-1, Female albino, hairless mouse) 의 등에 적절한 기제로 용해시킨 시료를 2일간 폐쇄 첩포(occlusive patch)하고, 하루 휴식 후에 한번 더 폐쇄 첩포 처치를 하였다. 피부를 생검하여 Verhoeff Van Gieson 법으로 collagen에 대한 특수염색을 실시하였다.
성능/효과
- (1) 파슬리추출물은 배양 인체 섬유아세포에서 total collagen 생합성을 증가시켰다.
- (2) 파슬리추출물은 배양 인체 섬유아세포에서 type Ⅰ procollagen 생합성을 증가시켰다.
- (3) 파슬리추출물은 노화된 무모생쥐에서 노화로 얇아진 진피의 두께를 증가시키며, 진피의 밀도 또한 증가시켰다.
- (4) 파슬리추출물은 HaCaT cell에서 UVB에 의한 PGE2 생합성을 감소시켰다.
- (5) 파슬리추출물은 HaCaT cell에서 SLS, RA, UVB에 의한 proinflainmatory cytokine 인 ILTα, TNFα 의 생합성을 감소시켰다.
- (TGF β)를 양성대조군으로 하여 섬유아세포에서 시험한 결과 1 µg/mL의 농도로 처리했을 때, 대조군의 생합성량에 비하여 약 23% 증가하였고, 이는 양성대조군의 20%에 비하여 비슷하거나 3% 더 생합성촉진 효과가 있음을 보여주었다 (Figure 1).
- 본 실험에서는 자극원이 될 수 있는 SLS, 주름개선 효과가 있지만 자극이 상대적으로 강한 RA, UVB에 의해 발생하는 proinflammatory cytokine들 중 ILTq 와 TNF a가 파슬리 추출물에 의해 어느 정도 감소하는지 알아보았다. 그 결과, 파슬리주줄물은 0.1, 1 jUg/rnL 농도에서 RA와 SLS에 의한 IL-la의 방출을 약 8〜84%까지 감소시켰고, RA와 UVB에 의한 TNFa의 방출은 11〜78% 감소시켜서 자극원에 의한 자극을 상당히 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
- procollagen 생합성에 미치는 파슬리 추출물의 영향을 조사하기 위하여 섬유아세포에 1 µg/mL로 파슬리 추출물을 처리한 후 24시간 후에 배양 상층액에서의 type I procollagen의 발현을 ELISA 방법으로 조사하였다. 그 결과, 파슬리추출물의 농도가 1 ug/mL일 경우 type I procollagen 생합성이 약 18% 증가하였다(Figure 2).
- 표피와 진피의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 표피에서는 어떠한 변화도 관찰할 수 없었으며, 진피에서는 대조군에 비해 collagen 섬유 등의 밀도가 훨씬 더 촘촘해지고 1.5배 정조 더 두터워진 것을 관찰할 수 있었다 (Figure 3).
- )의 발현 역시 억제하였다. 그러므로, 파슬리추출물은 자외선에 의한 일련의 조직파괴반응을 억제하고, 조직 재생을 촉진시켜 자외선의 유해한 생물학적 작용을 예방할 수 있는 후보물질임을 알 수 있었다.
- 등시에 본보에 결과로 제시하지는 않았지만 파슬리 추출물은 자외선 조사 후 증가되는 matrix me talloproteinase-1 (MMPT.)의 발현 역시 억제하였다. 그러므로, 파슬리추출물은 자외선에 의한 일련의 조직파괴반응을 억제하고, 조직 재생을 촉진시켜 자외선의 유해한 생물학적 작용을 예방할 수 있는 후보물질임을 알 수 있었다.
- 즉 파슬리추출물은 자외선에 의한 PGE2의 생합성을 억제하고, 여러 자극원에 의한 proinflammatory cytokine 인 IL-lα와 TNFa 의 생합성을 억제하여, 강한 항염증 효과 및 자극완화효과를 보여주어, 염증으로 인해 발생할 수 있는 피부자극이나 동통, 노화의 촉진 등을 완화시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 즉, 본 연구 결과 파슬리추출물은 배양한 섬유아 세포에서 total collagen과 type I procollagen 생합성을 증가시키는 효과가 있음을 증명하였고, 또한 노화된 무모 생쥐의 피부에 단기폐쇄첩포함에 따라 진피조직이 치밀해짐을 증명하였다. 등시에 본보에 결과로 제시하지는 않았지만 파슬리 추출물은 자외선 조사 후 증가되는 matrix me talloproteinase-1 (MMPT.
후속연구
- 본 실험 이후에는 사람을 대상으로 파슬리추출물의 주름 완화 효과에 대한 체계적인 임상연구가 필요할 것으로 생각되며, 또한 파슬리추출물 중 procollagen의 생합성을 증가시키며, PGEz 및 proinflammatory cytokine의 생합성을 억제하는 주성분과 그것의 분자생물학적 기전을 밝혀야 할 것이다.
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