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문제 정의
- 본 연구에서는 녹두추출물의 항염증 기작을 살펴보고, lactic acid, retinol, preservatives 등과 같은 현재 화장품에 빈번히 사용되고 있는 자극 유발 물질에 대한 녹두주출물의 자극완화 효과를 알아보고자 다양한 임상 연구를 수행하였다.
- 본 연구에서는 녹두추출물의 항염증 기작을 살펴보고, 현재 화장품에 널리 사용되고 있는 자극 유발 물질인 lactic acid, retinol, 방부제 등에 대한 녹두추출물의 자극완화 효과를 알아보기 위하여 다양한 임상 연구를 수행하였다.
- 이러한 항염증 효과는 녹두추출물의 우수한 항산화 효과에 의해 일부 설명되어질 수 있다. 본 연구에서는 이러한 항산화작용 이외에 녹두추출물의 항염증 기작을 좀 더 밝히고자 비만세포로부터의 compound 48/80 유도성 히스타민유리 억제 효능 시험 및 5-lipoxygenase 활성 억제 효능시험을 실시하였다. 시험 결과, 녹두추출물은 5-Hpoxy-genase assay에서는 활성 억제 효과를 보이지 않았으나 (date not shown), 히스타민 유리를 상당히 억제하는 효과를 보였다(Figure 2).
제안 방법
- 수행하였다. 23세~34세의 30명의 여성 피험자를 대상으로 실시하였으며, 피험자들은 녹두추출물 함유 조성물 및 placebo를 하루에 최소 두 번, 아침과 저녁에 평상시 사용 조건으로 사용하게끔 한 다음, 자극 여부 및강도를 1일 1회씩 설문지에 작성하도록 하였다.
- 우선, 첩포 부위인 전박을 70% 에탄올로 닦아내고 건조시킨 후, 시험물질이 적용된 Finn chambers (Epitest Ltd Oy, Finland)를 시험 부위에 첩포하였다. 24시간 후에 첩포를 제거하고 30분, 24시간, 48시간 후에 자극 발생 유무를 평가하였다. 평가 기준은 International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG)의 판정 기준에 따랐으며, 피부 자극 유발 가능성의 평가는 다음 계산식으로부터 계산된 평균값으로 하였다[11, 12].
- Lactic acid, retinol, preservative 등과 같이 화장품에 빈번히 시용되는 자극원에 대하여 녹두추출물의 피부 일차 자극 완화 효과를 평가하기 위하여 인체 첩포시험을 실시하였다. 피부 일차 자극 정도는 크게 5 grade로나누어 평가하였다 0~0.
- 국내산 녹두로부터 껍질을 제거하고 정제수로 세척한 후 건조하고, 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 여기에 그 건조중량의 1~10배의 70% 에틸알코올을 첨가하였다. 실온에서 5일간 추출한 후 300 메쉬 여과포로 여과하고, 다시 와트만 5번 여과지로 여과한 후, 회전 감압 증발기로 건조하였다.
- 따라서, 본 연구에서도 녹두추출물의 자극완화 효과를 최종적으로 평가하기 위하여 녹두추출물을 함유하는 조성물 formula #8 및 placebo를 30명의 피험자를 대상으로 4주간의 사용성 시험을 실시하였다. Figure 4~6은 double blind usage test 결과를 보여준다.
- 2 = 자극이 강함, 3 = 자극이 매우 강함으로 표시한다. 또한, 적용 후 자극 반응이 나타나는 시간에 따라 30초, 2.5분, 5분, 8분 등의 4 구분으로 나눴으며, 30초 이내에 나타나는 경우를 Intense stinging (4점), 2.5분 Mild stinging (3점), 5분 Moderate stinging (2점), 그리고 8분 이내에 나타나는 경우를 Delayed stinging (1점)으로 구분하여 평가하였다. 자극의 정도는 하기의 공식으로부터 계산된 자극양성율로 판정하였다.
- 실온에서 5일간 추출한 후 300 메쉬 여과포로 여과하고, 다시 와트만 5번 여과지로 여과한 후, 회전 감압 증발기로 건조하였다. 건조된 녹두추출 파우더를 50% 1, 3-부틸렌 글리콜에 용해하여 본 실험에 사용하였다.
- 평소 피부 질환 및 알러지가 없는 20명의 피험자(남자 12명, 여자 8명)를 대상으로 실시되었으며, 연령분포는 24세~34세, 평균 연령은 29세였다. 우선, 첩포 부위인 전박을 70% 에탄올로 닦아내고 건조시킨 후, 시험물질이 적용된 Finn chambers (Epitest Ltd Oy, Finland)를 시험 부위에 첩포하였다. 24시간 후에 첩포를 제거하고 30분, 24시간, 48시간 후에 자극 발생 유무를 평가하였다.
- 자극원 및 녹두추출물을 함유하는 조성물의 주관적 자극을 평가하기 위하여 자극감 시험을 수행하였다. Stinger는 steam generator (Vaporzone 707, TaiwanX 사용하여 15분 동안 충분히 sweating 시키고 나서 충분량의 시료를 손에 묻혀 시험물질을 각각 왼쪽과 오른쪽의 코 주위 (nasolbaial fold) 및 뺨을 중심으로 강하게 비빈다.
- 5분 Mild stinging (3점), 5분 Moderate stinging (2점), 그리고 8분 이내에 나타나는 경우를 Delayed stinging (1점)으로 구분하여 평가하였다. 자극의 정도는 하기의 공식으로부터 계산된 자극양성율로 판정하였다.
- 피부 일차 자극을 평가하기 위한 인체 첩포시험을 CTFA guideline에서 제시한 방법에 약간의 변형을 가하여 실시하였다[10]. 평소 피부 질환 및 알러지가 없는 20명의 피험자(남자 12명, 여자 8명)를 대상으로 실시되었으며, 연령분포는 24세~34세, 평균 연령은 29세였다.
- 피부의 주관적 자극을 평가하기 위한 자극감 시험을 인체 첩포시험에 사용된 동일한 조성물에 대하여 실시하였다. Table 4에서 알 수 있듯이, 녹두추출물은 formula #2 (lactic acid 5.
- 화장품에 빈번히 사용되고 있는 다양한 자극 유발 물질에 대한 녹두추출물의 자극완화 효과를 평가하기 위한 여러 가지 조성물을 제조하였다(Table 1). 5%의 lactic acid, 4000 IU retinol, 1.
- 흰쥐의 복강에 존재하는 비만세포를 이용하여 녹두추출물의 항원 유도성 히스타민 분비 억제 효과를 측정하였다. 실험에 사용된 흰쥐는 male Sic, Wistar strain rat (160-220 g)으로 KFDA에서 구매하였으며, Sulivan et al.
대상 데이터
- Stinger는 steam generator (Vaporzone 707, TaiwanX 사용하여 15분 동안 충분히 sweating 시키고 나서 충분량의 시료를 손에 묻혀 시험물질을 각각 왼쪽과 오른쪽의 코 주위 (nasolbaial fold) 및 뺨을 중심으로 강하게 비빈다. 20명의 피험자(남자 10명, 여자 10명)를 대상으로 실시하였으며 연령 분포는 23세~33세, 평균 연령은 29세였다. 피험자들은 주관적인 자극(stinging, itching, burning, etc)의 자극 정도를 평가하게 된다.
- 가지 조성물을 제조하였다(Table 1). 5%의 lactic acid, 4000 IU retinol, 1.0% preservative mixture (methyl paraben (0.4%), propyl paraben (0.2%), phenoxyethanol (0.4%)이 본 실험에서 자극원으로 사용되었으며, 2.0% 녹두추출물이 자극완화제로서 화장료 조성 물에 적용되었다. 제형#1은 negative control이며, #2, #3, #4는 자극원만 포함하는 positive control 이다.
- 실온에서 5일간 추출한 후 300 메쉬 여과포로 여과하고, 다시 와트만 5번 여과지로 여과한 후, 회전 감압 증발기로 건조하였다. 건조된 녹두추출 파우더를 50% 1, 3-부틸렌 글리콜에 용해하여 본 실험에 사용하였다.
- 방법[9]에 의해 측정하였다. 시험물질이 Compound 48/80에 의해 비만세포에서 분비되는 히스타민의 양을 감소시키는 정도를 측정하였으며, 대조군으로는 천식과 관련된 알러지 치료제인 Disodium cromoglycate (DSCG)가 이용되었다.
- 평소 피부 질환 및 알러지가 없는 20명의 피험자(남자 12명, 여자 8명)를 대상으로 실시되었으며, 연령분포는 24세~34세, 평균 연령은 29세였다. 우선, 첩포 부위인 전박을 70% 에탄올로 닦아내고 건조시킨 후, 시험물질이 적용된 Finn chambers (Epitest Ltd Oy, Finland)를 시험 부위에 첩포하였다.
이론/모형
- 녹두추출물을 함유하는 조성물의 자극완화 효과를 최종적으로 평가하기 위하여 Double-blind clinical usage test를 수행하였다. 23세~34세의 30명의 여성 피험자를 대상으로 실시하였으며, 피험자들은 녹두추출물 함유 조성물 및 placebo를 하루에 최소 두 번, 아침과 저녁에 평상시 사용 조건으로 사용하게끔 한 다음, 자극 여부 및강도를 1일 1회씩 설문지에 작성하도록 하였다.
- 반응물을 2000 rpm으로 회전시킨 후 상층액의 히스타민 양을 Shoe et al. 방법[9]에 의해 측정하였다. 시험물질이 Compound 48/80에 의해 비만세포에서 분비되는 히스타민의 양을 감소시키는 정도를 측정하였으며, 대조군으로는 천식과 관련된 알러지 치료제인 Disodium cromoglycate (DSCG)가 이용되었다.
- 비만세포의 순도는 Brayet et al.에 의해 제안된 방법에 의해 측정하였다[8]. 시험물질은 증류수 또는 에탄올에 녹여 비만세포에 적용하였으며, 시험물질 적용 10분 후에 compound 48/80 (0.
- 24시간 후에 첩포를 제거하고 30분, 24시간, 48시간 후에 자극 발생 유무를 평가하였다. 평가 기준은 International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG)의 판정 기준에 따랐으며, 피부 자극 유발 가능성의 평가는 다음 계산식으로부터 계산된 평균값으로 하였다[11, 12].
성능/효과
- 일반적으로 제품 적용 초기에 높은 피부 자극을 보이다가 시간이 경과함에 따라 피부 자극이 감소하는 경향을 잘 나타내 주고 있다. 2.0% 녹두추출물이 포함된 제품에서 제품 적용 초기 단계의 자극을 많이 감소시킴을 확인할 수 있다. Figure 6은 itching, stinging, burning, eye irritation 등의 다양한 자극에 대한 녹두추출물의 우수한 자극완화 효과를 보여주고 있다.
- 3%로 농도 의존적 증가 경향을 보였다. 또한 알러지 치료제로 널리 사용되고 있는 약물인 Disodium cromoglycate (DSCG)와 유사한 히스타민 유리 억제 효과를 지니고 있는 것을 알 수 있다.
- 본 연구에서는 이러한 항산화작용 이외에 녹두추출물의 항염증 기작을 좀 더 밝히고자 비만세포로부터의 compound 48/80 유도성 히스타민유리 억제 효능 시험 및 5-lipoxygenase 활성 억제 효능시험을 실시하였다. 시험 결과, 녹두추출물은 5-Hpoxy-genase assay에서는 활성 억제 효과를 보이지 않았으나 (date not shown), 히스타민 유리를 상당히 억제하는 효과를 보였다(Figure 2). 흰쥐 복강 비만세포로부터의 compound 48/80 유도성 히스타민 유리 억제 정도는 녹두추출물의 양을 50, 100, 200, 500 ug/mL으로 증가시킴에 따라 16.
- 시험 결과, 활성 성분으로 vitexin 및 isovitexin을 포함하는 녹두추출물을 피부 자극을 유발시키는 자극원을 포함하는 조성물에 적용함으로써 우수한 자극완화 효과를 확인할 수 있었다. 인체 첩포시험 및 자극감시험 결과, 녹두추출물을 포함한 조성물이 자극원만을 포함하는 조성물에 비해 약 30~60% 정도의 우수한 자극완화 효과를 보여주었으며, Double-blind usage test 결과에서도 녹두추출물의 탁월한 자극완화 효과를 확인할 수 있었다.
- 수 있었다. 인체 첩포시험 및 자극감시험 결과, 녹두추출물을 포함한 조성물이 자극원만을 포함하는 조성물에 비해 약 30~60% 정도의 우수한 자극완화 효과를 보여주었으며, Double-blind usage test 결과에서도 녹두추출물의 탁월한 자극완화 효과를 확인할 수 있었다. 이러한 자극완화 효과는 녹두추출물의 항산화효과, 항염증 효과, 그리고 히스타민 유리 억제 효과 등으로 설명되어질 수 있다.
- 자극원 및 녹두추출물 모두를 포함하고 있지 않은 formula #1 (negative control)의 평균 피부 반응도는 1.11 이었으며, 조성물 내의 2.0% 녹두추출물은 5.0% lactic acid에 대하여 formula #2의 평균 피부반응도 5.56을 formula #5의 평균 피부반응도 2.50으로, 4000 IU retinol 에 대하여 formula #3의 평균 피부반응도 250을 formula #6의 평균 피부반응도 1.67로, 1.0% preservative mixture (methyl paraben (0.4%), propyl paraben (0.2%), phen oxyethanol (0.4%))에 대하여 formula #4의 평균 피부반응도 4.44를 formula #7의 평균 피부반응도 2.78로 감소시키는 것을 확인할 수 있다. 전체적으로 자극완화제로서 녹두추출물을 함유하는 조성물이 positive control과 비교해서 30~60%의 자극완화 효과를 보여주는 것을 알 수 있다.
- 29로 감소시킴을 관찰할 수 있다. 전체적으로 녹두추출물을 포함한 제형이 positive control과 비교해서 30~50%의 자극완화 효과가 있음을 알 수 있다.
- 78로 감소시키는 것을 확인할 수 있다. 전체적으로 자극완화제로서 녹두추출물을 함유하는 조성물이 positive control과 비교해서 30~60%의 자극완화 효과를 보여주는 것을 알 수 있다.
- 시험 결과, 녹두추출물은 5-Hpoxy-genase assay에서는 활성 억제 효과를 보이지 않았으나 (date not shown), 히스타민 유리를 상당히 억제하는 효과를 보였다(Figure 2). 흰쥐 복강 비만세포로부터의 compound 48/80 유도성 히스타민 유리 억제 정도는 녹두추출물의 양을 50, 100, 200, 500 ug/mL으로 증가시킴에 따라 16.2, 38.4, 60.1, 64.3%로 농도 의존적 증가 경향을 보였다. 또한 알러지 치료제로 널리 사용되고 있는 약물인 Disodium cromoglycate (DSCG)와 유사한 히스타민 유리 억제 효과를 지니고 있는 것을 알 수 있다.
후속연구
- 이러한 자극완화 효과는 녹두추출물의 항산화효과, 항염증 효과, 그리고 히스타민 유리 억제 효과 등으로 설명되어질 수 있다. 결론적으로, 본 연구를 통하여 화장품에 적용할 수 있는 우수한 자극완화 물질로 녹두추출물을 발견하였으며, 이와 같은 녹두추출물은 저자극 화장품을 계발하는데 큰 기여를 할 것으로 기대되어진다.
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