[국내논문]Particulate Leaching 기법을 사용한 Polymer Scaffold 상의 세포증식에 있어서 젤라틴 입자의 효과 Effect of Gelatin Particles on Cell Proliferation in Polymer Scaffolds Made Using Particulate Leaching Technique.원문보기
조직공학은 생명과학, 의학, 공학의 기본개념 및 기술을 바탕으로 생체조직을 대체할 수 있는 인공조직 및 장기를 제작하여 이식함으로써 생체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목표로 하는데 여기에 사용되는 기본 재료가 장기나 조직의 형태를 만들도록 돕는 scaffold이다. Scaffold를 만드는데 있어서 Solvent-casting과 Particulate leaching 기법은 다공성 폴리머 scaffold의 제조에서 널리 쓰이는 방법인데 여기 쓰이는 particle에는 소금과 젤라틴 둥이 사용되고 있다. 소금은 얻기가 쉽고 다루기에도 편리하다는 장점 때문에 가장 일반적으로 사용되고 있으며 젤라틴은 소금에 비하여 세포의 초기 접착과 증식에 유리하다는 이유로 최근에 많이 사용되고 있으나 이에 관한 비교실험은 아직 보고 된 바 없다. 본 연구에서는 소금과 젤라틴으로 만들어진 두 가지 scaffold를 비교해 보았으며 그 결과 젤라틴 scaffold가 초기상태의 세포 접합과 증식에 있어서 좋은 결과를 보였고 같은 공극율일 때 공극의 연결 상태가 훨씬 더 우수한 결과를 보였다.
조직공학은 생명과학, 의학, 공학의 기본개념 및 기술을 바탕으로 생체조직을 대체할 수 있는 인공조직 및 장기를 제작하여 이식함으로써 생체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목표로 하는데 여기에 사용되는 기본 재료가 장기나 조직의 형태를 만들도록 돕는 scaffold이다. Scaffold를 만드는데 있어서 Solvent-casting과 Particulate leaching 기법은 다공성 폴리머 scaffold의 제조에서 널리 쓰이는 방법인데 여기 쓰이는 particle에는 소금과 젤라틴 둥이 사용되고 있다. 소금은 얻기가 쉽고 다루기에도 편리하다는 장점 때문에 가장 일반적으로 사용되고 있으며 젤라틴은 소금에 비하여 세포의 초기 접착과 증식에 유리하다는 이유로 최근에 많이 사용되고 있으나 이에 관한 비교실험은 아직 보고 된 바 없다. 본 연구에서는 소금과 젤라틴으로 만들어진 두 가지 scaffold를 비교해 보았으며 그 결과 젤라틴 scaffold가 초기상태의 세포 접합과 증식에 있어서 좋은 결과를 보였고 같은 공극율일 때 공극의 연결 상태가 훨씬 더 우수한 결과를 보였다.
On the background of general idea and technique of bioscience, medicine and engineering, tissue engineering aim at maintenance, improvement and repair of human body function through manufacturing and transplantation of artificial tissue and organ exchangeable human body. Basic material used in the a...
On the background of general idea and technique of bioscience, medicine and engineering, tissue engineering aim at maintenance, improvement and repair of human body function through manufacturing and transplantation of artificial tissue and organ exchangeable human body. Basic material used in the area is scaffold that aid tissue and organ formation. Making scaffold, solvent-casting and particulate leaching technique is widely used in manufacturing of porous polymer scaffold. There are many types of particle including salt and gelatin. Salt is a most commonly used particulate because it is easily available and very easy to handle and gelatin particle is another candidate for this method because it is known as a material, which enhances cell attachment and proliferation. But there is no comparative study of two kinds of materials. In this study we compared the biocompatibility of the two scaffolds made from salt(salt scaffold) and gelatin particle (gelatin scaffold). These results demonstrated that gelatin scaffold showed better attachment of cells at the initial stage and better proliferation of cells. The better performance of gelatin scaffold is contributed to the better connection of pores in the same porosity.
On the background of general idea and technique of bioscience, medicine and engineering, tissue engineering aim at maintenance, improvement and repair of human body function through manufacturing and transplantation of artificial tissue and organ exchangeable human body. Basic material used in the area is scaffold that aid tissue and organ formation. Making scaffold, solvent-casting and particulate leaching technique is widely used in manufacturing of porous polymer scaffold. There are many types of particle including salt and gelatin. Salt is a most commonly used particulate because it is easily available and very easy to handle and gelatin particle is another candidate for this method because it is known as a material, which enhances cell attachment and proliferation. But there is no comparative study of two kinds of materials. In this study we compared the biocompatibility of the two scaffolds made from salt(salt scaffold) and gelatin particle (gelatin scaffold). These results demonstrated that gelatin scaffold showed better attachment of cells at the initial stage and better proliferation of cells. The better performance of gelatin scaffold is contributed to the better connection of pores in the same porosity.
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문제 정의
본 연구에서는 소금과 젤라틴 두 가지 물질을 사용한 scaffold를 비교함으로써 세포의 배양과 접합에 좀 더 효과적인 scaffold를 찾고자 하여 scaffold에서 연골세포와 평활근세 포가 자라는 것을 조직학적 분석과 alamar blue assay를 사용하여 관찰하였다.
또한 이러한 합성재료는 원하는 기계적인 특성을 갖추도록 만들 수 있다는 장점이 있다.⑹ 이러한 scaffold에 다공성을 주는 재료에 여러가지 물질이 사용되는데 많이 사용되는 소금과 젤라틴에 대한 구체적인 비교자료가 없어 두 재료로 만든 scaffold를 비교하고자 본 실험을 수행하였다.
제안 방법
Scaffold의 pore 상태는 SEM으로 관찰하고 세포를 배양한 cell-polymer construct는 Hematoxylin/Eosin 염색과 Alamar Blue assay(SEROTEC U.K.)로 측정하여 성장정도를 비교하였다. Alamar blue assay는 세포의 산화-환원작용을 측정하여 발색정도에 따라 성장과 대사를 측정하는 방법으로 살아있는 세포에 영향을 주지 않고 사용할 수 있는 간단한 방법이다.
대상 데이터
실험에 사용한 동물은 15-20kg의 잡종견을 사용했으며 thiopental sodium을 사용하여 intravenous injection방법으로 마취하고 호흡기를 통한 가스흡입(02 11/min, N2O 11/min, halothane 1-1.5%)으로 마취를 유지하였다.
성능/효과
생분해성 폴리머의 내부에 있는 많은 공극은 세포가 성장, 분열함에 따라서 서서히 채워지면서 조직을 형성하는데 중요한 역할을 한다. 공극을 만드는 여러가지 물질 중에서 소금과 젤라틴이 사용상의 용이성과 인체에 무해함으로 인해 가장 많이 사용되고 있지만 두 종류의 물질을 사용한 scaffold 가 공극의 형상이나 특성에 차이를 보이며 특히 소금의 경우 적은 양이라도 scaffold내에 남아 있으면 세포의 성장에 좋지 않은 영향을 줄 수 있다.
근육세포와 연골세포는 분리 후 배양이 잘 되었으며 (Figure 1, 2) scaffold 또한 원하는 형태와 크기로 잘 성형되었다. salt scaffold보다는 gelatin scaffold가 성형성이 더 뛰어났으며 공극의 연결 상태를 보기 위해 scanning electron microscope로 찍어본 결과 똑같은 공극률일 경우 gratin PLGA scaffold가 salt PLGA scaffold보다 공극의 연결 상태가 훨씬 좋았으며 공극도 전반적으로 균일하게 분포되었다 (Figure 3, 4).
세포는 형태학적 이상 없이 잘 자랐으며 세포를 scaffold에 이식한 직후에는 세포가 전체적으로 분산되어 있었으나 3주 후에는 전반적으로 고르게 퍼지고 덩어리를 만들며 일정한 형태를 형성하였고 HZE 염색을 통한 관찰에서도 scaffold 내부로 세포가 고르게 퍼지며 성장함을 알 수 있었다(Figure 5). Alamar Blue assay 결과는 세포가 배양되면서 초기에는 증식률이 높지 않았지만 일정 수의 세포 수에서는 증식률이 증가하는 양상을 보였다(Figure 6).
3주 동안 세포의 증식속도는 근육세포와 연골세포 모두 비슷하게 나타났으나 같은 세포의 scaffold에 따른 증식속도 를 비교해보면 젤라틴을 사용한 scaffold가 salt를 사용한 scaffold보다 더 높은 AB assay 수치를 보여 젤라틴을 사용한 경우가 세포를 배양하는데 있어서 소금을 사용하는 경우보다 더 좋음을 알 수 있었다. 그리고 scaffold에사용한 particle 종류에 따른 성장률의 차이가 연골세포에서보다는 근육세포에서 더 크게 벌어지는 결과를 보였다 (Figure 7, 8)
본 실험에서 같은 용매와 제조공정을 사용하였음에도 젤라틴으로 만든 scaffold가 소금으로 만든 scaffold보다 더 좋은 공극간 연결 상태를 나타낸 것은 공극을 만드는 물질의 차이가 원인이라고 사료된다. 그리고 PLGA의 비중(13-1.53)을 비교했을 때 젤라틴의 비중(0.9-1.2)이 소금(비중 2.16)에 비해 PLGA와 비슷하여 전체 scaffold 상에 고르게 분포되므로 젤라틴 scaffold가 더 일정한 형태를 보이고 공극간 연결이 소금 scaffold에 비해서 더 좋았을 것으로 판단된다.
세포의 성장에 있어서도 젤라틴을 사용한 scaffold가 더 잘 성장하는 결과를 보였는데 이는 같은 공극률일 때 공극의 연결 상태가 더 좋으면 세포가 자라는데 있어서 충분한 공간이 확보되고 양분의 고른 확산이 일어나므로 세포가 성장하고 조직화하기에 더 좋은 조건을 갖추게 되므로 결과적으로 세포의 분산과 성장이 더 좋았다고 추측할 수 있다. 또한 근육세포에서 scaffold에 따른 성장률의 차이가 연골세포에서 나타나는 성장률의 차이보다 더 큰 것은 근육세포가 소금 scaffold에 더 민감하다는 것을 보여주는 것으로 사료된다.
생체재료에는 콜라겐 같은 천연재료와 각종 폴리머로 대표되는 인공재료가 있는데 어딴. 종류를 사용하건 재료가 세포의 성장과 이동 및 효과적인 조직의 형성을 돕기 위해서는 재료의 공극율이 높아야 하고 동시에 공극간의 연결이 잘되어 있어야 하는데 본 연구에서는 젤라틴 scaffold가 공극의 연결에서 더 효과적으로 나타났으며 세포의 성장 또한 더 좋은 결과를 보였다. 이에 scaffold를 제조하는데 있어서 salt를 사용한 방법보다는 gelatin을 사용하는 방법이 세포의 접합과 성장에 있어서 더 유용하다는 결론을 얻었다.
종류를 사용하건 재료가 세포의 성장과 이동 및 효과적인 조직의 형성을 돕기 위해서는 재료의 공극율이 높아야 하고 동시에 공극간의 연결이 잘되어 있어야 하는데 본 연구에서는 젤라틴 scaffold가 공극의 연결에서 더 효과적으로 나타났으며 세포의 성장 또한 더 좋은 결과를 보였다. 이에 scaffold를 제조하는데 있어서 salt를 사용한 방법보다는 gelatin을 사용하는 방법이 세포의 접합과 성장에 있어서 더 유용하다는 결론을 얻었다.
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