본 실험은 transforming growth factor-${\beta}1$(TGF-${\beta}1$)이 첨가된 chondrogenic induction medium(CIM)을 이용하여 인간지방조직에서 유래된 중간엽 줄기세포(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ATMSCs)의 연골형성능과 gelatin-chondroitin-glucosamine scaffold(GCG-scaffold)에 접종시킨 ATMSCs의 연골형성능을 알아보고자 수행하였다. ATMSCs와 생쥐 chondrocyte를 기본배양액과 TGF-${\beta}1$이 첨가되지 않은 CIM1 및 TGF-${\beta}1$이 첨가된 CIM2에서 배양하여 연골형성능을 비교하였다. ATMSCs의 연골형성은 gelatin scaffold(G-scaffold)와 GCG-scaffold를 사용하여 glycosaminoglycan(GAG) 합성과 조직화학적 염색으로 연골기질형성 여부를 확인하였다. 펠렛 배양에서 ATMSCs와 chondrocyte의 GAG합성은 대조군에서 14일의 배양기간 동안 약간 증가하였으나, CIM1과 CIM2배양군은 배양 14일에 대조군에 비해크게 증가하였으며, CIM2 배양군에서 가장 높았다. 그러나 연골기질은 배양 14일에 CIM2 배양군에서만 Safranin O와trichrome에 의해 염색되었다. Well plate에서 배양된 ATMSCs의 증식은 모든 배양군에서 배양 10일까지 계속적인 세포증식이 일어났으며, 대조군에 비해 CIM 배양군이 높았다. ATMSCs 접종 후 플라스크나 scaffold의 세포부착률은 배양시간이 길어짐에 따라 모든 배양군에서 증가하였고, 플라스크에 비해 scaffold에서 더욱 높게 나타났다. Scaffold에 ATMSCs 접종후 GAG 합성은 28일의 배양기간 동안 대조군에서는 별 변화가 없었으나, CIM1, CIM2 배양군은 대조군보다 GAG합성이 증가되었다. CIM2 배양군에서 GAG 합성이 매우 높게 나타났다. 또한 G-scaffold보다 GCG-scaffold에서 GAG 합성이 약간 높게 나타났다. 조직화학적으로 관찰한 ATMSCs의 연골기질형성도 CIM2 배양군의 GCG-scaffold에서 가장높게 나타났다. 본 실험의 결과들을 종합해 볼 때, 펠렛 배양에서 ATMSCs는 생쥐 chondrocyte보다 낮은 연골형성능을 보였고, CIM2 배양군에서만 연골기질이 형성된 것으로 보아 TGF-${\beta}1$이 연골분화에 중요한 요소로 작용한 것이라 사료된다. G-scaffold는 효과적인 연골분화 환경을 제공해 줌으로써 ATMSCs의 세포부착률과 GAG 합성을 증가시키는 것으로보여지며, G-scaffold보다 GCG-scaffold에서 많은 연골기질이 형성된 것은 GCG-scaffold에 첨가된 chondroitin과 glucosamine이연골기질 형성을 촉진시키는 물질로 작용한 것으로 사료된다.
본 실험은 transforming growth factor-${\beta}1$(TGF-${\beta}1$)이 첨가된 chondrogenic induction medium(CIM)을 이용하여 인간지방조직에서 유래된 중간엽 줄기세포(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ATMSCs)의 연골형성능과 gelatin-chondroitin-glucosamine scaffold(GCG-scaffold)에 접종시킨 ATMSCs의 연골형성능을 알아보고자 수행하였다. ATMSCs와 생쥐 chondrocyte를 기본배양액과 TGF-${\beta}1$이 첨가되지 않은 CIM1 및 TGF-${\beta}1$이 첨가된 CIM2에서 배양하여 연골형성능을 비교하였다. ATMSCs의 연골형성은 gelatin scaffold(G-scaffold)와 GCG-scaffold를 사용하여 glycosaminoglycan(GAG) 합성과 조직화학적 염색으로 연골기질형성 여부를 확인하였다. 펠렛 배양에서 ATMSCs와 chondrocyte의 GAG합성은 대조군에서 14일의 배양기간 동안 약간 증가하였으나, CIM1과 CIM2배양군은 배양 14일에 대조군에 비해크게 증가하였으며, CIM2 배양군에서 가장 높았다. 그러나 연골기질은 배양 14일에 CIM2 배양군에서만 Safranin O와trichrome에 의해 염색되었다. Well plate에서 배양된 ATMSCs의 증식은 모든 배양군에서 배양 10일까지 계속적인 세포증식이 일어났으며, 대조군에 비해 CIM 배양군이 높았다. ATMSCs 접종 후 플라스크나 scaffold의 세포부착률은 배양시간이 길어짐에 따라 모든 배양군에서 증가하였고, 플라스크에 비해 scaffold에서 더욱 높게 나타났다. Scaffold에 ATMSCs 접종후 GAG 합성은 28일의 배양기간 동안 대조군에서는 별 변화가 없었으나, CIM1, CIM2 배양군은 대조군보다 GAG합성이 증가되었다. CIM2 배양군에서 GAG 합성이 매우 높게 나타났다. 또한 G-scaffold보다 GCG-scaffold에서 GAG 합성이 약간 높게 나타났다. 조직화학적으로 관찰한 ATMSCs의 연골기질형성도 CIM2 배양군의 GCG-scaffold에서 가장높게 나타났다. 본 실험의 결과들을 종합해 볼 때, 펠렛 배양에서 ATMSCs는 생쥐 chondrocyte보다 낮은 연골형성능을 보였고, CIM2 배양군에서만 연골기질이 형성된 것으로 보아 TGF-${\beta}1$이 연골분화에 중요한 요소로 작용한 것이라 사료된다. G-scaffold는 효과적인 연골분화 환경을 제공해 줌으로써 ATMSCs의 세포부착률과 GAG 합성을 증가시키는 것으로보여지며, G-scaffold보다 GCG-scaffold에서 많은 연골기질이 형성된 것은 GCG-scaffold에 첨가된 chondroitin과 glucosamine이연골기질 형성을 촉진시키는 물질로 작용한 것으로 사료된다.
The present experiment was performed to evaluate the chondrogenic differentiation potential of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ATMSCs) in the chondrogenic induction medium (CIM) with transforming growth factor-${\beta}1$ (TGF-${\beta}1$) and to evaluate the...
The present experiment was performed to evaluate the chondrogenic differentiation potential of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ATMSCs) in the chondrogenic induction medium (CIM) with transforming growth factor-${\beta}1$ (TGF-${\beta}1$) and to evaluate the chondrogenic differentiation of ATMSCs seeded in gelatin-chondroitinglucosamine scaffold (GCG-scaffold). ATMSCs and mouse chondrocytes were cultured in the basic medium and CIM without TGF-${\beta}1$ (CIM1) or with TGF-${\beta}1$ (CIM2) for chondrogenic differentiation potential. The chondrogenic differentiation of ATMSCs was evaluated by glycosaminoglycan (GAG) synthesis and histochemical staining. In pellet culture, GAG synthesis of ATMSCs and chondrocyte was increased in culture on 14 days, but higher in CIM1 than basic medium, especially highest in CIM2. Cartilage matrix was observed in ATMSCs cultured in CIM2 on 14 days by Safranin O and trichrome staining. In well plate culture, proliferation of ATMSCs was continuously increased in culture on 10 days and higher in CIM than basic medium. The cell adhesion rate of ATMSCs seeded in flask or scaffolds was continuously increased during culture period, but higher in scaffold than flask. GAG synthesis of ATMSCs seeded in scaffolds showed no change in control group. In the CIM groups, GAG synthesis of ATMSCs was continuously increased than control group during culture period, especially very high in CIM2 and in the GCG-scaffold was slightly higher than the gelatin scaffold (G-scaffold). The present results demonstrated that ATMSCs showed an low chondrogenic differentiation potential, compared to mouse chondrocytes for 14 days of culture. TGF-${\beta}1$ is important factor in chondrogenic differentiation of ATMSCs. Gelatin scaffold was considered to increasing the effective chondrogenic differentiation environment. ATMSCs seeded in GCG-scaffold was more effective in chondrogenesis than in G-scaffold. Conclusively, the present results demonstrated that the treatment of chondroitin and glucosamine in the scaffold was more effective to promote the cartilage matrix formation.
The present experiment was performed to evaluate the chondrogenic differentiation potential of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ATMSCs) in the chondrogenic induction medium (CIM) with transforming growth factor-${\beta}1$ (TGF-${\beta}1$) and to evaluate the chondrogenic differentiation of ATMSCs seeded in gelatin-chondroitinglucosamine scaffold (GCG-scaffold). ATMSCs and mouse chondrocytes were cultured in the basic medium and CIM without TGF-${\beta}1$ (CIM1) or with TGF-${\beta}1$ (CIM2) for chondrogenic differentiation potential. The chondrogenic differentiation of ATMSCs was evaluated by glycosaminoglycan (GAG) synthesis and histochemical staining. In pellet culture, GAG synthesis of ATMSCs and chondrocyte was increased in culture on 14 days, but higher in CIM1 than basic medium, especially highest in CIM2. Cartilage matrix was observed in ATMSCs cultured in CIM2 on 14 days by Safranin O and trichrome staining. In well plate culture, proliferation of ATMSCs was continuously increased in culture on 10 days and higher in CIM than basic medium. The cell adhesion rate of ATMSCs seeded in flask or scaffolds was continuously increased during culture period, but higher in scaffold than flask. GAG synthesis of ATMSCs seeded in scaffolds showed no change in control group. In the CIM groups, GAG synthesis of ATMSCs was continuously increased than control group during culture period, especially very high in CIM2 and in the GCG-scaffold was slightly higher than the gelatin scaffold (G-scaffold). The present results demonstrated that ATMSCs showed an low chondrogenic differentiation potential, compared to mouse chondrocytes for 14 days of culture. TGF-${\beta}1$ is important factor in chondrogenic differentiation of ATMSCs. Gelatin scaffold was considered to increasing the effective chondrogenic differentiation environment. ATMSCs seeded in GCG-scaffold was more effective in chondrogenesis than in G-scaffold. Conclusively, the present results demonstrated that the treatment of chondroitin and glucosamine in the scaffold was more effective to promote the cartilage matrix formation.
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문제 정의
이에 본 실험은 TGF-β1이 인간지방조직에서 유래된 중간엽 줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ATMSCs)의 연골세포로의 분화에 미치는 영향과, chondroitin과 glucosamine이 첨가된 gelatin scaffolds에서 ATMSCs의 연골형성능을 알아보고자 실험을 수행하였다.
제안 방법
기본배양액은 1% FBS, 100 ㎕/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin이 포함된 DMEM-L을 사용하였고, 연골형성유도 배양액1(chondrogenic induction medium 1, CIM1)은 기본 배양액에 1% insulin-transferrin-selenium(Sigma), 1×10－7M dexamethasone(Sigma), 1.3×10－4M ascorbate-2-phosphate(Sigma)를 첨가하였고, 연골형성유도 배양액2(chondrogenic induction medium 2, CIM2)는 CIM1에 10 ng/㎖ transforming growth factor-β1(TGF-β1, Sigma)을 첨가하여 사용하였다.
세포분리 후 75 ㎖ 플라스크에 2×105의 세포수를 접종하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 10% FBS 가 포함된 DMEM-L 배양액에서 배양하였고, 세포가 80～90% 정도 증식하였을 때 계대배양을 실시하였다.
원심분리 후 tube의 상층액 제거후 1 ㎖의 DMEM-L 배양액을 첨가하여 현탁한 뒤 T-75 플라스크(SPL)에 2×105의 세포수가 되도록 접종하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 계대배양을 실시하였다.
배양액은 10% fetal bovine serum(FBS, GIBCO), 100 ㎕/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium-low glucose(DMEM-L, GIBCO)를 사용하였으며, 2～3일에 한 번씩 배양액을 교체하였다. 세포가 배양용기에 80～90%까지 증식하였을 때 배양용기 내 배양액을 제거한 후 2 ㎖의 TrepLE(GIBCO)을 첨가하여 배양기에 3～5분간 방치한 뒤 배양용기로부터 약 90% 이상 단일 세포로 분리된 것을 현미경으로 확인한 후 10 ㎖의 DMEM-L 배양액을 첨가하여 15 ㎖ conical tube(SPL)에 옮겨 1,500 rpm 에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 tube의 상층액 제거후 1 ㎖의 DMEM-L 배양액을 첨가하여 현탁한 뒤 T-75 플라스크(SPL)에 2×105의 세포수가 되도록 접종하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 계대배양을 실시하였다.
/tube의 세포수로 맞추어 10 ㎖의 DMEM-L 배양액을 첨가하여 1,500 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 침강된 세포가 풀리지 않도록 피펫을 이용하여 상층액을 제거하고 3개의 tube에 기본배양액과 CIM1과 CIM2를 각각 1 ㎖ 첨가하여 배양하였다. 기본배양액과 CIM1 및 CIM2를 넣어준 각각의 tube는 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기 에서 배양시켰고, 배양 12시간마다 tube를 굴려 뭉쳐진 세포가 바닥에 붙지 않도록 하며, 배양액은 3일에 한번씩 500 ㎕ 씩 새 배양액으로 교체하였다.
원심분리 후 침강된 세포가 풀리지 않도록 피펫을 이용하여 상층액을 제거하고 3개의 tube에 기본배양액과 CIM1과 CIM2를 각각 1 ㎖ 첨가하여 배양하였다. 기본배양액과 CIM1 및 CIM2를 넣어준 각각의 tube는 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기 에서 배양시켰고, 배양 12시간마다 tube를 굴려 뭉쳐진 세포가 바닥에 붙지 않도록 하며, 배양액은 3일에 한번씩 500 ㎕ 씩 새 배양액으로 교체하였다.
Solution A 5 ㎖에 solution B 2 ㎖를 혼합한 후 증류수를 부어 1ℓ로 만든 후 DMMB 시약으로 사용하였다. 기본배양액과 CIM1, CIM2를 처리한 펠렛은 배양 3일, 7일, 10일, 14일째 되는 날 피펫을 이용하여 500 ㎕의 기존 배양액을 새 배양액으로 교체하고 기존의 배양액은 96well plate에 50 ㎕씩 나눠 분주하고, 각각의 well에 DMMB 시약 200 ㎕를 첨가하여 충분히 혼합되도록 2～3회 pipetting한 후 microplate reader(ELx-800, Bio-TEK)를 이용하여 550 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
기본배양액과 CIM1, CIM2를 사용하여 ATMSCs와 chondrocytes의 연골분화를 유도하였고, 연골분화를 확인하기 위해 펠렛 배양한 ATMSCs는 배양 7일과 14일에, chondrocytes 는 배양 7일에 각각 Safranin O와 trichrome 염색을 이용하여 연골기질의 형성을 확인하였다.
펠렛은 배양액 제거 후 4% formaldehyde로 12시간 고정한 후, paraffin section법으로 5 ㎛의 박편을 만들어 Safranin O 염색과 trichrome 염색을 하여 현미경으로 관찰하였다.
TGF-β1이 ATMSCs의 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay(Mosmann, 1983)를 이용하여 분석하였다. ATMSCs는 24well plate(SPL)에 4,000 cells/well이 되도록 접종하여 기본배양액과 CIM1, CIM2를 각각 처리하여 세포배양하였고, 3일에 한번 씩 새 배양액으로 교체하였다. 세포배양 3, 7, 14일째 되는 날 plate의 상층액을 제거하고 0.
가 공급되는 습윤한 배양기에서 배양하였다. 배양 2시간 후 세포가 접종된 scaffold는 새 배양접시로 옮긴 뒤 scaffold가 충분히 잠기도록 기본배양액과 CIM1, CIM2를 각각 넣어주어 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 배양시켰으며, 배양액은 3일에 한번 씩 새 배양액으로 교체하였다.
계대배양을 통해 얻어진 ATMSCs는 기본배양액과 CIM1, CIM2를 넣어준 각각의 T-75 플라스크에 각각 2×105의 세포 수가 되도록 접종하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 배양하였다.
Paraffin section법으로 8～10 ㎛의 박편을 만들어 Safranin O염색과 trichrome 염색을 하여 현미경으로 관찰하였다.
Scaffold가 담긴 배양접시의 배양액을 제거한 후 ATMSCs를 1×108 cells/㎖로 기본배양액과 CIM1 및 CIM2에 각각 부유시켜서 1×106 cells/scaffold가 되도록 접종하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 배양시킨 뒤 배양 30분, 1시간, 2시간째에 DMEM-L 배양액을 5 ㎖ 첨가한 후 핀셋을 이용하여 scaffold를 배양액내에 2～3회 흔들어 준 후 scaffold를 제거한 뒤 피펫으로 배양접시에 부착된 세포를 분리하고, 분리된 세포는 15 ㎖ tube에 모아 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다.
가 공급되는 습윤한 배양기에서 배양하였다. 배양 후 30분, 1시간, 2시간에 광학현미경으로 배양 플라스크에 부착된 세포를 각각 관찰하였고, 배양 30분, 1시간, 2시간에 각각의 배양 플라스크에 부착되지 않은 세포는 채취하여 1,500 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 1 ㎖의 DMEM-L 배양액을 첨가하여 현탁시킨 뒤 세포수를 측정해서 처음 접종한 세포수와 비교하여 부착률을 계산하였다.
가 공급되는 습윤한 배양기에서 배양시킨 뒤 배양 30분, 1시간, 2시간째에 DMEM-L 배양액을 5 ㎖ 첨가한 후 핀셋을 이용하여 scaffold를 배양액내에 2～3회 흔들어 준 후 scaffold를 제거한 뒤 피펫으로 배양접시에 부착된 세포를 분리하고, 분리된 세포는 15 ㎖ tube에 모아 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 1 ㎖ DMEM-L 배양액을 첨가하여 현탁시킨 뒤 세포수를 측정해서 처음 접종한 세포수와 비교하여 부착률을 계산하였다.
ATMSCs를 접종한 gelatin(G) scaffold와 gelatin-chondroitinglucosamine(GCG) scaffold는 기본배양액과 CIM1 및 CIM2를 각각 사용하여 37℃, 5% CO2가 공급되는 습윤한 배양기에서 배양한 뒤 DMMB assay를 사용하여 배양 7일, 14일, 21일, 28일에 각각의 배양액에 함유된 GAG량은 microplate reader(ELx-800, Bio-TEK)를 이용하여 550 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
ATMSCs를 접종시킨 G-scaffold와 GCG-scaffold는 기본 배양액과 CIM1, CIM2를 각각 사용하여 각각 28일간 유도배양한 뒤 배양액 제거 후 4% formaldehyde로 48시간 고정하였다. Paraffin section법으로 8～10 ㎛의 박편을 만들어 Safranin O염색과 trichrome 염색을 하여 현미경으로 관찰하였다.
1. Glycosaminoglycan (GAG) synthesis of human adipose tissuederived mesenchymal stem cells (ATMSCs) and ICR-strain mouse cartilage tissue-derived chondrocytes in the basic medium and the chondrogenic induction medium (CIM) in pellet culture for 14 days. Optical density is arbitrary unit.
펠렛 배양에서 ATMSCs와 chondrocytes의 연골형성능을 비교하기 위해 유도배양과정에 형성되는 골기질성분인 GAG 의 합성률을 측정 비교하였다(Fig. 1). ATMSCs의 GAG 합성은 대조군에서는 14일의 배양 기간 동안 약간 증가하였으나, CIM1 배양군에서는 배양 10일에서 14일에 대조군의 2배, 3배로 각각 증가하였고, CIM2 배양군에서는 배양 7일에서 14일에 대조군의 3배, 6배, 6배로 각각 증가하였다(p<0.
ATMSCs와 chondrocytes는 기본배양액과 CIM1, CIM2에서 각각 배양하여 chondrocytes는 배양 7일에, ATMSC는 배양 7일과 14일에 Safranin O와 trichrome을 이용한 조직학적 염색방법으로 연골질 형성을 비교 관찰하였다(Fig. 2). 조직학적 염색에서 Safranin O는 연골기질을 붉게 염색시키며, trichrome은 type II collagen을 파랗게 염색시킨다.
Well plate에서 배양된 ATMSCs의 증식을 기본 배양액과 CIM1 및 CIM2에서 측정 비교하였다(Fig. 3). 배양 10일까지 모든 군에서 계속적인 세포 증식이 일어났는데, 세포 증식률은 대조군에 비해 CIM1군이 높고, CIM2군은 더욱 높았다(p<0.
기본배양액과 CIM1 및 CIM2 배양에 따른 ATMSCs의 부착률은 배양 플라스크에 세포를 접종시킨 뒤 30분, 1시간, 2시간 후에 측정하였다(Table 1). 세포 접종 후 배양시간이 길어짐에 따라 모든 군에서 세포부착률이 증가하였다.
기본배양액과 CIM1, CIM2 배양에 따른 G-scaffold와 GCGscaffold에서의 ATMSCs 부착률을 비교를 하기 위해 세포접종 30분, 1시간, 2시간에 각각 세포부착률을 측정 비교하였다(Table 2). Scaffold의 부착률은 배양시간이 길어짐에 따라 모든 군에서 상당히 증가하였으나, G-scaffold와 GCG-scaffold 간의 차이는 나타나지 않았다.
G-scaffold와 GCG-scaffold에 접종한 ATMSCs의 GAG 합성을 알아보기 위해 세포접종 7일, 14일, 21일, 28일에 DMMB assay를 이용하여 GAG 합성률을 측정 비교하였다(Fig. 4). 기본배양액에서 배양한 대조군에서는 G-scaffold와 GCG-scaffold 모두 28일간의 배양 기간 동안 미미한 GAG 합성을 보여 뚜렷한 변화는 없었으나, 배양 14일 이후에는 GCG-scaffold가 G-scaffold보다 약간 높게 나타났다(p<0.
G-scaffold와 GCG-scaffold에 ATMSCs를 접종하여 기본 배양액과 CIM1, CIM2에서 각각 28일 동안 연골분화를 유도한 뒤 Safranin O 염색과 trichrome 염색을 이용해 연골형성을 관찰하였다(Fig. 5). 기본배양액에서 배양한 G-scaffold 와 GCG-scaffold 모두에서 Safranin O와 trichrome에 의한 염색은 관찰되지 않았다.
5. Histological staining of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ATMSCs) cultured in gelatin scaffold and gelatin-chondroitin-glucosamine scaffold in the basic medium and the chondrogenic induction medium (CIM) for 28 days. A～F: Gelatin (G) scaffold.
Safranin O staining showed the presence of cartilagematrix by red color and trichrome straining showed the presence of type Ⅱ collagen by blue color. Positive Safranin O staining for cartilage-matrix was observed on G scaffold in the CIM2 group and on GCG scaffold in the CIM1 group and CIM2 group for 28 days. Positive trichrome staining for type II collagen was observed on G scaffold and GCG scaffold in the CIM1 group and the CIM2 group for 28 days.
대상 데이터
배양액은 10% fetal bovine serum(FBS, GIBCO), 100 ㎕/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium-low glucose(DMEM-L, GIBCO)를 사용하였으며, 2～3일에 한 번씩 배양액을 교체하였다.
인간 지방조직유래 중간엽 줄기세포(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ATMSCs)는 휴림 바이오셀(주)에서 제공받아 사용하였다.
Chondrocytes는 생후 4～5주된 Swiss albino인 ICR 계통의 생쥐에서 채취하였다. 생쥐를 경추파열로 도살 후 대퇴부의 연골조직만 떼어내었다.
데이터처리
실험은 3회 이상 반복하였으며, 대조군과 실험군의 통계적 유의성은 SPSS를 이용하여 Student t-test로 검정하였다.
이론/모형
펠렛 배양을 이용한 ATMSCs와 chondrocytes의 연골형성유도 배양과정에서 합성되는 GAG는 1,9-dimethylmethylene blue(DMMB) assay(Goldberg & Kolibas, 1990)를 이용하여 측정하였다.
TGF-β1이 ATMSCs의 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay(Mosmann, 1983)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
ATMSCs의 GAG 합성은 대조군에서는 14일의 배양 기간 동안 약간 증가하였으나, CIM1 배양군에서는 배양 10일에서 14일에 대조군의 2배, 3배로 각각 증가하였고, CIM2 배양군에서는 배양 7일에서 14일에 대조군의 3배, 6배, 6배로 각각 증가하였다(p<0.001).
ATMSCs는 기본배양액, CIM1, CIM2 배양군 모두에서 chondrocytes 보다 낮은 GAG 합성을 보였고, CIM1과 CIM2 배양군은 대조군과 유의한 차이를 보였다(p<0.001).
배양 10일까지 모든 군에서 계속적인 세포 증식이 일어났는데, 세포 증식률은 대조군에 비해 CIM1군이 높고, CIM2군은 더욱 높았다(p<0.01).
대조군과 CIM1군에서의 세포부착률은 별 차이가 없었으나, CIM2군에서는 약간 낮게 나타났다(p<0.05, p<0.01).
기본배양액과 CIM1, CIM2 배양에서 ATMSCs의 Safranin O와 trichrome 염색에 의한 결과는 다음과 같았다. 기본배양액에서 배양한 ATMSCs는 배양 14일 동안 Safranin O와 trichrome에 의한 염색은 관찰되지 않았고, CIM1 배양군과 CIM2 배양군은 배양 7일에는 Safranin O와 trichrome에 의한 염색은 관찰되지 않았다. 그러나 배양 14일에 CIM1 배양군은 펠렛 중심부위에 희미하게 염색된 것이 관찰되었고, CIM2 배양군에서는 CIM1 배양군보다 넓은 범위로 강하게 염색된 것을 관찰하였다.
7일간 기본배양액에서 배양한 chondrocytes은 Safranin O와 trichrome에 의한 염색은 관찰되지 않았고, CIM1 배양군에서는 펠렛의 중심부위에 Safranin O와 trichrome에 의해 희미하게 염색된 것을 관찰할 수 있었으며, CIM2 배양군은 CIM1 배양군보다 넓은 범위로 강하게 염색이 관찰되었다.
기본배양액과 CIM1 및 CIM2 배양에 따른 ATMSCs의 부착률은 배양 플라스크에 세포를 접종시킨 뒤 30분, 1시간, 2시간 후에 측정하였다(Table 1). 세포 접종 후 배양시간이 길어짐에 따라 모든 군에서 세포부착률이 증가하였다. 대조군과 CIM1군에서의 세포부착률은 별 차이가 없었으나, CIM2군에서는 약간 낮게 나타났다(p<0.
기본배양액과 CIM1, CIM2 배양에 따른 G-scaffold와 GCGscaffold에서의 ATMSCs 부착률을 비교를 하기 위해 세포접종 30분, 1시간, 2시간에 각각 세포부착률을 측정 비교하였다(Table 2). Scaffold의 부착률은 배양시간이 길어짐에 따라 모든 군에서 상당히 증가하였으나, G-scaffold와 GCG-scaffold 간의 차이는 나타나지 않았다.
기본배양액에서 배양한 대조군에서는 G-scaffold와 GCG-scaffold 모두 28일간의 배양 기간 동안 미미한 GAG 합성을 보여 뚜렷한 변화는 없었으나, 배양 14일 이후에는 GCG-scaffold가 G-scaffold보다 약간 높게 나타났다(p<0.001).
CIM1배양군에서는 배양 기간 동안 대조군에 비해 GAG합성이 2배, 3배, 4배로 각각 증가하였고, 배양 14일 이후에 GCG-scaffold가 G-scaffold보다 약간 높게 나타났다(p<0.05).
기본배양액에서 배양한 G-scaffold 와 GCG-scaffold 모두에서 Safranin O와 trichrome에 의한 염색은 관찰되지 않았다. CIM1 배양군에서 G-scaffold와 GCGscaffold 모두에서 Safranin O 염색은 관찰되지 않았고, trichrome 염색은 관찰되었다. CIM2 배양군에서 G-scaffold와 GCGscaffold 모두에서 Safranin O와 trichrome 염색이 뚜렷이 관찰되었으며, G-scaffold에 비해 GCG-scaffold에서 보다 강한 염색 결과를 보였다.
CIM1 배양군에서 G-scaffold와 GCGscaffold 모두에서 Safranin O 염색은 관찰되지 않았고, trichrome 염색은 관찰되었다. CIM2 배양군에서 G-scaffold와 GCGscaffold 모두에서 Safranin O와 trichrome 염색이 뚜렷이 관찰되었으며, G-scaffold에 비해 GCG-scaffold에서 보다 강한 염색 결과를 보였다.
지방조직은 풍부한 양의 중간엽 줄기세포(msenchymal stem cells, MSCs)를 채취할 수 있고, 골수에 비해 손쉽게 세포를 얻을 수 있으며, 채취과정 중 발생할 수 있는 공여자의 2차 감염 위험을 줄일 수 있다는 이점들로 인해 MSCs의 새로운 공급원으로서 가능성을 보였다. Zuk et al.
본 실험에서 펠렛 배양을 이용한 ATMSCs와 chondrocytes의 연골형성능 비교 실험(Fig. 1, 2)에서 ATMSCs와 chondrocytes 모두 TGF-β1이 첨가되지 않은 CIM1 배양군은 기본배양액으로 배양한 대조군보다 2배 이상 높은 GAG 합성 증가를 보였고, 조직학적 염색에 의한 연골성분은 매우 희미하게 관찰되었다.
, 2004). 본 실험에서도 펠렛 배양에서 ATMSCs의 연골형성능을 확인하였고(Fig. 2), scaffold에서도 glycosaminoglycan (GAG) 합성과 연골기질형성을 관찰함으로써 ATMSCs의 연골형성을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
반면에 TGF-β1이 첨가된 CIM2 배양군에서 chondrocytes는 배양 7일에 높은 GAG 합성률을 보였고, 조직학적염색을 이용해 연골기질형성이 뚜렷이 관찰되었다.
본 실험에서 배양 10일에 ATMSCs의 세포 증식률은 CIM2 배양군에서 기본배양액 배양군 및 CIM1 배양군보다 높은 증식률을 보였으나, 14일 이후 증식률은 감소하여 배양 14일에 가장 낮은 증식률을 보였는데(Fig. 3), 이러한 결과는 TGF-β1 첨가로 인한 ATMSCs의 연골성세포로의 분화가 일어나므로서 세포 증식률이 감소된 것으로 사료 된다.
본 실험에서 플라스크배양에서의 ATMSCs 부착률(Table 1)은 세포접종 30분, 1시간, 2시간에 기본배양액에서 배양한 대조군이 가장 높은 부착률을 보인 반면, CIM2 배양군은 가장 낮은 세포부착률을 보였다. Scaffold에 접종한 ATMSCs의 부착률(Table 2)은 세포접종 1시간, 2시간에는 CIM1과 CIM2 배양군이 G scaffold와 GCG scaffold 모두에서 기본 배양액 배양군과 유사한 세포부착률을 보였다.
본 실험에서 플라스크배양에서의 ATMSCs 부착률(Table 1)은 세포접종 30분, 1시간, 2시간에 기본배양액에서 배양한 대조군이 가장 높은 부착률을 보인 반면, CIM2 배양군은 가장 낮은 세포부착률을 보였다. Scaffold에 접종한 ATMSCs의 부착률(Table 2)은 세포접종 1시간, 2시간에는 CIM1과 CIM2 배양군이 G scaffold와 GCG scaffold 모두에서 기본 배양액 배양군과 유사한 세포부착률을 보였다. 플라스크배양에서 대조군과 CIM1 배양군에 비해 CIM2 배양군에서 낮은 부착률을 보인 것은 CIM2에 포함된 TGF-β1이 ATMSCs에 영향을 준 것으로 사료된다.
본 실험에서 배양 21일 이후 대조군을 포함한 모든 실험 군에서 chondroitin과 glucosamine을 첨가하여 제작한 GCG scaffold에서 gelatin만으로 제작한 G scaffold 보다 GAG 합성이 높게 나타났으며(Fig 4), 연골기질과 type II collagen의 형성도 높게 나타났다(Fig. 5).
본 실험의 결과들을 종합해 볼 때 펠렛 배양에서 ATMSCs 는 생쥐 chondrocytes보다 낮은 연골형성능을 보였고, CIM2 배양군에서만 연골기질이 형성된 것으로 보아 TGF-β1 이연골분화에 중요한 요소로 작용한 것이라 사료된다.
Chondrocyte의 GAG 합성은 대조군에서는 배양 기간 동안 약간 증가하였으나, CIM1 배양군에서는 배양 10일에서 14일에 대조군의 2배로 증가하였고, CIM2 배양군에서는 배양 7일에서 14일에 대조군의 3배, 4배, 5배로 각각 증가하였다(p<0.001).
CIM2 배양군에서는 배양 기간 동안 대조군에 비해 GAG 합성이 2배, 5배, 10배로 각각 급격히 증가하였고, 배양 21일 이후에 GCGscaffold가 G-scaffold보다 약간 높게 나타났다(p<0.05).
후속연구
1, 2) 위의 보고와 다른 결과를 보였다. 본 실험에서 배양 14일동안 기본배양액에서 배양한 ATMSCs는 연골형성을 보이지 않았지만 위의 여러 연구 등에 비추어 볼 때 좀 더 오랜 시간동안 배양을 하여 ATMSCs의 자발적인 연골형성이 이루어질 수 있는지 여부는 추후 실험을 통해 확인할 필요가 있다고 사료된 다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
과거 연골 손상시 치료법은 주로 어떤 방법을 이용하였는가?
과거 연골 손상시 치료법은 동족조직이나 자가조직을 이식 함으로써 손상부위의 회복력을 향상시키는 방법(Buckwalter & Mankin, 1998; Jackson & Simon, 1999)을 이용하였으나, 세포 채취 과정에서 환자와 기증자는 고통을 수반해야 하며, 외부 감염 발생의 우려가 있고, 세포이식 후 일부 세포에서만 연골분화가 일어나는 문제점 등을 가지고 있다(Tew et al., 2000).
중간엽 줄기세포의 사용이 왜 제한되어왔는가?
, 2001). MSCs는 배아와 성체에서 모두 얻을 수 있으나, 배아줄기세포의 경우 윤리적인 문제와 정부의 규제로 인하여 사용이 제한되어 왔다(Dresser, 2001).
연골 손상시 치료법에서 동족조직이나 자가조직을 이식 함으로써 손상부위의 회복력을 향상시키는 방법의 문제점은?
과거 연골 손상시 치료법은 동족조직이나 자가조직을 이식 함으로써 손상부위의 회복력을 향상시키는 방법(Buckwalter & Mankin, 1998; Jackson & Simon, 1999)을 이용하였으나, 세포 채취 과정에서 환자와 기증자는 고통을 수반해야 하며, 외부 감염 발생의 우려가 있고, 세포이식 후 일부 세포에서만 연골분화가 일어나는 문제점 등을 가지고 있다(Tew et al., 2000).
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