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문제 정의
- 본 연구에서는 발효 콩을 주원료로 한 기능성 식품에 대한 기능성 검토의 일환으로 항산화성, 항돌연변이원성 및 세포독성 효과를 검토하였기에 이에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 3%)로 혼합하여 시료 중량으로 10배의 70% 에탄올을 첨가하고 50℃에서 8시간씩 3회 추출하였으며, 감압여과장치에서 뜨거운 상태로 여과하여 -4 ℃ 냉장실에 24시간 방치 후 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결건조기를 이용하여 건조시켰다. 70% 에탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 분별분리를 행하여 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물충으로 극성의 차이에 의해 다섯가지 분획으로 조제하였다. 분리된 각각의 용매분획물은 50℃에서 감압농축 후, 동결건조하여 분획물을 얻었다.
- SRB(sulforhodamine B) assay는 세포 단백질 염색을 이용하여 세포 증식이나 독성을 측정하는 방법(13)으로 10%의 fetal bovine serum과 각각의 세포들인 인간 폐암세포(A549), 인간 유방암세포(MCF-7), 인간의 위암세포(AGS) 및 인간의 정상세포(293)을 함유하는 RPMI 1640 배지를 5x104 cell/mL 농도로 100 pL씩 각 well에 첨가하여 하루 동안 배양(37℃, 5% C6)시킨 후 PBS에 녹인 추출물들을 각각 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/mL씩 첨가하여 다시 48시간 배양시켰다. 그 후 상등액을 aspirator 로 조심스럽게 제거하고 차가운 10% TCA(4℃) 용액을 50 μL씩 첨가하여 세포들을 weU 바닥에 고정시켰다.
- TrpPl 이었다. 건열멸균 시킨 glass cap tube에 시료의 추출물을 각각 50 μL씩 첨가하고 이어서 변이원 물질을 각각 50 J1L씩 첨가하였다. 간접 변이원인 경우 10% S-9 mix를 250 μL씩 첨가하였다.
- 건조된 각 시료를 분말화 한 후 일정한 비율(발효 콩 : 68.5%, 기타 기능성 재료 : 31.2%, 비타민 C, B1, B2, B6 등 : 0.3%)로 혼합하여 시료 중량으로 10배의 70% 에탄올을 첨가하고 50℃에서 8시간씩 3회 추출하였으며, 감압여과장치에서 뜨거운 상태로 여과하여 -4 ℃ 냉장실에 24시간 방치 후 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결건조기를 이용하여 건조시켰다. 70% 에탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 분별분리를 행하여 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물충으로 극성의 차이에 의해 다섯가지 분획으로 조제하였다.
- Coward 등(10)은 아시아에서 많이 섭취하고 있는 콩 발효식품인 된장이나 miso, tempeh 등에서는 발효과정에서 isoflavone이 주로 흡수되기 쉬운 상태의 aglycone 형태로 변화되어 genistein, daidzein의 함량이 높아진다고 하였다. 따라서 본 연구에서는 콩을 발효 시킨 후 동결건조하여 분말화한 후 주성분으로 하고 이미 기능성이 알려진 여러가지 기능성 소재인 다시마, 해동피, 상엽, 옥발, 키토산, 동충하초, 가시오갈피, 녹차, 마늘, 생강 및 비타민 등을 일정한 비율로 혼합하여 기능성 식품을 제조하였다. 이와 같이 각종 기능성 성분을 함유한 발효 콩을 주원료로 한 기능성 식품은 그 기능성이 충분히 기대가 된다고 사료된다.
- 발효콩을 이용한 기능성 식품의 에탄올 추출물과 분획물들의 돌연변이원성 억제작용을 검토하기 위하여 Ames test에서 양성반응을 나타내며, 물질 그 자체로서 돌연변이를 유발하는 직접 변이원물질로 MNNG와 대사활성을 필요로 하는 간접 변이원 물질인 Trp-P-1 을 사용하여 각각의 농도에 따른 돌연변이원성 억제효과를 검토하였다. 실험 결과(Fig.
- 이것을 37℃에서 20분간 진탕 배양한 다음 상기의 돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생성된 복귀돌연변이 수를 측정하여 항돌연변이성 유무를 판정하였다. 발효콩을 주원료로 한 기능성 식품 추출물과 변이원 물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며, 항돌연변이활성은 변이원물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition, %)로 나타내었다.
- 본 실험에서는 각종 암세포에 대한 세포독성을 규명하기 위해 암세포로 A549, MCF-7 그리고 AGS와 대조군으로서 정상세포 293을 이용하여 발효 콩을 주원료로 한 기능성 식품의 에탄올 추출물과 분획물에 대하여 SRB assay를 행하였다. Fig.
- 살균이 끝난 후, 냉각시켜 미리 배양해 둔 Aspergillus ofyse와 Bacillus licheniformis 두 균주의 복합균을 2 mL(108/mL)씩 32℃에서 접종하여 3일 동안 배양시킨 후 UXTC에서 약 10~20분간 살균시키고 동결건조하여 분말화 시킨 후 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 다시마, 해동피, 상엽, 옥발, 키토산, 동충하초, 가시오갈피, 녹차, 마늘, 생강 등은 시장에서 한국산을 구입하여 분말화 한 후 실험에 사용하였다.
- 5x10-4 M DPPH solution(in methanol)을 1 mL를 첨가한 후, 30분간 암소에 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수소전자공여능은 각 실험을 3회 반복하였으며 RCwe 시료가 대조구의 흡광도를 1/2로 감소시키는 농도로 표시하였으며, 검체의 농도에 따른 수소전자공여능 검정 (standard curve)을 통해 결정하였다.
- 2 M sodium phosphate buffer(pH 74)로 전체량이 700 pL가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕 배양한 다음 histidine/biotin이 첨가된 top agar(45℃)를 2 mL씩 가하여 잘 혼합한 후 미리 조제해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평판고정화 시켜 37 ℃ 에서 48시간 배양하여 생성된 복귀돌연변이(Ws+ revertant colony)수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하였다.
- 2 M sodium phosphate buffer를 가하여 최종부피가 700 pL가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕 배양한 다음 상기의 돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생성된 복귀돌연변이 수를 측정하여 항돌연변이성 유무를 판정하였다. 발효콩을 주원료로 한 기능성 식품 추출물과 변이원 물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며, 항돌연변이활성은 변이원물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition, %)로 나타내었다.
- 한편, microsomal enzyme의 대사활성에 의해서만 돌연변이 원성을 나타내는 간접변이원으로서 실제로 식품을 통해 흡수될 수 있는 아미노산 가열분해물인 Tip-P-1 을 사용하여 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- Ames test를 개량한 preincubation법에 따라 항돌연변이원성 실험을 실시하였고, 실험에 사용한 변이원물질은 MNNG 및 TrpPl 이었다. 건열멸균 시킨 glass cap tube에 시료의 추출물을 각각 50 μL씩 첨가하고 이어서 변이원 물질을 각각 50 J1L씩 첨가하였다.
- 간접돌연변이 원으로 3-amino-l, 4-dimethyl-5H-pyrido-(4, 3-b)indol(Trp-P-l) 그리고 L-histidinee 일본 和光純藥 특급시약을 구입하였다. 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 Hepes buffer, Fetal bovine serum(FBS), Trypsin-EDTA는 Gibco사(USA.
- 본 실험에 이용된 인간 폐암세포 A549(Lung carcinoma, Human), 인간 위암세포 AGS(Gastric carcinoma, Human), 인간의 유방암세포 MCF-7(Breast adenocarcinoma, Human) 및 정상세포 293(transformed primary human embryonal kidney) 은 Korea Cell Line Bank (KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. 그 외 추출 용매인 에탄올, 핵산, 클로로포름, 게틸아세테이트, 부탄올 등은 특급시약을 사용하였다.
- 살균이 끝난 후, 냉각시켜 미리 배양해 둔 Aspergillus ofyse와 Bacillus licheniformis 두 균주의 복합균을 2 mL(108/mL)씩 32℃에서 접종하여 3일 동안 배양시킨 후 UXTC에서 약 10~20분간 살균시키고 동결건조하여 분말화 시킨 후 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 다시마, 해동피, 상엽, 옥발, 키토산, 동충하초, 가시오갈피, 녹차, 마늘, 생강 등은 시장에서 한국산을 구입하여 분말화 한 후 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 콩은 강원도 농협에서 국산(2001년 산)을 구입하였으며 콩을 수돗물로 9~10시간 정도 침지시킨 후, 물기를 제거하여 1 L 삼각 플라스크에 각각 250 g 씩 넣고 autoclave에서 121℃, 30~40분 정도 살균시켰다. 살균이 끝난 후, 냉각시켜 미리 배양해 둔 Aspergillus ofyse와 Bacillus licheniformis 두 균주의 복합균을 2 mL(108/mL)씩 32℃에서 접종하여 3일 동안 배양시킨 후 UXTC에서 약 10~20분간 살균시키고 동결건조하여 분말화 시킨 후 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.
- )로부터 구입하였다. 본 실험에 이용된 인간 폐암세포 A549(Lung carcinoma, Human), 인간 위암세포 AGS(Gastric carcinoma, Human), 인간의 유방암세포 MCF-7(Breast adenocarcinoma, Human) 및 정상세포 293(transformed primary human embryonal kidney) 은 Korea Cell Line Bank (KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. 그 외 추출 용매인 에탄올, 핵산, 클로로포름, 게틸아세테이트, 부탄올 등은 특급시약을 사용하였다.
- 간접돌연변이 원으로 3-amino-l, 4-dimethyl-5H-pyrido-(4, 3-b)indol(Trp-P-l) 그리고 L-histidinee 일본 和光純藥 특급시약을 구입하였다. 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 Hepes buffer, Fetal bovine serum(FBS), Trypsin-EDTA는 Gibco사(USA.)로부터 구입하였다. 본 실험에 이용된 인간 폐암세포 A549(Lung carcinoma, Human), 인간 위암세포 AGS(Gastric carcinoma, Human), 인간의 유방암세포 MCF-7(Breast adenocarcinoma, Human) 및 정상세포 293(transformed primary human embryonal kidney) 은 Korea Cell Line Bank (KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 직접 돌연변이원으로서 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG), glucose-6-phosphatee 미국 Sigma 회사로부터 구입하였다. 간접돌연변이 원으로 3-amino-l, 4-dimethyl-5H-pyrido-(4, 3-b)indol(Trp-P-l) 그리고 L-histidinee 일본 和光純藥 특급시약을 구입하였다.
이론/모형
- 70% 에탄올 추출물과 각 분획물들은 Choi 등(U)의 방법에 의한 수소전자공여능에 의해 항산화 활성을 측정하였다. 여러 농도의 시료를 4 mL의 methanol에 녹여, l.
- 발효콩을 주원료로 한 기능성 식품 에탄올 추출물의 돌연변이원성 실험은 S. typhimurium의 변이주인 TA98과 TA100을 이용하여 Ames test를 개량한 preincubation법(12)으로 실시하였다. 건열 멸균시킨 glass cap tube에 각각의 시료를 50 μg /plate씩 가하고 여기에 전배양 시킨 배양 균액 100 pL를 가한 다음 0.
성능/효과
- S. typhimurium TA98과 TA100을 이용한 Ames test를 행한 결과, 음성대조군의 복귀 돌연변이 집락수는 TA98이 17+4 그리고 TA100은 181+6 이었다. 발효콩을 주원료로 한 기능성 식품 에탄올 추출물과 각 분획물을 50, 100, 150, 200 u g/plate의 여러 농도를 첨가하여 실험한 결과, 집락수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 집락수의 큰 변화를 나타내지 않으므로 발효 콩을 이용한 기능성 식품의 추출물과 각 분획물들은 돌연변이원성을 나타내지 않은 것으로 판단되었다(데이타 생략).
- Trp-P-l(0.5 ]lg/plate)의 경우 Fig. 2에서는 S. typhimurium TA98, TA100 두 균주 모두에서 시료농도 증가에 따라 억제 효과 또한 증가하는 경향을 보였으며 시료농도 200ug/plate에서 두 균주 모두 에틸아세테이드 분획물에서 다른 분획보다 높은 활성을 나타내었으며, 각각 88.7%와 92.8%의 높은 억제율을 나타내었다.
- 6 로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다 (Table 1). 또한 비극성 부분의 분획보다는 극성부분의 분획에서 보다 강력한 항상화 활성이 인정되었으며, 항산화 활성에 미치는 특이성분들이 극성에서 비극성부분까지 고루분포되어 있는 것을 암시해 주었다. Zava 등(14)은 콩에 있어서 isoflavone 에 속하는 genisteine 자성 호르몬인 estradiol과 구조적으로 매우 유사하고 에스트로겐 수용체와 약하게 결합하며 free radical 형성, DNA 상해 그리고 궁극적으로 암 형성을 막는 강력한 항산화 성질과 항암 성질을 가지기 때문에 최근 연구에 많은 주목을 받고 있다고 하였다.
- 이는 콩을 많이 섭취하는 동양인들은 기름진 식사를 주로 하는 서양인들에 비해 유방암, 결장암, 전립선암 등이 훨씬 낮다는 보고와(20, 21) 같은 결과를 나타내었다. 또한 위암세포인 AGS의 경우(Fig. 5)는 시료 농도 1.0 mg/mL에서 핵산 분획물에서 68.7%의 위암세포 성장 억제 효과를 나타내었으나 다른 시료(L0 mg/mL) 모두에서 70%이상의 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었으며, 특히 에틸아세테이트 분획물에서는 다른 시료보다 높은 88.7%의 높은 암세포 성장 억제 활성을 나타내었고 시료 모두에서 농도 의존적으로 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 이에 비해, 발효콩을 주원료로 한 기능성 식품의 각 시료가 정상세포인 293(Fig.
- typhimurium TA98과 TA100을 이용한 Ames test를 행한 결과, 음성대조군의 복귀 돌연변이 집락수는 TA98이 17+4 그리고 TA100은 181+6 이었다. 발효콩을 주원료로 한 기능성 식품 에탄올 추출물과 각 분획물을 50, 100, 150, 200 u g/plate의 여러 농도를 첨가하여 실험한 결과, 집락수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 집락수의 큰 변화를 나타내지 않으므로 발효 콩을 이용한 기능성 식품의 추출물과 각 분획물들은 돌연변이원성을 나타내지 않은 것으로 판단되었다(데이타 생략).
- 발효콩을 주원료로 한 기능성 식품 추출물과 분획물에 대한 항산화 활성을 측정한 결과, 항산화 활성이 극성차이에 의해 많은 차이를 나타내었으며 에탄올, 핵산, 클로로포롬분획물에서 비슷한 경향인 RC50이 150 ug/mL 전후로 나타내었다. 또 극성 분획인 물 분획물인 경우에는 RG50이 513.
- Zava 등(14)은 콩에 있어서 isoflavone 에 속하는 genisteine 자성 호르몬인 estradiol과 구조적으로 매우 유사하고 에스트로겐 수용체와 약하게 결합하며 free radical 형성, DNA 상해 그리고 궁극적으로 암 형성을 막는 강력한 항산화 성질과 항암 성질을 가지기 때문에 최근 연구에 많은 주목을 받고 있다고 하였다. 본 실험에서도 흥미로운 것은 에틸아세테이트 분획물에서 다른 분획물보다 2배 이상의 높은 항산화활성을 나타내었는데 이는 콩에 함유되어 있는 genistein, daidzein이나 콩 발효과정에서 미생물의 작용에 의해 생성된 여러가지 성분 및 기능성 재료들의 생리활성 성분들이 서로 작용하여 상승 효과를 일으킨 것으로 사료된다.
- 돌연변이원성 억제효과를 검토하였다. 실험 결과(Fig. 1) 발효 콩을 이용한 기능성 식품의 에탄올 추출물과 분획물에서 TA100균주에 대하여 MNNG(0.4 ng/plate) 직접변이원에서 농도 의존적으로 억제율이 증가하였으며, 200 ug/plate의 농도를 첨가하였을 때 에탄올 추출물, 핵산, 클로로포롬, 에틸아세테이드, 부탄올 및 물 분획물에서 각각 84.8%, 83.8%, 86.4%, 90.45%, 80.1% 그리고 81.4%로 모두에서 80% 이상의 높은 억제율을 나타내었다.
- 3은 발효 콩을 주원료로 한 기능성 식품의 에탄올 추출물과 분획물이 인간의 폐암세포인 A549에 대한 암세포 성장 억제 효과를 나타낸 결과이다. 에틸아세테이트 분획에서 시료농도 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/mL 첨가시 각각 53.6%, 64.9%, 79.6% 및 84.5%로 다른 시료보다 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었다. 유방암 세포인 MCF-7에서는(Fig.
- 발표된 바 있다(15, 16). 이상의 결과는 된장의 AFBi에 대한 항돌연변이 효과와 된장국의 메탄올 추출물이 AFBi에 대한 돌연변이 유발을 크게 억제하였다는 연구결과(17, 18)와 유사한 경향으로서 여러 실험들에서 genistein이 돌연변이 억제 및 항암 효과가 있음을 알 수 있는데(19) genisteine 콩 및 콩 발효식품에 풍부하게 존재하므로 부작용이 없고 유전적 독성을 억제하며 적은 비용 및 구강섭취가 가능하고 활동기작이 알려진 화학적 예방제로서 콩 음식을 통한 genistein 섭취는 돌연변이 유발을 억제하고 발암성을 예방하는 좋은 수단이 될 것으로 사료된다. 특히 본 연구실에서 제조한 기능성 식품은 발효 콩에 여러가지 기능성 소재를 첨가하여 그 생리활성이 향상되어 향후 생리활성이 높은 이들 분획물에 대한 구체적인 생리활성 연구를 진행하고 있다.
- 7%의 높은 암세포 성장 억제 활성을 나타내었고 시료 모두에서 농도 의존적으로 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 이에 비해, 발효콩을 주원료로 한 기능성 식품의 각 시료가 정상세포인 293(Fig. 6)에 대해서는 시료 모두에서 30% 이하의 낮은 성장 억제 효과를 나타내어 암세포에 대하여서는 높은 억제활성을 나타낸 반면, 정성세포에 대하여서는 비교적 낮은 억제활성을 나타낸다는 사실을 알 수가 있었다. Choi 등(22)은 순창 재래식 된장의 에틸아세테이드, 핵산 분획물과 메탄올 추출물에서 대부분 75% 이상의 암세포 억제효과를 나타냈다고 보고하였다.
후속연구
- 5%를 차지하고 있어 콩과 발효콩에서 유래된 isoflavone과 여러가지 기능성 소재들에서의 생리활성 성분이 상승작용을 통해 항암효과를 나타낸 것으로 생각된다. 본 실험결과는 기초적인 생리활성데이터를 제시하였으며, 추후 in vitro 와 in vivo상에서 보다 많은 실험을 수행한다면 기능성 식품으로서의 개발 가능성을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
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