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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 간장에서 chitinase 활성이 높으면서 갈변반응을 유발하는 균주를 분리하여 생화학적 특성을 조사하였으며. 또한 이러한 갈변반응 생성물이 bacterial lipo- polysaccharides(LPS)에 의하여 유도된 NO 활성에 미치는 영향을 연구함으로서 면역기능, 세포활성 및 항산화력에 대한 갈변 반응 효능을 연구하였다.
- 또한 이러한 갈변반응 생성물이 bacterial lipo- polysaccharides(LPS)에 의하여 유도된 NO 활성에 미치는 영향을 연구함으로서 면역기능, 세포활성 및 항산화력에 대한 갈변 반응 효능을 연구하였다.
제안 방법
- Bacillus 속 균종의 분류가 가능한 부위 2곳을 대장균 염 기서 열 기준 forward primer로 5'CAGnTGATCCTGGTCA- 3'(대장균 기준 9~27 bp), reverse primer로 5'-AGGAAAG- GAGGTGATCCAGCC-3'(대장균 기준 1542-1525 bp)를 사용하여 16S rDNA 절편을 증폭하였다. PCR 반응은 5U의 Taq polymerase, 10 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH8.
- Bacterial lipopolysaccharise (LPS)를 대식세포에 처리하여 NO를 유도시킨 다음 갈변반응을 일으킨 B. atrophaeus CJ-3 배양얙을 대식세포에 처리하여 NO 활성에 미치는 영향을 조사하였다. Fig.
- CJ-3 균주의 동정은 일차적으로 MIS system에 의하여 분석한 후 16S rDNA 염기서열을 결정하여 분석하였다(Fig. 2). 분리된 CJ-3 균주는 Bacillus subfilis 와 유사한 B.
- Chitinase 생산에 첨가된 colloidal chitin의 농도가 chitinase 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 효소생산 기본배지(0.5% yeast extract, 0.5% peptone, 0.2% beef extract,0.1% K2HPO4, 0-1% KH2PO4, 0.05% MgSO4 . 7HQ)에 colloidal chitin을 0.5, 1.0, 2.0%를 첨가하여 37℃, 200 rpmz 48 시간동안 진탕 배양한 다음 chitinase 활성을 측정하였다. Fig.
- Plate에 MTT 2 mg/ml 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)- 2, 5-diphenyl -tetrazolium bromide IMTT, Sigma) 용액을 20 ill 씩 첨가하여 4시간 동안 배 양 시키고 formazan을 형성시키 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO (dimethyl sulfoxide) 150 μ1를 첨가하여 for- mazan을 녹인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다, 추출물의 농도는 10, 20, 50, 100, 200 Rl/well로 하였다.
- 16S rDNA 절편을 증폭하였다. PCR 반응은 5U의 Taq polymerase, 10 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH8.3), 1.5 mM MgCL를 포함하는 PCR 혼합물을 이용하였다. PCR 은 first denature 95 ℃ 로 5분, 30 cycle 로 denaturation 95 ℃ 60초, annealing 55℃ 45초, extension 72℃ 5분으로 수행하였다 (Model 9600 thermocycler, PE Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom).
- Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 응el electrophoresis (SDS-PAGE)은 Laemmli방법 [25]에 따라 수행되었다. Stacking 겔과 running 겔의 acrylamide 농도는 12%와 3%을 각각 사용하였다. 단백질은 0.
- 간장, 된장 등 발효식품으로부터 채취한 시료에서 분리된 균주를 colloidal chitin이 함유된 분리용 배지에 도말하여 clear zone 생성한 균주를 1차로 30여 균주를 분리하였다. 그중에서 chitinase 활성이 높으면서 갈변반응을 일으키는 3번 균주를 2차로 선별하여 하여 CJ-3이라 명명하였다.
- 간장, 된장 등 전통발효식품으로부터 분리된 B. atrophaeus CJ-3 균주를 DPPH 법에 따라 균주를 배양한 직후 항산화력을 측정하고 냉장보관 동안 갈변반응이 일어난 후의 항산화력을 측정하여 비교하였다. Fig.
- 균주의 최적 생육조건을 조사하기 위하여 배양온도, pH 및 염 농도에 대한 균주의 성장률을 420 nm에서 spectro- photometer로 측정하였다.
- 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 5xl05cells/ml 의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 NO를 Griess 시 약과 반응시켜 측정하였다[26]. 100 R1의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약[1% sulfanilamide (30% acetic acid) 와 0.
- 분리된 균주로부터 chromosomal DNA 분리는 G-spin™ genomic DNA extraction kit (iNtRON Biotechrmol.)를 사용하여 분리하였으며 분리 된 genomic DNA는 16S rDNA clon- ing을 위한 template로 사용하였다.
- Filter는 70% (v/v) 에탄올 10 ml 를 첨가하여 20분 동안 실온에서 shaking한 후 원심분리 한다. 상등액을 60℃ water bath에서 증발 건조시 킨 후 0.2 M sodium citrate 용액에 녹인 후 Amino acid autoanalyzer (Biochrom 20 plus)로 분석하였다.
- 생리식염수에 적당히 희석한 시료를 분리용 고체배지(LB medium+1% colloidal chintin)에 plating한 후 37℃ 에서 2~3일간 배양한 다음 colloidal chitin을 분해 하여 clear zone을 형 성 하는 col- ony를 순수 분리하였다. 1차 순수 분리된 colony중에서 갈변 반응을 일으키는 균주를 선별하여 chitinase 활성 및 항산화력 측정을 위한 균주로 사용하였다.
- 세포활성은 MTT 분석을 통해서 측정하였다. LPS로 처리된 대식세포는 약 50%정도의 세포감소를 보였는데 갈변 반응을 일으킨 B.
- 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA (%) = (대 조구흡광도-시료 첨 가구흡광도)/ 대 조구흡광도 X100 으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도 차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.
- 6% agarose gel에 전기영동한 후 DNA 단편을 회수하여 pGEM- T easy vector (Promega 사)에 cloning하여 DNA 염기서열 분석에 사용하였다. 염기서 열분석은 자동염기서 열 분석장치 Applied Biosystems 373A (PE Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. 결정된 16SrDNA의 염기서열은 Genebank 의 Blast program을 이용하여 이미 Genebank에 등록된 16S rDNA 염기서열과의 상동성을 비교하여 균주를 동정하였다 [19, 2이.
- Blois 의 방법 [22]에 따라 DPPH 용액 4 ml 균 배 양액 1 ml 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA (%) = (대 조구흡광도-시료 첨 가구흡광도)/ 대 조구흡광도 X100 으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도 차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.
- 전통발효 식품인 간장으로부터 chitinase 활성이 높으면서 갈변 반응을 일으키는 균주인 CJ-3를 분리하여 갈변 반응생성물이 면역기능, 항산화력 및 세포활성에 미치는 영향과 생화학적 특성을 규명하였다. 분리된 CJ-3 균주는 16S rDNA 염기서열분석에 의하여 Bacillus atrophaeus로 동정되었으며 분리된 균주의 분자량은 대략 31.
- PCR 은 first denature 95 ℃ 로 5분, 30 cycle 로 denaturation 95 ℃ 60초, annealing 55℃ 45초, extension 72℃ 5분으로 수행하였다 (Model 9600 thermocycler, PE Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom). 증폭된 PCR 산물은 0.6% agarose gel에 전기영동한 후 DNA 단편을 회수하여 pGEM- T easy vector (Promega 사)에 cloning하여 DNA 염기서열 분석에 사용하였다. 염기서 열분석은 자동염기서 열 분석장치 Applied Biosystems 373A (PE Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 생리식염수에 적당히 희석한 시료를 분리용 고체배지(LB medium+1% colloidal chintin)에 plating한 후 37℃ 에서 2~3일간 배양한 다음 colloidal chitin을 분해 하여 clear zone을 형 성 하는 col- ony를 순수 분리하였다. 1차 순수 분리된 colony중에서 갈변 반응을 일으키는 균주를 선별하여 chitinase 활성 및 항산화력 측정을 위한 균주로 사용하였다. Colloidal chitine Rob- erts와 Selitrennikoff의 방법[18]에 따라 조제하였다.
- The tree was created using the MEGALIGN program. The analysis was performed based on the 16S rDNA sequence.
- 전통발효식품으로부터 chitinase를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 간장과 된장을 시료로 사용하였다. 생리식염수에 적당히 희석한 시료를 분리용 고체배지(LB medium+1% colloidal chintin)에 plating한 후 37℃ 에서 2~3일간 배양한 다음 colloidal chitin을 분해 하여 clear zone을 형 성 하는 col- ony를 순수 분리하였다.
- 2% Coomassie brilliant blue R-250로 염색되었다. 표준단백질은 (NEB #P7702) MBP- P-galactosidase (175 kDa), MBP-paramyosin (83 kDa), Glutamic dehydrogenase (62 kDa), Aldolase (47.5 kDa), Triosephophate isomerase (32.5 kDa), p-Lactoglobulin A (25 kDa)z Lysozyme (16.5 kDa)z Aprotinin (6.5 kDa)을 사용하였다.
이론/모형
- 2에 여과시켜 만들었다. Blois 의 방법 [22]에 따라 DPPH 용액 4 ml 균 배 양액 1 ml 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA (%) = (대 조구흡광도-시료 첨 가구흡광도)/ 대 조구흡광도 X100 으로 계산하였다.
- NO release was measured using the method of Griess (nitrite). Cell viability was determined by MTT assay. Results are expressed as means ±S.
- 1차 순수 분리된 colony중에서 갈변 반응을 일으키는 균주를 선별하여 chitinase 활성 및 항산화력 측정을 위한 균주로 사용하였다. Colloidal chitine Rob- erts와 Selitrennikoff의 방법[18]에 따라 조제하였다.
- 7 cells were cultured for 24 h with various concentration of browning reaction product in the presence of LPS (lug/ml). NO release was measured using the method of Griess (nitrite). Cell viability was determined by MTT assay.
- NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 5xl05cells/ml 의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 NO를 Griess 시 약과 반응시켜 측정하였다[26].
- 반응액은 vortex 후 단백질 전기영동을 위한 시료로 사용하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 응el electrophoresis (SDS-PAGE)은 Laemmli방법 [25]에 따라 수행되었다. Stacking 겔과 running 겔의 acrylamide 농도는 12%와 3%을 각각 사용하였다.
- Effect of browning reaction on the antioxidative activity of Bacillus atrophaeus CJ-3. The antioxidative activities before [A] and after [B] of the browning reaction were tested by DPPH method.
- 균주의 단백질 분석은 Noel and Brill [24]의 방법에 따라 LB 배지에 colloidal chitin을 각각 0.5%, 1.0%. 20% 첨가한 후 균을 접종하여 37℃ 에서 24시간 배양한 후 microcentrifuge tube로 원심분리 하여 세포를 회수하였다.
- 효소 1 unit는 1시간 동안 1J1M의 N-acetyl-D-glucosamine을 생산하는 효소의 양으로 정하였다. 단백질 정량은 Bradford의 방법[21]에 따라 측정하였으며, 이때 표준단백질로 bovine serum albumin 을 사용하였으며 595 nm에서 홉광도를 측정하였다.
- 세포활성은 MTT assay에 의하여 측정하였다[26]. 96-well .
- 유리아미노산의 분석은 Csonka [23]의 방법에 따라 균주를 LB medium (10 ml)에 하루 동안 배양한 후 membrane filter (0.45 Jim)로 여과한다. Filter는 70% (v/v) 에탄올 10 ml 를 첨가하여 20분 동안 실온에서 shaking한 후 원심분리 한다.
- 반응이 끝난 다음 5분간 boiling하여 반응을 정시시킨 후남아있는 colloidal chitin을 제거하기 위하여 원심분리(12, 000 rpm, 10 min)를 하였다. 효소의 활성은 DNS (dinitrosalicylic acid)법으로 유리된 환원당을 정량하였다. 효소 1 unit는 1시간 동안 1J1M의 N-acetyl-D-glucosamine을 생산하는 효소의 양으로 정하였다.
성능/효과
- MTT 분석을 통한 세포 활성에서도 갈변 반응물은 LPS에 의하여 세포활성을 정상수준으로 회복하였다. B. atrophaeus CJ-3 균주의 DPPH 전자공여능법에 의한 항산화력은 갈변반응에 의하여 약 55% 증가하였다 .이러한 결과들은 갈변반응생성물은 면역기능 및 세포활성을 증가시키는 것으로 추정된다.
- 세포활성은 MTT 분석을 통해서 측정하였다. LPS로 처리된 대식세포는 약 50%정도의 세포감소를 보였는데 갈변 반응을 일으킨 B. atrophaeus CJ-3 배양액을 첨가하면 정상 수준으로 회복되는 것이 관찰되었다(Fig. 7B).
- 3A에 나타난바와 같이 25 -40℃ 범위에서 잘 성장하였으며 37℃에서 최적온도를 나타내었다. pH 에 대한 균주의 생육은 Fig. 3B에 나타난바와 같이 pH 4.0~pH 10까지의 생육을 조사하였는데 pH 중성(pH 7.0~pH 8.0) 부근에서 최적 생육 조건을 나타내었다. 대부분의 전통발효식품은 염 농도가 높은 조건에서 잘 생육하는데 분리된 균주의 염에 대한 생육 조사는 Fig.
- 특성을 규명하였다. 분리된 CJ-3 균주는 16S rDNA 염기서열분석에 의하여 Bacillus atrophaeus로 동정되었으며 분리된 균주의 분자량은 대략 31.0 kDa으로 colloidal chitin (0.5, 1.0, 2.0%)의 첨가에 의하여 chitinase 활성이 현저히 증가되었다. B.
- 2). 분리된 CJ-3 균주는 Bacillus subfilis 와 유사한 B. atro- phaeus로 동정되었다. CJ-3 균주는 MIS system에 의한 분석에서는 B.
- 분리된 균주의 단백질 patterne Fig. 6에 나타난바와 같이 게]지에 colloidal 산litin을 첨가함으로서 chitinase 효소 생성량이 현저히 증가하는 것을 알 수 있었다. 그에 비해서 protease 활성과 약한 chitinase 활성을 가진 KJ-3의 경우는 colloidal chitin의 존재에 의해서 CJ-3나 SC-3의 경우와 달리 그렇게 유도되지 않았다.
- 분리된 균주의 생육에 대한 온도의 영향을 조사한 결과는 Fig. 3A에 나타난바와 같이 25 -40℃ 범위에서 잘 성장하였으며 37℃에서 최적온도를 나타내었다. pH 에 대한 균주의 생육은 Fig.
- 이러한 결과들은 갈변반응생성물은 면역기능 및 세포활성을 증가시키는 것으로 추정된다. 분리된 균주의 최적 생육 조건은 최적 온도 37℃, 최적 pH 7.0 및 염 농도는 9% NaCl 농도까지는 잘 생육하는 것으로 나타났으며 분리된 균주의 주요 intracellular 유리아미노산은 glutamate로 나타났다.
- 유리아미노산의 분석은 Table 1에 나타난바와 같이 B. atrophaeus CJ-3의 주요 intracellular 유리 아미노산은 glutamate 18.3% 가장 많이 함유하였으며 histidine 12.9%, tyrosine 10.8% 및 proline 8.5%로 존재하였다. Glutamate는 나트륨과 결합하여 글루타민산나트륨(MSG)을 형성함으로서 조미료의 주요성분으로 이용되고 있다.
- 4에 나타난바와 같이 colloidal chitin의 농도가 증가함에 따라 가Mtinase 활성이 증가하였다. 이러한 결과는 Streptomyces lydicus [2기와 유사한 결과로 의 경위28] 0.15%에서 최적 활성을 나타난 것과는 달리 상당히 높은 2%의 colloidal 간dtin 농도에서도 높은 활성을 유지하였다.
- 그에 비해서 protease 활성과 약한 chitinase 활성을 가진 KJ-3의 경우는 colloidal chitin의 존재에 의해서 CJ-3나 SC-3의 경우와 달리 그렇게 유도되지 않았다. 일반적으로 colloidal chtin의 농도가 증가하면 chitinase 활성이 증가하는 경향을 보이고 있는데 본 연구의 결과에서도 colloidal chitin의 첨가에 의하여 산dtkiase 활성이 현저히 증가하는 것으로 나타났다. SDS- PAGE를 이용하여 표준단백질로부터 구한 B.
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