미성숙 돼지 난자의 유리화 동결에 관한 연구: Open Pulled Straw(OPS), Electron Microscopic Grid(EMG) 및 Nylon Loop System(NLS)의 비교 Study of Vitrification of Immatured Pig Oocytes: Compared with Open Pulled Straw(OPS), Electron Microscopic Grid(EMG) and Nylon Loop System(NLS)원문보기
This study evaluated the efficiency and compared with different materials of loading vessels for vitrification-plastic/glass, copper grid and nylon. The loading method, vitrification, cryop-reservation and warming method of the oocytes were examined. The loading samples prepared in manual or company...
This study evaluated the efficiency and compared with different materials of loading vessels for vitrification-plastic/glass, copper grid and nylon. The loading method, vitrification, cryop-reservation and warming method of the oocytes were examined. The loading samples prepared in manual or company-made and sterilized, loaded the COCs selected on each samples and cultured for maturation during 40 hours, and then exposed sequentially to ethylene glycol solution. Thawing method was reversely treated and exposed for warmed oocytes. After oocytes were thawed, fertilized and cultured in vitro for 3-4 hours, rates of development and morphological appearance were examined. The results were as summarized: ㆍOPS from company-made or hand-made of the hematocrit micropipettes, NLS from fishing line and EMG from company-made for EM were used for loading oocytes, respectively. ㆍThe efficiency of freezing method and loading convenience were orderly higher in OPS, NLS and EMG. The optimal capacity per vessel was orderly lowered in NLS, EMG and OPS, respectively. ㆍAfter oocytes were warmed, the recovery rate, morphology and rate of development were orderly higher in OPS, NLS and EMG, respectively. ㆍIn conclusion, OPS has the advantages of achieving a little more survival and preserving results than other two loading methods.
This study evaluated the efficiency and compared with different materials of loading vessels for vitrification-plastic/glass, copper grid and nylon. The loading method, vitrification, cryop-reservation and warming method of the oocytes were examined. The loading samples prepared in manual or company-made and sterilized, loaded the COCs selected on each samples and cultured for maturation during 40 hours, and then exposed sequentially to ethylene glycol solution. Thawing method was reversely treated and exposed for warmed oocytes. After oocytes were thawed, fertilized and cultured in vitro for 3-4 hours, rates of development and morphological appearance were examined. The results were as summarized: ㆍOPS from company-made or hand-made of the hematocrit micropipettes, NLS from fishing line and EMG from company-made for EM were used for loading oocytes, respectively. ㆍThe efficiency of freezing method and loading convenience were orderly higher in OPS, NLS and EMG. The optimal capacity per vessel was orderly lowered in NLS, EMG and OPS, respectively. ㆍAfter oocytes were warmed, the recovery rate, morphology and rate of development were orderly higher in OPS, NLS and EMG, respectively. ㆍIn conclusion, OPS has the advantages of achieving a little more survival and preserving results than other two loading methods.
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문제 정의
동결보존은 세포의 기능과 유전적 요인을 변화 없이 반영구적으로 보존하는데 그 목적을 두고 있다. 1990년대 이후 수정란의 동결보존을 위한 여러 가지 새로운 방법들이 발표되어졌는데 그 사이 유리화 동결법이 개발되면서 동결보존이 보편화 되어졌다.
따라서 본 연구는 돼지의 난자를 OPS, EMG 그리 고 NLS 방법으로 각각 동결-융해하여 난자의 생존성을 규명하고 나아가서 이, 세 가지 방법들을 비교 조사함으로써 가장 우수한 방법을 검토하고자 수행되었다.
본 연구는 돼지 난 자의 유리화 동결/융해시 동결 재료인 plastic/glass, copper grid, nylon 이들 각3가지에 대한 제작 방법, 난자loading법, 동결 처리법, 보관방법 그리고 융해 방법 등을 비교 조사하여 가장 우수하고 편리한 방법을 선택하기 위해 수행되었다. 수행 내용은 3가지의 재료의 sample 을 제작하고 소독한 다음 준비된 돼지 COCs를 40시간 동안 체외성숙시킨 후 난자를 선별하여 준 비된 동결용액에 평형 처리하였다.
본 연구에서는 이와 같은 연구결과들을 토대로 아직은 시도되지 않은 돼지의 미성숙 난자를 3가지 방법으로 동결-융해하여 그 방법들의 편리성과 단순성 그리고 우수성을 검토하였다. OPS는 그 단순성과 편리성에 있어 다론 두 방법에 비해 비교적으로 유용함을 보여준 반면 난자 수용 능력에 있어서는 다른 방법들과 비교해 낮게 나타났다.
제안 방법
OPS용으로는 OPS straw (Minitub Co., Germany) 또는 hematocrit micropipette을 이용하여 가늘고 길게 뽑아 제작하였고, EMG는 300-400 mesh EM cooper grid (Ted Fella Co., USA)를 사용하였으며 NLS는 시중의 nylon 낚시 줄을 cryo-bottle에 특수 제작하여 이용하였다.(Fig.
Louis, Mo, USA)처리를 한 후에 13, 000 rpm에서13분 동안 원심분리하였다. 그리고 각 처리를 한 난포란의 유리화 동결은 DPBS +10% FBS 용액 (vitrification solution 1 : VS 1)에 1분간 2회 반복 처리하고 2 M EG 용액(VS 2)에 5분간 침 지 후 다시 7% PVP 용액(VS 3)에 1분간 침지하여 각 OPS, EMG 그리고 NLS loading vessel에 난포란을 올려놓고 LN2에 담겨진 비이커에 즉시 침지함으로서 유리화 동결을 완료하였다.
동결 융해 후난자의 회수율과 COCs의 형태학적 생존성 그리고 배발달률은 Cummulus cell의 탈락 정도, 난자의 ICM 형태의 변화와 색깔 변화를 중심으로 판정하였다. 배발달률은 냉동 정액으로 체외수정한 후 NCSU 23배지에서 3~4일 배양하여 분열세포 초기까지 관찰하였다.
돼지 미성숙 난포난자를 100개씩 OPS, EMG 그리고 NLS 방법으로 동결-융해함에 있어서의 편의성, 단순성을 검토하기 위하여 각 방법들의 최적 난자 수용 능력과 동결 시의 loading 시간 그리고, 융해시의 shedding 시간을 비교하였다. Table 2에서 나타난 바와 같이 최적 난자 수용 능력은 NLS, EMG, OPS순으로 나타났으며, 동결 시의 loading 시간은 OPS, NLS, EMG 순으로 빠르게 나타났고, 융해시 shedding 시간은 큰 차이는 없었으나 NLS, OPS, EMG 순으로, 특히 EMG는 동결-융해 시 비교적 오랜 시간이 소요됨을 보여주었다.
따라서 본 연구는 위와 같은 연구들을 기초로 하여 난자내 지방구에 대한 보완으로서 난자에 Cytochalasin B를 동결전 처리하였으며 이를 다시 원심분리하여 실험을 수행하였다. 이처럼 지방구가 돼지 난 포란에 있어서 저온 민감성의 중요한 원인이 되므로 앞으로도 많은 연구들이 보고될 것으로 사료되어진다.
또한 각 loading vessel에 동결 처리한 난자를 융해한 후의 난자 회수율과 회수 후세포의 COCs의 형태, 형태학적 생존성 그리고 그 발달률을 비교 관찰하였다. Table 3에서 난자의 회수율은 NLS가 100%로 가장 높게 나타났으며 OPS(98%)와 EMG (95%)는 큰 차이가 없었다.
동결 융해 후난자의 회수율과 COCs의 형태학적 생존성 그리고 배발달률은 Cummulus cell의 탈락 정도, 난자의 ICM 형태의 변화와 색깔 변화를 중심으로 판정하였다. 배발달률은 냉동 정액으로 체외수정한 후 NCSU 23배지에서 3~4일 배양하여 분열세포 초기까지 관찰하였다.
체란된 난자는 형태학적으로 균일하고 세포질이 정상인 것만을 선택하여 체외성숙에 이용하였다. 성숙배양액은 TCM-199(Sigma-Aldrich Co.)에 pyrubic acid(Sigma chemical. Co., St Louis, Mo, USA), gentamysin (Sigma chemical. Co., St Louis, Mo, USA), L-cystein(SigmaAldrich Co., St. Louis, Mo, USA), P-estradiol(Sigma chemical. Co., St Louis, Mo, USA), FSH 그리고 pFF(pocine follicular fluid)을 첨가하였고, 39℃, 5% CO2 배양기에서 40시간 동안 성숙배양을 실시하였다.
본 연구는 돼지 난 자의 유리화 동결/융해시 동결 재료인 plastic/glass, copper grid, nylon 이들 각3가지에 대한 제작 방법, 난자loading법, 동결 처리법, 보관방법 그리고 융해 방법 등을 비교 조사하여 가장 우수하고 편리한 방법을 선택하기 위해 수행되었다. 수행 내용은 3가지의 재료의 sample 을 제작하고 소독한 다음 준비된 돼지 COCs를 40시간 동안 체외성숙시킨 후 난자를 선별하여 준 비된 동결용액에 평형 처리하였다.
유리화 동결된 난포란들은 LN2에서 최소 2주 이상 보관하였으며, 융해는 LN2로부터 2 M EG 융해액에 각난포란을 2분간 침지시키고 다시 0.5 M EG 융해액에 2분간 침 지 후 DPBS +10% FBS 용 액에 2.5분씩 2회 반복 처리하여 역순으로 평행한 다음 신선한 배양액으로 3~4회 세척을 실시하였다. 이를 maturation 배지에서 3~4시간 배양한 다음 그 각각의 생존을을 비교, 관찰하였다.
5분씩 2회 반복 처리하여 역순으로 평행한 다음 신선한 배양액으로 3~4회 세척을 실시하였다. 이를 maturation 배지에서 3~4시간 배양한 다음 그 각각의 생존을을 비교, 관찰하였다.
동결보존 후난자의 생존율에 영향을 미치는 요인으로는 동결-융해과청 중 사용되는 동해 방지 제 종류, 농도 및 처리 시간과 동결 방법 등이 있다. 기존에는 독성이 강한 침투성 동해방지제로서 DMSO, glycerol 그리고 1, 2-PROH를 사용하였다. 그러나 최근에는 Marino 등(1996)이 소성숙난자 에 ethylene glycol을 사용한 이후 ethylene glycol사용의 빈도가 높아졌다.
이론/모형
각 동결액과 융해액은 Table 1에서 나타낸 바와 같이 Beebe's method에 준하여 처리하였다.
성능/효과
, 난자를 융해한 후난자 회수율, 회수 후세포형태 그리고 발달률은 OPS, NLS, EMG 순으로 높았다.
.동결 방법과 loading의 편의성은 OPS, NLS, EMG 순으로 나타났으며 액체질소 내 동결 보관의 수용성은 NLS, EMG, OPS 순으로 많은 난자를 loading할 수 있었다.
Table 3에서 난자의 회수율은 NLS가 100%로 가장 높게 나타났으며 OPS(98%)와 EMG (95%)는 큰 차이가 없었다. COCs의 형태는 OPS (80%), NLS(71%), EMG(56%) 순으로 나타났으며 특히 OPS 와 EMG에서 다소 큰 차이를 보였다. 형태학적 생존율은 OPS가 48%로 가장 높게 나타났으며 EMG와 NLS는 비교적 유사하게 나탔났다.
본 연구에서는 이와 같은 연구결과들을 토대로 아직은 시도되지 않은 돼지의 미성숙 난자를 3가지 방법으로 동결-융해하여 그 방법들의 편리성과 단순성 그리고 우수성을 검토하였다. OPS는 그 단순성과 편리성에 있어 다론 두 방법에 비해 비교적으로 유용함을 보여준 반면 난자 수용 능력에 있어서는 다른 방법들과 비교해 낮게 나타났다. 특히 EMG는 동결-융해에 있어 많은 시간이 소요되었는데 이는 그만큼의 시간 동안 난자가 동해 방지 제 독성에 노출됨으로 인해 생존율과 발달률이 낮아진 것이 아닌가 생각된다.
돼지 미성숙 난포난자를 100개씩 OPS, EMG 그리고 NLS 방법으로 동결-융해함에 있어서의 편의성, 단순성을 검토하기 위하여 각 방법들의 최적 난자 수용 능력과 동결 시의 loading 시간 그리고, 융해시의 shedding 시간을 비교하였다. Table 2에서 나타난 바와 같이 최적 난자 수용 능력은 NLS, EMG, OPS순으로 나타났으며, 동결 시의 loading 시간은 OPS, NLS, EMG 순으로 빠르게 나타났고, 융해시 shedding 시간은 큰 차이는 없었으나 NLS, OPS, EMG 순으로, 특히 EMG는 동결-융해 시 비교적 오랜 시간이 소요됨을 보여주었다. 그리고 이들의 방법으로 loading 되어진 난자의 형태와 공간은 Fig.
특히 EMG는 동결-융해에 있어 많은 시간이 소요되었는데 이는 그만큼의 시간 동안 난자가 동해 방지 제 독성에 노출됨으로 인해 생존율과 발달률이 낮아진 것이 아닌가 생각된다. 각 방법에 따른 동결-융해시의 난자 회수율, COCs의 형태, 형태학적 생존성 그리고 발달률에 의해 평가되어졌는데 OPS, NLS, EMG 순으로 그 성척이 전반적으로 우수하였고, 발달률에 있어서는 QPS가 8%, NLS가 6%로 나타났으며 EMG는 0%로그 발달이 전혀 관찰되지 않았다. 본 연구에 있어 동결-융해 후난자의 발달률은 그 기대에 미치지 못하였으나, 연구 결과에 따라 단순성과 편리성이 우수한 OPS가 유리화 동결에 있어서의 몇 가지 기술적인 문제들만 해결이 된다면 매우 효과적인 동결법으로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
형태학적 생존율은 OPS가 48%로 가장 높게 나타났으며 EMG와 NLS는 비교적 유사하게 나탔났다. 난자의 동결-융해 후의 배발달률은 OPS가 8%, NLS가 6%로 나타났으며 EMG는 0%로 매우 낮게 나타났다. Fig.
COCs의 형태는 OPS (80%), NLS(71%), EMG(56%) 순으로 나타났으며 특히 OPS 와 EMG에서 다소 큰 차이를 보였다. 형태학적 생존율은 OPS가 48%로 가장 높게 나타났으며 EMG와 NLS는 비교적 유사하게 나탔났다. 난자의 동결-융해 후의 배발달률은 OPS가 8%, NLS가 6%로 나타났으며 EMG는 0%로 매우 낮게 나타났다.
후속연구
국내에서는 돼지에 난포란에 있어서 지방구의 제거가 동결에 있어 확실한 성공률이 보장된다고 보고되었지만 (Choi 등, 2003)이는 전문적인 기술과 고가의 장비를 필요로 하므로 그 광범위한 이용이 어려운 실정이다. 그러므로 앞으로는 좀 더 단순하고 편리한 기술과 저가의 장비로도 수행이 가능한 연구가 요구되어진다.
각 방법에 따른 동결-융해시의 난자 회수율, COCs의 형태, 형태학적 생존성 그리고 발달률에 의해 평가되어졌는데 OPS, NLS, EMG 순으로 그 성척이 전반적으로 우수하였고, 발달률에 있어서는 QPS가 8%, NLS가 6%로 나타났으며 EMG는 0%로그 발달이 전혀 관찰되지 않았다. 본 연구에 있어 동결-융해 후난자의 발달률은 그 기대에 미치지 못하였으나, 연구 결과에 따라 단순성과 편리성이 우수한 OPS가 유리화 동결에 있어서의 몇 가지 기술적인 문제들만 해결이 된다면 매우 효과적인 동결법으로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
참고문헌 (26)
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