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문제 정의
- 차이점이 나타날 수 있다고 하였다. 본 연구에서는 CB 처리와는 상관없이 3가지 처리군(SA 방법, SA 방법과 CB 처리군 그리고 DA 방법과 CB 처리군)에서 위의 결과와 유사한 결과를 나타내었다. 그러나, Yin 등(2003)은 체세포를 이용한 복제 수정란의 생산에 있어서 핵이식 수정란의 전기융합 시 SA 방법과 DA 방법을 비교하였을 때 배반포기배로의 발달율은 SA 방법에서 3.
제안 방법
- 배양하였다. 계대배양은 공여세포가 flask에 80% 이상 자랐을 때, 0.05% trypsin과 EDTA를 처리하여 부유시킨 다음 1/3~1/4씩 나누어 10회 이상 계대해서 배양을 실시하였다. 계대배양한 공여 세포는 10% DMSO가 첨가된 DMEM 배양액으로 동결 보존해 두고, 핵이식에 사용할 때는 38~39 ℃ 온수에 융해하여 동결보호제를 제거한 다음 신선한 DMEM에 10% FBS 가 첨가된 배양액으로 1 회 계대배양한 후 세포가 culture dish에 monolayer 를 충분히 형성하여 confluency 상태로 2~3일 정도 배양함으로써 G0나 G1 단계로 유도한 다음 공여 세포로 사용하였다.
- 05% trypsin과 EDTA를 처리하여 부유시킨 다음 1/3~1/4씩 나누어 10회 이상 계대해서 배양을 실시하였다. 계대배양한 공여 세포는 10% DMSO가 첨가된 DMEM 배양액으로 동결 보존해 두고, 핵이식에 사용할 때는 38~39 ℃ 온수에 융해하여 동결보호제를 제거한 다음 신선한 DMEM에 10% FBS 가 첨가된 배양액으로 1 회 계대배양한 후 세포가 culture dish에 monolayer 를 충분히 형성하여 confluency 상태로 2~3일 정도 배양함으로써 G0나 G1 단계로 유도한 다음 공여 세포로 사용하였다.
- 할 것이다. 따라서 본 연구에서는 체세포를 이용한 돼지 복제수정란의 생산효율을 높이는 최적의 방법을 구명코자 핵이식 수정란에 각기 다른 조건들의 전기적 자극에 의한 융합과 활성화를 유도하여 융합율, 분할율, 후기배로의 발달율 및 배반포기배의 할구수를 비교 . 조사하였다.
- 운반하였다. 미성숙 난포란을 채란하기 전 난소주위의 지방과 결합조직을 제거하고, 생리식염수로 3~4희 세척한 후, 18-G needleO] 부착된 20 ml 주사기를 이용하여 2~7 mm의 가시 난포를 흡입하여 난포란을 채란하였다. 난포란의 채취시사용된 배양액은 0.
- 본 실험에 사용된 공여세포는 임신 30~35일령 된 돼지 태아에서 분리, 이용하였다 제왕절개로 채취한 태아의 조직을 미세하게 세절하여 0.05%trypsin (Gibco, USA) 과 EDTA (Sigma, USA) 가 첨가된 D-PBS로 3분간 처리한 후 D-PBS로 원심분리를 실시하여 trypsin과 EDTA를 제거하였다.
- 분리된 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM으로25 erf flask (Falcon, USA)에 분주하여 CO2 incu-bator에서 배양을 실시하였으며, 배양 12시간 후 바닥에 붙지 않은 세포는 제거하고, 신선한 DMEM 에 10% FBS가 첨가된 배양액으로 교체하면서 3- 5일간 배양하였다. 계대배양은 공여세포가 flask에 80% 이상 자랐을 때, 0.
- 4% BSA가 첨가된 체외배양액 NCSU 23에 3~4회 세척한 후20~30개씩 50M drop에 넣어 390, 5% CO2 in-cubator에서 배양하였다. 융합 후 48시간에 복제수정 란의 분할율을 조사하였으며, 144~168시 간까지 배반포기 상태의 배발달율을 조사하였다.
- 28 M Mannitol (Sigma, USA) 용액에 2~3분간 평형을 실시한 다음, 전기 융합용 chamber로 옮겨 실시하였다. 전기융합은 처리구에 따라 H0-150 V/mm의 강도로 50 [isec, 2 pulse를 주었으며, 전기융합 후 활성화를 따로 실시할 경우에는 100 V/mm, 20 usee, 2 pulses를 주어 활성화를 유도하였다. 핵이식 수정란의 일부는 융합과 활성화를 유도한 다음 cytochalasin B (CB)에 4시간 처리 후 체외배양을 실시하였다.
- 외경이 20-30 µm로 조절하였다. 체외성숙 난자를 0.1% hyaluronidase (Sigma, USA)가 첨가된 D-PBS에 넣어 2~3분간 vortexing하여 난구 세포를 완전히 제거하고, 3~4회 PVA-TALP-HEPES로 세척한 다음, 0.05 M sucrose (Sigma, USA) 및 0.4%BSA가 첨가된 배양액에서 세포질이 균질하고 제1 극체가 뚜렷하게 보이는 난자만을 선별하여 탈핵 에 이용하였다. 핵 이 식은 0.
- 체외성숙용 배 양액에 난구세포가 2층 이상이고 세포질이 충실한 100~150 개의 난포란을 넣고 5% CO2, 98~99% 습도, 39℃ CO2 incubator에서 처음20~22시간 동안은 호르몬이 첨가된 체외성숙용 배양액에서, 다음 20~22시간은 호르몬이 첨가되지 않은 배양액에서, 총 40~44시간 동안 배양하여 체외성숙을 유도하였다.
- )에 45 ml씩 분주하여 4℃의 냉장고에 보관하면서 약 2 주간 사용하였다. 체외성숙용배양액은 NCSU 23 배양액에 10% 난포액, 0.1 mg/ ml cysteine, 0.01 yg/ml EGF, 10 lU/ml eCG 그리고10 lU/ml hCG를 첨가하여 제조하였다. 체외배양액은 NCSU 23 배양액에 0.
- 05 M sucrose를 첨가한 용액에서 실시하였다. 탈핵은 10~20% 정도의 세포질을 흡입함으로써 핵을 제거하였으며, 탈핵된 난자의 세포질이 제거된 공간에 G0나 G1 으로 유도한 공여세포를 세포질과 부착되게 주입하였다. 공여 세포가 주입된 난자는 전기융합을 실시하기 전까지 0.
- 전기융합은 처리구에 따라 H0-150 V/mm의 강도로 50 [isec, 2 pulse를 주었으며, 전기융합 후 활성화를 따로 실시할 경우에는 100 V/mm, 20 usee, 2 pulses를 주어 활성화를 유도하였다. 핵이식 수정란의 일부는 융합과 활성화를 유도한 다음 cytochalasin B (CB)에 4시간 처리 후 체외배양을 실시하였다.
대상 데이터
- , Ja-pan)에서 난포란을 수집한 후 체외성숙용 기본배양액 NCSU 23으로 4~5회 세척하면서 선발하였다. 난포란의 선발은 난구세포의 부착 정도와 세포질의 충실도에 따라 실시하였으며, 최소한 2층 이상의 난구세포층으로 되어 있고, 세포질이 균일하고 충실한 것을 선발하여 실험에 공시하였다.
- 미성숙 난포란을 채란하기 전 난소주위의 지방과 결합조직을 제거하고, 생리식염수로 3~4희 세척한 후, 18-G needleO] 부착된 20 ml 주사기를 이용하여 2~7 mm의 가시 난포를 흡입하여 난포란을 채란하였다. 난포란의 채취시사용된 배양액은 0.1 mg/ml PVA가 첨가된 TALP-HEPES (Prather 등, 1995)를 사용하였다. 흡입된난포액은 5~10 분간 정치시킨 후 침전된 하부 액을 5 ml의 피펫으로 흡입하여 직경 60 m 배양접시에 옮겨 40X 배율의 도립현미경(Olympus Co.
- 난포란의 체외성숙에 사용한 배양액은 NCSU23 을 기본배양액으로 하여 Baxter (Baxter Healthcare Co., U.S.A.)의 물 1 / 로 제조하여 0.2µM filter (Gelman Sci., U.S.A.)로 여과하였다. pH는 7.
- 본 실험에 공시된 난소는 도축장에서 도살직후난소를 적출하여 penicillin G (100 units/ml)와 streptomycin (100 µg/ML]이 함유된 생리식염수(30~35℃)가 들어있는 보온병 에 담아 3~4시간 내에 실험실로 운반하였다. 미성숙 난포란을 채란하기 전 난소주위의 지방과 결합조직을 제거하고, 생리식염수로 3~4희 세척한 후, 18-G needleO] 부착된 20 ml 주사기를 이용하여 2~7 mm의 가시 난포를 흡입하여 난포란을 채란하였다.
- 01 yg/ml EGF, 10 lU/ml eCG 그리고10 lU/ml hCG를 첨가하여 제조하였다. 체외배양액은 NCSU 23 배양액에 0.4% BSA를 첨가하여 사용하였다. 돼지 난포액은 2~7 mm 크기의 난포에서 난포 액을 채취하여 1, 900 X g로 3희 원심분리하고, 최종 0.
- 핵이식에 사용된 피펫은 직경이 1 mm인 capillary tube (Sigma, USA)를 사용하였으며, 보정용 피펫의 외경은 150~160 im, 탈핵과 주입용 피펫은 외경이 20-30 µm로 조절하였다. 체외성숙 난자를 0.
- 1 mg/ml PVA가 첨가된 TALP-HEPES (Prather 등, 1995)를 사용하였다. 흡입된난포액은 5~10 분간 정치시킨 후 침전된 하부 액을 5 ml의 피펫으로 흡입하여 직경 60 m 배양접시에 옮겨 40X 배율의 도립현미경(Olympus Co., Ja-pan)에서 난포란을 수집한 후 체외성숙용 기본배양액 NCSU 23으로 4~5회 세척하면서 선발하였다. 난포란의 선발은 난구세포의 부착 정도와 세포질의 충실도에 따라 실시하였으며, 최소한 2층 이상의 난구세포층으로 되어 있고, 세포질이 균일하고 충실한 것을 선발하여 실험에 공시하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계학적 분석은 SAS package를 이용하여 실시하였으며, GLM (General Linear Model) procedure를 적용하여 각 요인의 least squaremean을 구하여 요인간의 유의차를 검정하였다.
이론/모형
- 체외수정란의 할구수를 조사하기 위하여 수정 후 7일까지 배양한 배반포기배를 Hoechst 33342 (Sigma, U.S.A.)를 이용해여 Pursel 등(1985)의 방법에 준하여 핵을 염색하였고, 형광현미경 200~ 400 배의 배율하에서 핵의 수를 조사하였다.
성능/효과
- 110 V/mm의 자극이 주어진 군에서는 47.1 %로써 130 V/mm의 자극이 주어진 군(70.2%) 과 150 V/mm의 자극이 주어진 군(72.6%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮은 융합율을 나타내었고, 분할율에 있어서도 각각 48.6%, 72.6%와 70.5%로 나타나 110 V/mm의 자극이 주어진 군에서 130 V/mm의 자극과 150 V/mm의 자극이 주어진 군에 비하여 유의적인(P<0.05) 차이를 나타내었다. 그러나 배반포기배로의 발달율에 있어서는 세 처리군각각 8.
- 3가지의 처리군에 있어서의 분할율은 각각 71.4%, 74.7% 및 70.8%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 배반포기배로의 발달율에 있어서도 각각 9.7%, 8.0% 및 11.2%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한 배반포기배의 할구수에 있어서도 3가지 처리군에서각각 22.
- 따라서, 위의 연구결과들과 비교하였을 때 본연구의 결과에서는 돼지의 체세포를 이용한 복제 수정란의 생산에 있어서 핵이식 수정란의 전기적 융합을 위한 전기자극 및 활성화는 앞에서 언급한 3가지 의 처리 방법 - SA 방법, SA 방법과 CB 처 리군, 그리고 DA 방법과 CB 처리군 - 에 있어서 체세포 복제수정란의 생산결과에는 차이가 나타나지 않는 것으로 사료된다. 그러나 전기적 자극에 의한 적정한 융합 및 활성화의 최적조건 확립과 더 나은 배반포기배로의 발달율을 향상시키기 위한 연구가 지속되어야 할 것으로 사료된다.
- 05)으로 높게 나타났다. 또한 복제 수정란의 생산에 있어서 분할율과 배반포기배로의 발달율에 있어서도 Ca2+의 농도에 따라서 각각 0.1 mM (68.6%, 6.3%)와 1.0 mM (74.3%, 15.8%)에서 분할율은 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 배반포기배로의 발달율에 있어서는 유의적인 차이를 나타내었다. Yin 등(2003)은 체세포 복제 수정란을 생산하기 위한 실험에서 본 연구와 같은 방법으로 대조구로서 전기적 자극에 의해 활성화된 단위발생란의 생산을 유도하여 19.
- 본 연구결과(Table 1)에 있어서 분할율은 복제 수정란과 단위발생란 간에 유의차가 없었으나 Park 등(2001b)의 결과와 비교할 때, 단위발생란의경우는 비슷한 결과이었으나 체세포복제 수정란의 경우 매우 높은 분할율(72.4 : 24.5%)을 나타내었다. 체세포 복제 수정란의 경우 분할율과 배반포기배의 발달율이 각각의 연구보고가 다르게 나타나는 이유들 중의 하나는 각기 다른 실험체계에서 나타나는 일련의 차이에 기인된다고 볼 수 있을 것으로 사료되며, 적정한 융합과 활성화를 위한 조건들이 확립되어야 할 것이다.
- 1%)에 있어서 두 처리군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다고 보고하였다. 본 연구에서는 110 V/mm에서는 47.1 %의 융합율과 48.6%의 분할을을 나타내어 위의 결과에 비하여 낮은 결과를 나타내었으며, 130V/mm와 150 V/mm에서는 융합율(70.2%, 72.6%) 과 분할율(72.6%, 70.5%)에 있어서는 비슷한 결과를 나타내었으나, 배반포기배로의 발달율에 있어서는 다소 낮은 발달율을 나타내었다.
- 본 연구의 결과에서 핵이식 수정란의 융합시130 V/mm 이상의 전기적 강도가 적합하며 110 V/mm 의 강도는 적합하지 않다고 사료된다. 그러나 Chung 등(2002) 및 Park 등(2001c)은 120 V/mm에서도 비슷한 결과를 얻었으므로, 이를 고려하여 체세포를 이용한 복제수정란을 생산하기 위해서는 핵이식 수정란의 전기적 융합을 위한 최적의 전기자극 조건이 확립되어야 할 것으로 사료된다.
- 체외배 양후 48시간에 조사된 분할율에 있어서는 핵이식 복제 수정란과 단위발생란에 있어서 비슷한 결과를 나타내었으나, 배양 7일째 배반포기배로의 발달율에 있어서는 복제수정란이 7.6%로 나타나 단위발생란의 20.4%에 비해 유의적으로(P<0.05) 발달율이 낮았다.
후속연구
- 것으로 사료된다. 그러나 전기적 자극에 의한 적정한 융합 및 활성화의 최적조건 확립과 더 나은 배반포기배로의 발달율을 향상시키기 위한 연구가 지속되어야 할 것으로 사료된다.
- 이러한 일련의 결과를 비추어 볼 때 체세포를 이용한 복제수정란의 생산효율을 향상시키기 위해서는 적정한 전기적 자극에 의한 융합방법과 활성화 방법이 확립되어야 하며, 이를 위해서는 적정한 전기적 자극의 강도가 설정되어야 하고 또한 핵이식 수정란의 융합과 활성화에 따른 조건이 확립되어야 할 것이다. 따라서 본 연구에서는 체세포를 이용한 돼지 복제수정란의 생산효율을 높이는 최적의 방법을 구명코자 핵이식 수정란에 각기 다른 조건들의 전기적 자극에 의한 융합과 활성화를 유도하여 융합율, 분할율, 후기배로의 발달율 및 배반포기배의 할구수를 비교 .
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