[논문]돼지 체세포 복제 수정란의 자가 사멸 분석

류지은; 윤종택

doi:10.12750/jet.2018.33.3.119

[국내논문] 돼지 체세포 복제 수정란의 자가 사멸 분석
Analysis of Apoptosis on the Somatic Cell Nuclear Transfer embryos in porcine 원문보기

Journal of embryo transfer = 한국수정란이식학회지, v.33 no.3, 2018년, pp.119 - 127

류지은 (한경대학교 미래융합기술대학원 동물생명공학과) , 윤종택 (한경대학교 미래융합기술대학원 동물생명공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study is to examined the electrofusion and activation conditions for the production of porcine somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos. In this study, immature oocytes were cultured in TCM-199 with and without hormones for 22 hours. Skin fibroblasts cells of porcine were transferred into the perivitelline space of enucleated in vitro matured oocytes. Cell fusion was performed with two different pulses that each one pulse (DC) of 1.1 kV/cm or 1.5 kV/cm for $30{\mu}sec$. After fusion subsequent activation were divided into three groups; non-treatment (control) and treatment with 2 mM 6-DMAP or $7.5{\mu}g/ml$ cytochalasin B for 4 hours. Transferred embryos were cultured in PZM-3 (Porcine Zygote Medium-3) in $5%\;CO_2$ and 95% air at $39^{\circ}C$ for 7 day. Apoptosis-related genes (Caspase-3, BCL-2, mTOR, and MMP-2) were analyzed by immunofluorescence staining. There was no significant difference between two different electrofusion stimuli in the cleavage rate; $64.9{\pm}4.8%$ in 1.1 kV/cm and $62.7{\pm}4.0%$ in 1.5 kV/cm. However, blastocyst formation rate (%) was significantly different among three different activation groups (no treatment, 2 mM 6-DMAP or $7.5{\mu}g/ml$ cytochalasin B) combined with electrofusion of 1.1 kV/cm. The blastocyst formation rate was $12.6{\pm}2.5$, $20.0{\pm}5.0$, and $34.9{\pm}4.3%$ in control, 2 mM 6-DMAP, and $7.5{\mu}g/ml$ cytochalasin B, respectively. Immunofluorescence data showed that expression levels of caspase-3 in SCNT embryos undeveloped to blastocyst stage were higher than those in the blastocyst stage embryos. Expression levels of Bcl-2 in blastocyst stage embryos were higher than those in the arrested SCNT embryos. These results showed that the combination of an electric pulse (1.1 kV/cm for $30{\mu}sec$) and $7.5{\mu}g/ml$ cytochalasin B treatment was effective for production of the porcine SCNT embryos.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

본 연구는 돼지 체세포 복제 수정란의 효율 향상을 위해 적정한 전기자극과 활성화 방법을 찾고, 체세포 복제 수정란의 apoptosis를 분석하여 체세포 복제 수정란의 낮은 효율의 원인에 대한 자료를 제공하고자 시행되었다.

제안 방법

Annexin V 염색은 PE Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ(BD Biosciences, San Jose, CA)을 이용하였다. 체세포 복제 수정란의 발육 단계별 Apoptosis 비율을 측정하기 위해 체외배양 24시간 마다 복제 수정란을 회수하여 염색을 실시하였다. 회수한 복제 수정란은 1×PBS에 3회 세정 후, 1X binding Buffer 100µl에 Annexin V와 7-AAD를 각각 5µl씩 주입하여 실온에서 1시간 30분 염색을 실시하여 분석하였다.
체세포 복제 수정란의 배발달율 향상을 위해 전기융합(1.1kV/cm, 1.5kV/cm)과 활성화(6-DMAP, cytochlasin B) 조건을 각각 진행하여 체세포 복제 수정란의 배발달율을 분석하였다(Table 1). 전기융합 조건인 1.
체외배양 7일차에 핵이식란을 회수하여 각 단계별 apoptosis관련 단백질를 Immunofluorescence로 분석하였다. Apoptosis marker인 Caspase-3의 발현은 발달이 정지한 2cell, 4cell, 8cell 단계에서 배반포 단계보다 높은 발현을 보였다.

대상 데이터

본 실험에 공시된 난소는 도축장에서 도축된 돼지의 난소를 채취하여 항생제(Penicillin G 100IU/ml, Streptomycin 100µg/ml)를 첨가한 생리식염수 용액에 37℃의 온도를 유지하여, 2시간 이내에 실험실로 운반하였다. 운반된 난소는 생리식염수로 3회 세척하고 18gauge 주사침이 부착된 10ml 주사기로 3-5mm의 난포에서 난포액과 미성숙 난자를 채취하였다.
피부 유래 공여세포(skin cell)는 Landrace 종 돼지의 코를 절제하여 채취하였으며, 조직을 미세하게 세절하여 0.05% trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 3분간 vertexing을 실시하였다. 10% FBS가 첨가된 Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium(DMEM : Gibco, Rockville, MD, USA) 배양액으로 원심분리를 실시하여 trypsin과 EDTA를 제거한 다음 신선한 DMEM배양액에 재부유시켜 25cm² flask에 분주하여 5% CO₂, 95% 공기 그리고 39℃ 조건의 배양기내에서 배양을 실시하여, 배양 12시간 후 바닥에 붙지 않은 세포는 제거하고, 10% FBS가 첨가된 DMEM배양액으로 48시간마다 교체하면서 6~8일간 배양을 실시하였다.

데이터처리

본 연구를 통하여 획득된 결과에 대한 통계 분석은 GraphPad Instat을 이용하여 Tukey-Kramer Multiple Comparisons Test를 사용하였다. 통계적 유의성은 p<0.

성능/효과

이는 mTOR이 Bcl family 군과 복합적으로 작용(Castedo 등, 2002; Park 등, 2015)하며 apoptosis가 많이 일어난 단계에서는 Pro-apoptotic유전자들과 관련되어 apoptosis를 유발하고, 배반포 단계에서는 Anti-apoptotic 유전자들과 관여하는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구결과는 SCNT란의 활성과정에서 전기자극의 방법과 세포활성인자(Cytochalasin B)의 적절한 사용이 초기 발달에 영향을 주는 것으로 사료되며, 미토콘드리아에서 발생되는 internal-apoptosis 신호체계에 영향을 주어 anti-apoptosis로 작용하는 것으로 사료된다. 즉 본 연구를 활용하여 SCNT란의 발달율을 증가시킬 수 있을 것이라 본다.
따라서 SCNT 과정 중 6-DMAP나 Cytochalasin B의 처리는 복제 수정란의 발달에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 사료된다. 또한 본 실험 결과에서 1.1kV/cm 조건과 1.5kV/cm 조건 모두 무처리군에 비해 CytochalasinB의 처리군에서 유의적으로 높은 배반포율을 보여, 1.1kv/cm 전기융합 후 Cytochalasin B 처리가 복제 수정란의 발달율과 배반포율에 향상에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 사료된다.
9%)보다 높다는 보고와 유사한 결과를 보여, 높은 전기 자극보다 낮은 전기자극이 배반포율이나 난자 활성화 향상에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 본 연구 결과에서 활성화조건의 경우 무처리군보다 6-DMAP처리군과 Cytochalasin B처리군에서 높은 발달율과 배반포율을 나타냈다. Protein serine/threonin kinase 억제제로 화학 합성물인 6-DMAP는 maturation-promoting factor(MPF) 활성을 억제하여 수정란을 발달 단계로 넘어갈 수 있도록 하며, 포유동물 난자를 성공적으로 활성화하는 것으로 나타났다(Alexander 등, 2006).

후속연구

따라서 본 연구결과는 SCNT란의 활성과정에서 전기자극의 방법과 세포활성인자(Cytochalasin B)의 적절한 사용이 초기 발달에 영향을 주는 것으로 사료되며, 미토콘드리아에서 발생되는 internal-apoptosis 신호체계에 영향을 주어 anti-apoptosis로 작용하는 것으로 사료된다. 즉 본 연구를 활용하여 SCNT란의 발달율을 증가시킬 수 있을 것이라 본다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	복제 돼지 생산의 효율은 어느 정도인가?	특히, SCNT에 의한 복제 돼지 생산은 면역이 억제된 조직과 장기를 생산하는 이종이식연구에 활용할 수 있기 때문에 특별한 중요성을 가지고 있다(Prather, 2000; Lai와 Prather, 2003). 그러나 돼지 복제 효율은 1-5%로 다른 가축에 비해 매우 낮다(Walker 등, 2002;Lai와 Prather, 2003). 이는 탈핵, 융합, 활성화 등과 같은 기술적인 요인들(Yang 등, 2003)과 비정상적 메틸화(Park 등, 2001; Jeong등, 2009), 유전자 발현의 문제(Park 등, 2010; Ko 등, 2011; Park 등, 2011)로 인한 것으로 알려져 있다.
	체세포 핵이식은 어디에 유용한 기술인가?	체세포 핵이식(SCNT: Somatic cell nuclear transfer)은 형질 전환 동물의 생산과 치료용 복제 동물을 생산하는데 유용한 기술이다. 특히, SCNT에 의한 복제 돼지 생산은 면역이 억제된 조직과 장기를 생산하는 이종이식연구에 활용할 수 있기 때문에 특별한 중요성을 가지고 있다(Prather, 2000; Lai와 Prather, 2003).
	SCNT에 의한 복제 돼지 생산이 특별히 중요한 이유는?	체세포 핵이식(SCNT: Somatic cell nuclear transfer)은 형질 전환 동물의 생산과 치료용 복제 동물을 생산하는데 유용한 기술이다. 특히, SCNT에 의한 복제 돼지 생산은 면역이 억제된 조직과 장기를 생산하는 이종이식연구에 활용할 수 있기 때문에 특별한 중요성을 가지고 있다(Prather, 2000; Lai와 Prather, 2003). 그러나 돼지 복제 효율은 1-5%로 다른 가축에 비해 매우 낮다(Walker 등, 2002;Lai와 Prather, 2003).

참고문헌 (34)

Alexander B, Coppola G, Di Berardino D, Rho GJ, St John E, Betts DH. and King WA. 2006. The Effect of 6-Dimethylaminopurine (6-DMAP) and Cycloheximide (CHX) on the Development and Chromosomal Complement of Sheep Parthenogenetic and Nuclear Transfer Embryos. Mol. Reprod. Dev. 73:20-30.

상세보기
Beebe LF, McIlfatrick S.J. and Nottle MB. 2009. Cytochalasin B and Trichostatin A Treatment Postactivation Improves In Vitro Development of Porcine Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos. Cloning and Stem Cells 11:477-482.

상세보기
Bondioli K, Ramsoondar J, Williams B, Costa C and Fodor W. 2001. Cloned pigs generated from cultured skin fibroblasts derived from a H-transferase transgenic boar. Molecular Reproduction and Development 60:189-195.

상세보기
Boquest AC, Grupen CG, Harrison SJ, McIlfatrick SM, Ashman RJ and d'Apice AJ. 2002. Production of cloned pigs from cultured fetal fibroblast cells. Biology of Reproduction 66:1283-1287.

상세보기
Castedo M, Ferri KF and Kroemer G. 2002. Mammalian target of rapamycin (mTOR): pro- and anti-apoptotic. Cell Death Differ 9:99-100.

상세보기
Cha SK, Kim NH, Lee SM, Baik CS, Lee HT and Chung KS. 1997. Effect of Cytochalasin B and cycloheximide on the activation rate, chromosome constituent and in vitro development of porcine oocytes following parthenogenetic stimulation. Reprod. Fertil. 9:441-446.
Chae JI, Cho SK, Seo JW, Yoon TS, Lee KS, Kim JH, Lee KK, Han YM and Yu K. 2006. Proteomic Analysis of the Extraembryonic Tissue from Cloned Porcine Embryos. Mol. Cell Proteomics. 5:1559-1566.

상세보기
Cong PQ, Kim ES, Song ES, Yi YJ and Park CS. 2008. Effects of fusion/activation methods on development of embryos produced by nuclear transfer of porcine fetal fibroblast. Animal Reproduction Science 103:304-311.

상세보기
Feugang JM, Roover DE, Leonard S, Dessy F and Donnay I. 2002. Kinetics of Apoptosis in preimplantation bovine embryos produced in vitro and in vivo. Theriogenology 57:494.
Gjorret J, Wengle J, King WA, Schellander K and Hyttel P. 2002. Occurrence of Apoptosis in bovine embryos reconstructed by nuclear transfer or derived in vivo. Theriogenology 57:495.
Hao Y, Lai L, Mao J, Im GS, Bonk A and Prather RS. 2003. Apoptosis and In Vitro Development of Preimplantation Porcine Embryos Derived In Vitro or by Nuclear Transfer. Biol. Reprod. 69:501-507.

상세보기
Hardy K. 1999. Apoptosis in the human embryo. Rev. Reprod. 4:125-134.
Hyun SH, Lee GS, Kim DY, Kim HS, Lee SH, Kim S, Lee ES, Lim JM, Kang SK, Lee BC and Hwang WS. 2003. Effect of maturation media and oocytes derived from sows or gilts on the development of cloned pig embryos. Theriogenology 59:1641-1649

상세보기
Jeon YB, Biswas D, Yoon KY and Hyun SH. 2009 Prediction of Developmental Ability of In Vitro Fertilized Porcine Embryos by Analysis of Early Cleavage Pattern. Journal of embryo transfer 24:65-69.
Jeong YS, Oh KB, Park JS, Kim JS and Kang YK. 2009. Cytoplasmic localixation of oocyte-specific variant of porcine DNA methyltransferase-1 during early development. Dev. Dyn. 238:1666-1673
Ji Q, Zhu K, Liu Z, Song Z, Huang Y, Zhao H, Chen Y, He Z, Mo D and Cong P. 2013. Improvement of porcine cloning efficiency by trichostain A through early-stage induction of embryo Apoptosis. Theriogenology 79:815-23.

상세보기
Jolliff WJ and Prather RS. 1997. Parthenogenic development of in vitro-matured, in vivo-cultured porcine oocytes beyond blastocyst. Biology of Reproduction 56:544-548.

상세보기
Kim SH, Kang HA, Kim DS, Lee MS, Seo KS, Min KS and Yoon JT. 2010. Expression Analysis of Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases from In Vitro Maturation Oocytes Complexes in Porcine. Reproductive & developmental biology 34:55-62.
Ko YG, Im GS, Lee HC, Cho SR, Choi SH, Choi CY, Lee PY, Cho JH and Yoo YH. 2011. Non-CPC methylation of Pre-1 sequence in pig SCNT blastocyst. Reprod. Dev. Biol. 35:93-97.
Kubota C, Yamakuchi H, Todoroki J, Mizoshita K, Tabara N, Barber M and Yang X. 2000. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97:990-995.
Lai L and Prather RS. 2003. Production of cloned pigs by using somatic cells as donors. Cloning Stem Cells 5:233-241.

상세보기
Lee GS, Kim HS, Hyun SH, Lee SH, Jeon HY, Nam DH, Jeong YW, Kim S, Kim JH, Han JY, Ahn C, Kang SK, Lee BC and Hwang WS. 2005. Production of transgenic cloned piglets from genetically transformed fetal fibroblasts selected by green fluorescent protein. Theriogenology 63:973-991.

상세보기
Levy R, Benchaib M, Cordonier H, Souchier C and Guerin JF. 1998. Annexin V labelling and terminal transferase-mediated DNA end labelling (TUNEL) assay in human arrested embryos. Molecular Human Reproduction 4:775-783.

상세보기
Pang YW, An L, Wang P, Yu Y, Yin QD, Wang XH, Xin-Zhang, Qian-Zhang, Yang ML, Min-Guo, Wu ZH and Tian JH. 2013. Treatment of porcine donor cells and reconstructed embryos with the antioxidant melatonin enhances cloning efficiency. J. Pineal. Res. 54:389-397.

상세보기
Park CH, Uh KJ, Mulligan BP, Jeung EB, Hyun SH, Shin T, Ka H and Lee CK. 2001 Analysis of imprinted gene expression in nomal fertilized and uniparental preimplantation porcine embryos. PLoS One 6:e22216.
Park JY, Park MR, Hwang KC, Chung JS, Bui HT, Kim T, Cho SK, Kim JH, Hwang S, Park SB, Nguyen VT and Kim JH. 2011. Comparative gene expression analysis of somatic cell nuclear transfer-derived cloned pigs with normal and abnomal umbilical cords. Biol. Reprod. 84:189-199.
Park MR, Kim BK, Lee HC, Lee P, Hwang S, Im GS, Woo JS, Cho C, Choi SH, Kim SW and Ko YG. 2010. The imprinted messenger TNA expression in cloned porcine pre-implantation embryos. J. Emb. Trans. 25:127-131.
Park YG, Lee SE, Kim EY, Hyun H, Shin MY, Son YJ, Kim SY and Park SP. 2015. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development & Reproduction 19:119-126.

원문보기 상세보기
Park, S.J, Ryu, J, Kim, I.H, Choi, Y.H, Nam, T.J. 2015. Activation of the mTOR signaling pathway in breast cancer MCF-7 cells by a peptide derived from porphyra yezoensis. Oncol Rep. 33:19-24.
Prather RS. 2000. Cloning. Pigs is pigs. Science. 289:1886-1887.
Ranganathan P and Rangnekar VM. 2005. Exploiting the TSA connections to overcome Apoptosis-resistance. Cancer Biol. Ther. 4:391-392.
Walker SC, Shin TY, Zaunbrecher GM, Romano JE, Johnson GA and Bazer FW. 2002. A highly efficient method for porcine cloning by nuclear transfer using in vitro-matured oocytes. Cloning Stem Cells 4:105-112.

상세보기
Yang YH, Choi SY, Lee SY, Park CK, Yang BK, Kim CI and Cheong HT. 2003. Study on the improvement of bovine somatic cell nuclear transfer rechnique. Korean J. Animal Reprod. 27:233-240.
Yin XJ, Cho SK, Park MR, Im YJ, Park JJ, Bhak JS, Kwon DN, Jun SH, Kim NH and Kim JH. 2003 Nuclear remodelling and the developmental potential of nuclear transferred porcine oocytes under delayed-activated conditions. Zygote 11:167-174.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증