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문제 정의
- 본 연구는 비글 개에 대한 amitraz의 급성독성 잠재력을 평가하기 위하여 농촌진흥청 (Rural Development Adminis tration) [15] 및 경제협력개발기구(Organisation for Economic Cooperation and Development, OECD) [12]의 독성시험기준에 준하여 단회피하투여 독성시험을 수행하였다. 사람 및 개에 있어서 본 시험물질의 주요 노출경로는 피부이지만 본 시험에서는 피하를 투여경로로 선택하였다.
- 본 연구는 살충제 amitraz의 피하투여 급성독성을 평가하기 위해 0, 2, 10 및 50 mg/kg 용량으로 1회 피하투여한 후, 사망률과 일반증상, 체중, 혈액 및 혈청생화학 및 부검소견에 미치는 영향을 평가하였다. 시험결과, 비글 개에 있어서 amitraz의 단회 피하투여는 식욕부진과 침울, 구토, 유루, 운동성 감소, 보행실조, 투여부위의 부종, 종괴 및 농양형성, 사지의 부전마비, 횡와위, 빈사, 사망, 체중감소, 투여부위의 근육 출혈과 염증, 그리고 간과 신장의 충혈을 유발하는 것으로 나타났다.
가설 설정
- Clinical findings in male beagle dogs after single subcutaneous injection of amitraz (n = 3) a)Number of dogs with the clinical signs. b)Data unavailable.
제안 방법
- 건강한 수컷동물 12마리를 선발하여 대조군과 2, 20 및 50 mg/kg의 4개 시험군에 체중이 균등히 분포하도록 무작위로 3마리씩 분배하였다. 본 시험에 사용된 용량은 이전 시험들의 연구결과를 참조하여 충분히 독성이 나타날 것으로 예상되는 50 mg/kg을 고용량으로 설정하였고, 공비 5를 적용하여 10 및 2 mg/kg의 중간 및 저용량군을 추가하였다.
- 순화기간 중 임상증상, 혈액검사, 뇨검사, 안검사 및 심전도 검사를 실시하였고, 건강한 수컷 12마리를 선택하여 시험에 공시하였다. 동물실의 사육환경은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수 13~18희/h, 조명시간 12시간(오전 7시 점등~오후 7시 소등) 및 조도 200-300 lux로 설정된 차폐시설에서 수행하였다. 동물은 스테인 레스 철망사육상자 (700WX700LX800H nun)에 개체별로 수용하였고, 개용 고형사료(오리엔탈효모사: 日本 東京都 板橋區 小豆泥 3-6-10) 는 일일 마리당 300 g 씩, 그리고 멸균수도수는 일일 마리당 1000 ml씩으로 제한 급여하였다.
- 동물은 스테인 레스 철망사육상자 (700WX700LX800H nun)에 개체별로 수용하였고, 개용 고형사료(오리엔탈효모사: 日本 東京都 板橋區 小豆泥 3-6-10) 는 일일 마리당 300 g 씩, 그리고 멸균수도수는 일일 마리당 1000 ml씩으로 제한 급여하였다. 동물의 개체식별은 이 개부 내측의 tattoo 번호와 사육상자 전면에 개체식별카드를 이용하였다. 본 시험은 국제실험동물관리인증협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)로부터 인증된 시설에서 수행하였으며, 동물은 미국 NRC (National Research Council) 의 실험동물의 관리 및 사용기준에 준하여 유지하였다[11].
- 치사시켜 부검하였다. 모든 생존동물과 도중 사망동물에 대해서 육안적 부검소견을 관찰하였다.
- 분배하였다. 본 시험에 사용된 용량은 이전 시험들의 연구결과를 참조하여 충분히 독성이 나타날 것으로 예상되는 50 mg/kg을 고용량으로 설정하였고, 공비 5를 적용하여 10 및 2 mg/kg의 중간 및 저용량군을 추가하였다.
- and Development, OECD) [12]의 독성시험기준에 준하여 단회피하투여 독성시험을 수행하였다. 사람 및 개에 있어서 본 시험물질의 주요 노출경로는 피부이지만 본 시험에서는 피하를 투여경로로 선택하였다. 개를 이용한 경피독성시험은 시험물질의 적용에 많은 어려움이 있기 때문에 독성시험에서는 대체경로로서 피하투여가 많이 이용되고 있다.
- , NJ, USA) 하였다. 사망동물과 빈사 동물의 경우, 발견 즉시 부검하여 육안적 부검소견을 관찰하였다.
- 3, 000 rpm으로 10분간 원심분리하여 획득한 혈청을 -80℃의 저온 냉동기에 분석할 때까지 보관하였다. 생화학 자동분석장치(Shimadzu-CL-7200, Shimadzu Co., Japan)와 전해질 자동분석장치(644 Na/K/Cl Analyzer, Ciba- Coming Co., USA)를 이용하여 AST (aspartate amino transferase), ALT (alanine aminotransferase), 알카리 성 포스파타아제(alkaline phosphatase), 크레아틴 포스포키나제 (creatine phosphokinase), 혈당(glucose), 총단백 질(total pro tein), 알부민 (albumin), 알부민/글로부린 비율 (albumin/ globulin ratio), 혈중요소질소(blood urea nitrogen), 크레아티닌(creatinine), 중성지방(triglyceride), 인지질(phospholipid), 총콜레스테롤(total cholesterol), 총빌리루빈(total bilirubin), 칼슘(calcium), 무기인(inorganic phosphorus), 염소(chloride), 나트륨(sodium) 및 칼륨(potassium)치를 측정하였다.
- 시험물질 투여 후 1시간에서 6시간까지는 매시간 마다, 그리고 투여 다음날부터 14일까지는 매일 1회씩 일반증상과 사망 유무를 관찰 . 기록(Labcat System, Innovative Programming Associates Inc.
- 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 투여개시전과 투여 후 1, 3, 7 및 14일에 체중을 측정하였다.
- 혈구 자동 계측 장치(Coulter Counter T-540, Coulter Counter Elec tronics, USA)를 이 용하여 총백 혈구수(white blood cell count, WBC), 적혈구수(red blood cell count, RBC), 혈색소 농도 (hemoglobin concentration), 적 혈구용적 (hematocrit), 평균적 혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균적 혈구 혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균적 혈구 혈색소 농도 (mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC) 및 혈소판수(platelet count)를 측정하였다. 자동분석 후 남은 혈액을 이용하여 백혈구 감별계산을 위한 도말 표본을 제작하였다. 자연건조한 도말표본을 Wright 염색법으로 염색하고, 각 표본당 200개의 백혈구를 관찰하여 총 백혈구에 대한 백분율로 표기하였다.
- 자동분석 후 남은 혈액을 이용하여 백혈구 감별계산을 위한 도말 표본을 제작하였다. 자연건조한 도말표본을 Wright 염색법으로 염색하고, 각 표본당 200개의 백혈구를 관찰하여 총 백혈구에 대한 백분율로 표기하였다.
- 서울)로 마취 후 액와동맥 절단으로 방혈 . 치사시켜 부검하였다. 모든 생존동물과 도중 사망동물에 대해서 육안적 부검소견을 관찰하였다.
- 투여 후 14일째 에 모든 생존 동물을 pentobarbital (중외 제약, 서울)로 마취 후 액와동맥 절단으로 방혈 . 치사시켜 부검하였다.
- 조제하였다. 투여액량은 투여직전에 측정된 체중을 기준으로 kg당 0.5 ml의 액량으로 경배부에 1회 피하투여 하였다.
- 5 ml의 혈액을 EDTA-2K 함유 채혈병(녹십자, 용인)에 채취하였다. 혈구 자동 계측 장치(Coulter Counter T-540, Coulter Counter Elec tronics, USA)를 이 용하여 총백 혈구수(white blood cell count, WBC), 적혈구수(red blood cell count, RBC), 혈색소 농도 (hemoglobin concentration), 적 혈구용적 (hematocrit), 평균적 혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균적 혈구 혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균적 혈구 혈색소 농도 (mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC) 및 혈소판수(platelet count)를 측정하였다. 자동분석 후 남은 혈액을 이용하여 백혈구 감별계산을 위한 도말 표본을 제작하였다.
대상 데이터
- 5개월령의 비글 개를 Covance Research Product Inc. (Cumberland, VA, USA)로부터 구입하여 2주간 순화 . 사육하였다.
- 동물실의 사육환경은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수 13~18희/h, 조명시간 12시간(오전 7시 점등~오후 7시 소등) 및 조도 200-300 lux로 설정된 차폐시설에서 수행하였다. 동물은 스테인 레스 철망사육상자 (700WX700LX800H nun)에 개체별로 수용하였고, 개용 고형사료(오리엔탈효모사: 日本 東京都 板橋區 小豆泥 3-6-10) 는 일일 마리당 300 g 씩, 그리고 멸균수도수는 일일 마리당 1000 ml씩으로 제한 급여하였다. 동물의 개체식별은 이 개부 내측의 tattoo 번호와 사육상자 전면에 개체식별카드를 이용하였다.
- 사육하였다. 순화기간 중 임상증상, 혈액검사, 뇨검사, 안검사 및 심전도 검사를 실시하였고, 건강한 수컷 12마리를 선택하여 시험에 공시하였다. 동물실의 사육환경은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수 13~18희/h, 조명시간 12시간(오전 7시 점등~오후 7시 소등) 및 조도 200-300 lux로 설정된 차폐시설에서 수행하였다.
- 시험물질은 시판되고 있는 상품(녹십자수의약품, 용인)을 구입하여, 투여 직전에 각 투여용량에 맞게 증류수로 희석하여 조제하였다. 투여액량은 투여직전에 측정된 체중을 기준으로 kg당 0.
- 투여 후 14일째에 요측피정맥으로부터 약 0.5 ml의 혈액을 EDTA-2K 함유 채혈병(녹십자, 용인)에 채취하였다. 혈구 자동 계측 장치(Coulter Counter T-540, Coulter Counter Elec tronics, USA)를 이 용하여 총백 혈구수(white blood cell count, WBC), 적혈구수(red blood cell count, RBC), 혈색소 농도 (hemoglobin concentration), 적 혈구용적 (hematocrit), 평균적 혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균적 혈구 혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균적 혈구 혈색소 농도 (mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC) 및 혈소판수(platelet count)를 측정하였다.
데이터처리
- 시험결과는 가능한 한 평균값과 표준편차로 표기하였다. 반수치사량은 Probit 법을 이용하여 산출하였고, 체중과 혈액학치 및 혈청생화학치에 대해서는 Kruskal- Wallis ANOVA (analysis of variance)로 유의 성을 조사한 후 통계학적 차이가 인정된 자료는 Durmett 다중비교법으로 유의차를 분석하였다. 유의수준은 5% 및 1%에서 검정하였다.
- 12, NC, USA)을 이용하여 실시하였다. 시험결과는 가능한 한 평균값과 표준편차로 표기하였다. 반수치사량은 Probit 법을 이용하여 산출하였고, 체중과 혈액학치 및 혈청생화학치에 대해서는 Kruskal- Wallis ANOVA (analysis of variance)로 유의 성을 조사한 후 통계학적 차이가 인정된 자료는 Durmett 다중비교법으로 유의차를 분석하였다.
- 시험자료에 대한 통계분석은 SAS program (Statistical Analysis System Institute Inc., Version 6.12, NC, USA)을 이용하여 실시하였다. 시험결과는 가능한 한 평균값과 표준편차로 표기하였다.
이론/모형
- 동물의 개체식별은 이 개부 내측의 tattoo 번호와 사육상자 전면에 개체식별카드를 이용하였다. 본 시험은 국제실험동물관리인증협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)로부터 인증된 시설에서 수행하였으며, 동물은 미국 NRC (National Research Council) 의 실험동물의 관리 및 사용기준에 준하여 유지하였다[11].
성능/효과
- 모든 투여군의 동물에서 관찰된 체중의 감소 또는 증가억제 역시 시험물질의 투여에 기인된 것으로 판단되며, 일반증상에서 관찰된 독성소견과 일치하는 소견이다. 2 및 20 mg/kg 투여군의 경우, 시험물질의 투여에 기인된 일반증상과 체중변화는 시간의 경과에 따른 회복성이 인정되었으나 50 mg/kg 투여군에서는 이들 소견의 점진적 악화로 인해 모든 동물이 지속적인 체중감소와 빈사 또는 사망소견을 나타내었다. 다른 연구자들의 시험결과에 따르면, amitraz가 개에서 유발하는 주요 부작용은 중추신경 계 억 압과 반사작용 소실(loss of reflexes), 서맥, 저혈압, 저체온, 고창증, 다뇨증, 구토, 산동, 고혈당증등으로 알려져 있고[2, 6, 7], 이는 본 시험에서 관찰된 일반증상과 관련되는 소견이다.
- 반면, 투여 후 14일째에 생존동물의 혈액 및 혈청 생화학치에서는 시험물질의 투여와 관련된 어떠한 변화도 인정되지 않았다. 결론적으로 본 시험조건하에서 비글 개에 대한 amitraz의 반수치사량은 22.3 mg/kg (95% 신뢰한계: 산출되지 않음)이고, 무해용량(no-observed-adverse-effect level) 은 2 mg/kg 이하로 사료된다.
- 반면, 10 및 2 mg/kg 용량군에 서 는 사망동물이 관찰되지 않았다. 따라서 본 시험조건에 의 한 amitraz의 단회 피하투여 반수치사량은 22.3 mg/kg (95% 신뢰한계: 산출되지 않음)으로 산출되었다.
- 중 정상적인 체중증가를 나타내었다. 반면, 2 및 10 mg/kg 투여군에서는 투여 전의 체중에 비해 체중의 감소 또는 증가억제가 관찰되 었고, 50 mg/kg 투여군에서는 지속적인 체중감소가 관찰되었다.
- 저농도군의 동물에서는 식욕부진과 투여부위의 부종 및 종괴 형성이 관찰되었으나 투여 후 8일 이후에는 이상소견이 관찰되지 않았다. 반면, 중간 및 고농도군에서는 상기한 대부분의 소견들이 관찰되었고, 고농도군의 동물들은 일반증상의 악화로 빈사 또는 사망이 나타났다.
- Al-Qarawi 등[1]의 연구결과에 따르면, amitraz 의 근육 또는 복강주사에 의해 사망한 랫드에서 간과 신장, 심장, 소장 및 비장에서 충혈과 출혈이 관찰되었고, 투여 부위에서는 근육출혈 또는 섬유성 복강염이 관찰되었다고 한다. 본 시험에서 관찰된 근육출혈과 염증 소견은 상기 연구자들의 연구결과와 일치하는 소견으로서 경피 또는 피하노출 시 노출 부위에 국소적인 독성반응을 유발한다는 것을 암시해준다.
- 수용체 흥분작용과 관련된 중독증상을 유발하였으나, 사망은 관찰되지 않아 경구투여 최소치사량은 100 mg/kg을 상회한다고 하였다. 본 시험에서 산출된 amitraz의 피하투여 반수치사량은 22.3 mg/kg으로 나타났으며, 이는 투여경로에 따라 독력(toxic potency)의 차이가 매우 크다는 것을 나타낸다. 한편, amitraz의 정맥 투여는 1 mg/kg 용량에서도 진정과 반사작용소실, 저체온, 서맥, 저혈압, 호흡완만 및 산동 등의 중독증상을 유발하지만, 사망은 유발하지 않는 것으로 밝혀졌다[2].
- 부검시 투여군의 동물에서 관찰된 투여부위의 근육 출혈과 염증 소견은 amitraz의 국소독성에 기인된 것으로 판단되며, 50 mg/kg 용량군의 사망동물에서 관찰된 간 및 신장의 충혈소견은 amitraz가 간과 신장의 실질세포에 독성을 유발하였음을 나타낸다. Al-Qarawi 등[1]의 연구결과에 따르면, amitraz 의 근육 또는 복강주사에 의해 사망한 랫드에서 간과 신장, 심장, 소장 및 비장에서 충혈과 출혈이 관찰되었고, 투여 부위에서는 근육출혈 또는 섬유성 복강염이 관찰되었다고 한다.
- 영향을 평가하였다. 시험결과, 비글 개에 있어서 amitraz의 단회 피하투여는 식욕부진과 침울, 구토, 유루, 운동성 감소, 보행실조, 투여부위의 부종, 종괴 및 농양형성, 사지의 부전마비, 횡와위, 빈사, 사망, 체중감소, 투여부위의 근육 출혈과 염증, 그리고 간과 신장의 충혈을 유발하는 것으로 나타났다. 반면, 투여 후 14일째에 생존동물의 혈액 및 혈청 생화학치에서는 시험물질의 투여와 관련된 어떠한 변화도 인정되지 않았다.
- 일반증상 관찰시, 시험물질 투여군에서 관찰된 식욕부진과 침울, 구토, 유루, 운동성감소, 보행실조, 투여부위의 부종, 종괴 및 농양형성, 사지의 부전마비, 횡와위 및 빈사 소견은 발생 빈도 및 발생정도에서 용량의존적으로 증가한 것으로 보아 시험물질의 투여에 기인된 것으로 판단된다. 모든 투여군의 동물에서 관찰된 체중의 감소 또는 증가억제 역시 시험물질의 투여에 기인된 것으로 판단되며, 일반증상에서 관찰된 독성소견과 일치하는 소견이다.
- 저농도군의 동물에서는 식욕부진과 투여부위의 부종 및 종괴 형성이 관찰되었으나 투여 후 8일 이후에는 이상소견이 관찰되지 않았다. 반면, 중간 및 고농도군에서는 상기한 대부분의 소견들이 관찰되었고, 고농도군의 동물들은 일반증상의 악화로 빈사 또는 사망이 나타났다.
- 투여 후 14일째에 동물을 부검하여 혈액 및 혈청 생화학치에 대한 변화를 측정한 결과, 생존동물에서는 어떠한 변화도 유발하지 않은 것으로 나타났다. Hsu와 Schaffer [8]에 따르면, 개를 모낭충증(demodicosis)이나 진드기 구제에 대한 권장용량의 2배인 555 ppm의 온수에 침지하면 급격한 혈당상승이 유발되며, 이는 인슐린 분비의 억제에 기인된 소견이라고 하였다.
- 투여 후 14일째에 부검한 동물의 혈액검사 결과, Table 4에 나타낸바와 같이 2 mg/kg 투여군에서 백혈구 수가 대조군에 비해 통계학적으로 유의성있게 증가하였으며, 그 외의 검사항목에서는 유의성있는 차이가 인정되지 않았다.
- 투여 후 14일째에 부검한 동물의 혈청생화학치를 분석한 결과(Table 5), 모든 검사항목에서 대조군과 시험물질 투여군과의 통계학적 유의성은 인정되지 않았다.
후속연구
- 최근, 애완동물 산업의 급속한 발전으로 개를 포함한 애완동물의 외부기생충 박멸을 위한 amitraz의 사용량은 크게 증가하고 있다. 따라서, 개에서 경피 노출에 의한 독성학적 특성을 규명하는 것은 본 시험물질의 안전성 확보뿐만 아니라 동물종간의 독성학적 특성의 규명에도 유용한 정보를 제공하게 될 것이다.
- Hugnet 등[기도 amitraz 100 mg/kg을 개에게 단회 경구투여하여 혈당농도의 현저한 상승을 관찰하였으며, Grossman [5]은 진드기구제용 목줄(acaricide collar)의 섭식으로 중독된 개에서 고혈당증을 관찰한 바 있다. 상기한 연구결과와는 달리 본 시험에서는 혈당의 변화를 포함한 혈액 및 혈청생화학 항목에서 어떠한 변화도 인정되지 않았는데, 이는 시험물질 투여 후의 측정시기의 차이에 기인된 결과로 판단되며, 임상병리학적 변화를 세부적으로 관찰하기 위해서는 투여 후 경시적인 채혈 및 분석이 필요한 것으로 사료된다.
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