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문제 정의
- 원산지는 통상적으로 외형적인 특징으로 판별하였으나, 수산물의 종류가 매우 다양할 뿐만 아니라 몇몇 종에서는 변형과 변색이 빈번해서 외형적인 특징만으로 판별하기 어려운 형편이다. 따라서 본 연구에서는 유용한 어종으로 잘 알려진 넙치를 선택하여 보다 근본적인 방법으로 이러한 원산지를 판별하기 위하여, 최근에 유전자의 다양성을 판별하기 위해 개발된 degenerating gel electrophoresis scanning (DGES) 방법을 사용하였다[4]. 넙치는 식용으로 많이 사용되므로 양식 산업이 잘 발달되어 있고, 넙치의 전체 mtDNA 염기서열이 GenBank 에 이미 기록되어 있으며 넙치의 계통발생학적 연구가 활발히 진행되고 있으므로 본 연구를 보다 효과적으로 수행할 수 있었다.
- 일반적으로 TDGS는 5~ 10개 정도의 multiplex PCR 산물을 수평 방향으로 전기영동을 실시한 다음 다시 DNA 크기 별로 구분하기 위해 2차 수직 방향의 denature and gradient gel을 전기영동하여 각각의 단일 가닥의 DNA (ssDNA)의 다양성을 구별할 수 있는 방법이다[9, 15]. 본 연구에서는 Ham 등(2002)이 이용한 방법으로 TDGS 장치에서 특이적 DNA 다양성을 관찰하기 위한 것으로 4개 지역의 3개 샘플로 총 12개의 샘플을 하나의 gel에 동시에 진행시켜 넙치 유전자에 존재하는 이형다양성을 관찰하였다. 본 실험도 60℃의 TEA 완충액 내에서 deionided formamide 가 포함되어 있는 acrylamide geb을 이용하여 DNA melting 과 denature가 이루어지게 되는데[13], 이를 효과적으로 실행하기 위하여, PCR에 사용되는 프라이머 5' 쪽에 GGGCCC 의 염기를 첨가하여 DNA melting 속도를 조절하여 단일한 ssDNA에서 전이가 생긴 경우에 DNA melting 후, single strand conformation polymorphism으로 다른 지역의 샘플과 DNA 변이가 나타나므로 그 변이를 관찰할 수 있었다[9, 14], 우선 각각의 DNA 영역을 개별적으로 PCR 한 후, 그 산물로 각각 DGES를 실시하였으나, 이 경우 이형 다양성으로 판별하기 위해서 보다 많은 시간이 소요될 수 있으므로 본 실험에서는 우선 넙치의 ND4와 cytochrome b 염기서열에서 (AB028664, 38-1371) 5개 영역 (ND4-1, 2, 3) PCR 산물을 한 번에 DGES를 실시하여 밴드의 차이가 있는지를 먼저 알아보았으며(Fig.
- DNA를 사용하였다. 이들의 DNA polymorphism 을 관찰하기 위하여 DGES 방법을 이용하였으며, 보다 명확한 검증을 위하여 DGES에 사용된 PCR 생산 DNA를 사용하여 DNA 염기서열 분석을 병행하여, 넙치 원산지 판별을 위한 유의성 있는 기초 자료를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- Cytochrome b 영역 (NC_002386, 14408-15548)에서는 5개의 영역으로 나눠 PCR을 실시하였으며, 이를 바탕으로 DGES 를 실시하였는데 5개의 영역에서 모두 동일한 밴드 분포를 관찰하였다(Fig. IB, Fig. 5).
- Genbank 검색을 통하여 NADH dehydrogenase subunit 4 (ND-4, AB028664)와 cytochrome b (AF370628) 유전자에 대한 염기서열을 확인하고 약 250 bp 내외의 PCR 산물이 얻어지도록 프라이머 set를 고안하였다(Table 1 and 2). 충분한 양의 DNA를 얻기 위하여 여러 부위에서 프라이머 set를 고안하였으며, DGES 전기영동에서 DNA melting이 적당한 속도로 지연되게 하기 위하여 각각의 sense 프라이머의 5' 말단부위에 CCCGGG 염기서열을 부착시켰다.
- S Scientific, USA) 장치를 응용하였는데 multiplex PCR 대신 여러 종류의 어류에 대한 PCR DNA를 동시에 진행하기 위하여 원래의 TDGS에서 사용하는 수평 전기영동을 생략하고 수직 전기영동만을 하기 위한 comb을 제작하여 이용하였으며, 수직 전기영동을 위한 gradient denature gel을 만들었다. Gradient gel 조성은 90% urea-formamide (UF) solution (10% acrylamide/bis-acryl- amide solution 37.5:1, 50 x TAE buffer, 6.6 M urea, 36% deionized formamide: ddHQ를 첨가하여 1 1 를 만든다)과 30% UF solution (25% acrylamide/bis-acrylamide solution, 50x TAE buffer, 2.2 M urea, 12% deionized formamide ddHQ를 첨가하여 1 1 를 만든다)으로 만들었으며, 각각을 오른쪽 chamber에는 90% UF solution 13 ml을, 왼쪽 chamber 에는 30% UF solution 13 ml을 넣어 두 용액이 점차로 섞이면서 plate에 들어가도록 펌프를 이용하여 미리 제작된 plate 예 넣고 acrylamide gel을 제작하였다,
- 충분한 양의 DNA를 얻기 위하여 여러 부위에서 프라이머 set를 고안하였으며, DGES 전기영동에서 DNA melting이 적당한 속도로 지연되게 하기 위하여 각각의 sense 프라이머의 5' 말단부위에 CCCGGG 염기서열을 부착시켰다. PCR 프라이머로 고안된 염기서열은 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystem, USA)를 이용하여 제작한 다음, 에탄올과 3 M sodium acetate로 침 전시켜 최종적으로 30 pM 농도로 만들어 사용하였다.
- 각각 냉동 보관된 넙치의 간장에서 mitochondria DNA를 얻기 위하여 일반적인 세포 DNA 추출 방법을 사용하였다 (Qiagen, Germany). 약 70 mg의 간조직을 세절한 뒤, lysis 완충액 9.
- 각각의 넙치 mitochondria DNA를 이용한 DGES의 결과와 비교분석하기 위하여 DGES에 사용된 PCR 생산 DNA를 순수 분리하여, DNA를 0.5~1 ug/111 로 농축시킨 후에, 염기서열 검색을 시행하였다(ABI 3730X1, Macrogen Co. Seoul, Korea).
- 각각의 지역에서 얻은 넙치의 ND-4 유전자 변이가 있는지를 검색하기 위하여 ND-4 유전자를 5구역으로 나누어 DGES를 실시해서 degenerating DNA 밴드의 변화를 관찰하였다(Fig. 1A). ND-4의 첫째 구역(AB028664, 38-279)에서는 degenerating DNA의 다양성이 관찰되지 않았으며 (Fig.
- 넙치 ND-4 유전자의 DGES관찰에서 보이는 DNA 다양성을 확인하기 위하여 각 지역별로 대표되는 넙치의 mitochondria DNA를 사용하여 얻은 각각의 PCR 산물 DNA를 염기서열 분석하였다(Table 3). 그결과 ND-4-1 영역은 주문진 부근의 동해산 넙치, 통영 및 거제의 양식 넙치, 그리고 북한 해역 동해산 넙치의 ND-4-1 염기서열이 GenBank의 ND-4 (AB028664)의 일부영역에서 일치하는 염기서열을 보였다(Data not shown).
- 본 연구에서는 Ham 등(2002)이 이용한 방법으로 TDGS 장치에서 특이적 DNA 다양성을 관찰하기 위한 것으로 4개 지역의 3개 샘플로 총 12개의 샘플을 하나의 gel에 동시에 진행시켜 넙치 유전자에 존재하는 이형다양성을 관찰하였다. 본 실험도 60℃의 TEA 완충액 내에서 deionided formamide 가 포함되어 있는 acrylamide geb을 이용하여 DNA melting 과 denature가 이루어지게 되는데[13], 이를 효과적으로 실행하기 위하여, PCR에 사용되는 프라이머 5' 쪽에 GGGCCC 의 염기를 첨가하여 DNA melting 속도를 조절하여 단일한 ssDNA에서 전이가 생긴 경우에 DNA melting 후, single strand conformation polymorphism으로 다른 지역의 샘플과 DNA 변이가 나타나므로 그 변이를 관찰할 수 있었다[9, 14], 우선 각각의 DNA 영역을 개별적으로 PCR 한 후, 그 산물로 각각 DGES를 실시하였으나, 이 경우 이형 다양성으로 판별하기 위해서 보다 많은 시간이 소요될 수 있으므로 본 실험에서는 우선 넙치의 ND4와 cytochrome b 염기서열에서 (AB028664, 38-1371) 5개 영역 (ND4-1, 2, 3) PCR 산물을 한 번에 DGES를 실시하여 밴드의 차이가 있는지를 먼저 알아보았으며(Fig. 1), 연이어서 DNA 염기서열을 확인함으로써 정확한 DNA 다양성을 판별할 수 있었다. 결과적으로 지역 간 개체의 유전자 변이가 넙치의 ND-4 유전자에서는 ND- 4-2와 ND-4-3 영역에서 집중적으로 관찰되었으며, 넙치의 cytochrome b 유전자에서는 지역간 개체의 유전자 변이가 발견되지 않았다.
- 본 연구에서 이용된 DGES는 two dimensional gel elec- trophoresis (TDGS; C.B.S Scientific, USA) 장치를 응용하였는데 multiplex PCR 대신 여러 종류의 어류에 대한 PCR DNA를 동시에 진행하기 위하여 원래의 TDGS에서 사용하는 수평 전기영동을 생략하고 수직 전기영동만을 하기 위한 comb을 제작하여 이용하였으며, 수직 전기영동을 위한 gradient denature gel을 만들었다. Gradient gel 조성은 90% urea-formamide (UF) solution (10% acrylamide/bis-acryl- amide solution 37.
- Germany). 약 70 mg의 간조직을 세절한 뒤, lysis 완충액 9.5 ml (800 mM guanidine HC1; 30 mM Tris-HCl, pH 8.0; 30 mM EDTA, pH 8.0; 5% Tween-20; 0.5% Triton X-100) 와 RNase (100 mg/ml) 19 μl을 넣어 homogenize 한 다음, 50 ml tube에 옮기고 proteinase K (20 mg/ml) 0.5 ml 를 첨가하여 잘 혼합한 후, 50℃ 에서 2시간 동안 용해시 켰으며 Genomic-tip 100/G에 여러 번 여과시킴으로서 mitochondria DNA를 추출하였다(Blood & Cell Culture DNA Midi Kit, Qiagen, Germany). 추출된 DNA 용액에 0.
- 전기영동이 끝난 후, g이을 ethidium bromide (0.5 μg/ml)로 염색한 후자 외선 검출기와 Image Pro싀.0 (Media Cybernetics, MA, USA) analysis system으로 분석하였다.
- 주문진 근해의 동해산 넙치, 통영과 거제의 양식산 넙치, 그리고 북한 해역의 동해산 넙치를 이용하여 넙치 ND-4와 cytochrome b 유전자의 다양성을 관찰하기 위하여 DGES와 DNA 염기서열 검색을 병행하였는데, 각각의 다른 지역에서 얻은 넙치들은 ND4-2와 ND4-3 영역에서 특징적인 DNA 다양성이 있었으나 넙치의 cytochrome b 유전자에서는 지역 간의 차이를 보이는 유전자 변이가 발견되지 않았다. 따라서 본 연구에서 넙치의 지역별 차이를 구별하는 원산지 판별에는 사용된 DGES와 DNA 염기서열 검색 방법이 효과적이었으며, 넙치의 유전자에서는 개체간의 변이가 ND-4-2와 ND- 4-3 영역에서 구별되는 유전자 다양성이 관찰되었으므로, 넙치의 원산지 판정을 위한 유전자 검사에는 ND4-2와 ND4-3 영역의 검색이 필요하다.
- Biosystem, USA). 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel 상에서 100 V로 40분간 전기영동한 다음, ethidium bromide (0.5 ug/ml)에 염 색하여 Image Pro4.0 (Media Cybernetics, MA, USA) analysis system으로 분석하였다.
- 0)을 첨가하여 DNA를 용해시켰다. 추출된 DNA는 파장 260 nM와 280 nM에서의 흡광도를 측정하여 농도와 순도를 확인하였으며, 정량된 DNA는 PCR의 주형 DNA로 이용하였다.
- 충분한 양의 DNA를 얻기 위하여 여러 부위에서 프라이머 set를 고안하였으며, DGES 전기영동에서 DNA melting이 적당한 속도로 지연되게 하기 위하여 각각의 sense 프라이머의 5' 말단부위에 CCCGGG 염기서열을 부착시켰다. PCR 프라이머로 고안된 염기서열은 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystem, USA)를 이용하여 제작한 다음, 에탄올과 3 M sodium acetate로 침 전시켜 최종적으로 30 pM 농도로 만들어 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 주문진 근처 동해산 넙치와 북한 해역의 넙치 그리고 경상남도 통영과 거제에서 양식된 넙치를 사용하였는데 각각의 신선한 시료의 간장을 채취하여 -80℃에 냉동 보관하였으며, 필요에 따라 일부를 적출하여 연구에 사용하였다.
- 본 연구에서는 해양생물의 원산지 판정법을 개발하기 위하여 염기서열이 잘 알려져 있는 넙치의 mtDNA에서 ND-4 와 cytochrome b 유전자를 검색하였는데, 편의상 우리나라 동해안, 통영, 거제, 북한 등 4개 지역에서 얻은 넙치의 mitochondria DNA를 사용하였다. 이들의 DNA polymorphism 을 관찰하기 위하여 DGES 방법을 이용하였으며, 보다 명확한 검증을 위하여 DGES에 사용된 PCR 생산 DNA를 사용하여 DNA 염기서열 분석을 병행하여, 넙치 원산지 판별을 위한 유의성 있는 기초 자료를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
이론/모형
- 각각의 넙치 시료의 mitochondria DNA를 사용하여 PCR 방법으로 ND~4와 cytochrome b 유전자를 증폭시켰다[17]. PCR 반응액은 0.
성능/효과
- 이동 위치 이상을 관찰하는 방법이다. DNA 다양성을 알기 위하여 real time PCR (polymerase chain reaction) 사용되 기도 하는데 real time PCRe 비록 그 방법이 매우 간단하고 정량적인 분석이 가능하지만 염기서열의 다양성 검색보다는 비교적 부정확한 결과를 보인다. 이에 비하여 DGES 는 시험 방법이 다소 어렵지만 넓은 범위의 유전자를 동시에 검사할 수 있고 특정 유전자의 다양성을 일차적으로 조사하는데 효과적인 결과를 보인다[9].
- ND-4-2 영역에서는 GenBank의 넙치 ND-4 염기서열과 비교한 결과 거제의 양식산 넙치는 Genbank 기록과 일치하였으나 주문진 근해의 동해산 넙치와 통영 양식산 넙치들은 G390A와 C402T의 DNA 변이가 관찰되고 북한 해역의 동해산 넙치는 G390A, C402T그리고 A411G의 DNA 변이가 확인되었다. 따라서 ND4-2 영역에서는 ND-4 염기서열의 380- 420 사이에만 DNA 변이가 나타났다(Fig.
- ND-4-3 영역에서는 GenBank 의 넙치 ND-4 염기서열과 비교한 결과 주문진 근해의 동해산 넙치, 통영 및 거제의 양식산 넙치, 그리고 북한 해역의 동해산 넙치 모두 특징적인 DNA 변이가 발견되었다. 주문진 근해의 동해산 넙치는 C515G, C538T, G714A, C736T, G756A, A759T, 그리고 T817C의 DNA 변이가 있었으며, 통영의 양식산 넙치는 C515G, A567G, G756A, T817C, 그리고 T829G의 DNA 변이가 있었고, 거제의 양식산 넙치는 C515del, C537T, C538T, 그리고 T829G의 DNA 변이가 있었다.
- 1A). ND-4의 첫째 구역(AB028664, 38-279)에서는 degenerating DNA의 다양성이 관찰되지 않았으며 (Fig. 1A-R1), ND4의 둘째 구역은 주문진 근해 동해산 넙치에서는 degenerating DNA의 다양성이 드물게 보이고(Fig. 1A- R2-l, 2, 3 lanes), 통영 양식산 넙치 (Fig. lA-R2-4, 5, 6 lanes) 와북한 해역 동해산 넙치에서(Fig. 1A-R2-1OZ11Z12 lanes) degenerating DNA에서 다수의 다양성이 관찰되었다.
- 따라서 넙치의 유전자 다양성을 이용하여 넙치 원산지를 판정하기 위해서는 ND-4-2와 ND-4-3 영역을 검사하는 것이 적절하며, 본 연구에 사용된 넙치는 우리나라 해안의 4군데(주문진 해역, 통영과 거제의 양식장, 북한의 동해안)에서 얻어진 넙치로서 ND- 4-2와 ND4-3를 제외한 유전자 영역에서는 모두 일치되는 염기서열을 보였으므로 개체간 연관성이 매우 높은 것으로 추정된다. 결과적으로 넙치의 ND4-2와 ND-4-3 영역은 유전적으로 개체간 유전자 변이가 쉽게 발생되어 질 수 있는 영역으로 추측된다.
- 1), 연이어서 DNA 염기서열을 확인함으로써 정확한 DNA 다양성을 판별할 수 있었다. 결과적으로 지역 간 개체의 유전자 변이가 넙치의 ND-4 유전자에서는 ND- 4-2와 ND-4-3 영역에서 집중적으로 관찰되었으며, 넙치의 cytochrome b 유전자에서는 지역간 개체의 유전자 변이가 발견되지 않았다.
- 분석하였다(Table 3). 그결과 ND-4-1 영역은 주문진 부근의 동해산 넙치, 통영 및 거제의 양식 넙치, 그리고 북한 해역 동해산 넙치의 ND-4-1 염기서열이 GenBank의 ND-4 (AB028664)의 일부영역에서 일치하는 염기서열을 보였다(Data not shown).
- 따라서 본 연구에서는 유용한 어종으로 잘 알려진 넙치를 선택하여 보다 근본적인 방법으로 이러한 원산지를 판별하기 위하여, 최근에 유전자의 다양성을 판별하기 위해 개발된 degenerating gel electrophoresis scanning (DGES) 방법을 사용하였다[4]. 넙치는 식용으로 많이 사용되므로 양식 산업이 잘 발달되어 있고, 넙치의 전체 mtDNA 염기서열이 GenBank 에 이미 기록되어 있으며 넙치의 계통발생학적 연구가 활발히 진행되고 있으므로 본 연구를 보다 효과적으로 수행할 수 있었다.
- 넙치의 ND-4-2 영역의 유전자 변이는 먼저 DGES 검색으로 파악되었는데 거제의 양식산 넙치의 ND-4-2 DNA는 degenerating gel에서 전기영동의 이동 거리 변화를 보이지 않았으나 주문진 근해의 동해산 넙치, 통영의 양식산 넙치, 그리고 북한 해역의 동해산 넙치들에서는 모두 특이한 degenerating DNA band를 보였으며, 이들 DNA를 염기서열 분석한 결과 G390A, C402T, 그리고 A411G의 유전자 변이를 확인하였다. 특히 넙치의 ND43에서는 매우 빈번한 유전자 변이가 발견되었는데, 우선 DGES 검색에서 매우 다양한 크기의 degenerating DNA band가 관찰되 었고 이들 DNA들을 각각 염기서열 분석한 결과 ND-4-3 DNA 영역에서 C515G, C537T, C538T, A567G, G714A, C736T, G756A, A759T, T817C, 그리고 T829G 등의 빈번한 DNA 변이가 확인되었다.
- 따라서 ND4-2 영역에서는 ND-4 염기서열의 380- 420 사이에만 DNA 변이가 나타났다(Fig. 2, Fig. 4A).
- 한편, 북한 해역의 동해산 넙치에서는 C515G, C538T, G756A, 그리고 T817C의 DNA 변이가 있었다. 따라서 넙치의 ND-4-3 영역에서는 ND-4 염기서열 510-550 그리고 740-840 사이에 DNA 변이가 집중되어 나타났다(Fig. 3, Fig. 4B).
- 반면에 본 연구에서 조사한 4 군데의 지역에서 얻은 넙치들은 ND-4-1, ND-4-4, 그리고 ND-4-5 영역에서 DNA 변이가 발견되지 않았으며, 넙치의 cytochrome b 유전자를 5 영역으로 나누어 조사하였으나 DGES와 DNA 염기서열 분석에서 모두 DNA 변이가 발견되지 않았다. 따라서 넙치의 유전자 다양성을 이용하여 넙치 원산지를 판정하기 위해서는 ND-4-2와 ND-4-3 영역을 검사하는 것이 적절하며, 본 연구에 사용된 넙치는 우리나라 해안의 4군데(주문진 해역, 통영과 거제의 양식장, 북한의 동해안)에서 얻어진 넙치로서 ND- 4-2와 ND4-3를 제외한 유전자 영역에서는 모두 일치되는 염기서열을 보였으므로 개체간 연관성이 매우 높은 것으로 추정된다. 결과적으로 넙치의 ND4-2와 ND-4-3 영역은 유전적으로 개체간 유전자 변이가 쉽게 발생되어 질 수 있는 영역으로 추측된다.
- 분석을 시도하기 어려운 실정이다. 따라서 여러 종류의 유전자와 커다란 유전자를 신속하게 검색하기 위해서는 DGES와 같은 방법이 유용한데, 본 연구에서 얻은 결과를 자세히 분석하자면 DGES가 DNA 변이의 가능성을 예측할 수는 있지만 아직도 DGES의 degenerating DNA band 변화만을 보고 DNA 변이가 발생하였는가 정확하게 판정하기는 어려우며, 특히 여러 개의 DNA 변이가 생겼을 때는 몇 개의 DNA 변이가 발생하였는지를 예측할 수가 없다. 그러므로 DGES 방법은 유전자 변이를 쉽게 예측하는 방편으로 사용될 수 있으나 유전자 변이를 확인하기 위해서는 반드시 DNA 염기서열을 확인해야 할 것이다.
- 특히 넙치의 ND43에서는 매우 빈번한 유전자 변이가 발견되었는데, 우선 DGES 검색에서 매우 다양한 크기의 degenerating DNA band가 관찰되 었고 이들 DNA들을 각각 염기서열 분석한 결과 ND-4-3 DNA 영역에서 C515G, C537T, C538T, A567G, G714A, C736T, G756A, A759T, T817C, 그리고 T829G 등의 빈번한 DNA 변이가 확인되었다. 반면에 본 연구에서 조사한 4 군데의 지역에서 얻은 넙치들은 ND-4-1, ND-4-4, 그리고 ND-4-5 영역에서 DNA 변이가 발견되지 않았으며, 넙치의 cytochrome b 유전자를 5 영역으로 나누어 조사하였으나 DGES와 DNA 염기서열 분석에서 모두 DNA 변이가 발견되지 않았다. 따라서 넙치의 유전자 다양성을 이용하여 넙치 원산지를 판정하기 위해서는 ND-4-2와 ND-4-3 영역을 검사하는 것이 적절하며, 본 연구에 사용된 넙치는 우리나라 해안의 4군데(주문진 해역, 통영과 거제의 양식장, 북한의 동해안)에서 얻어진 넙치로서 ND- 4-2와 ND4-3를 제외한 유전자 영역에서는 모두 일치되는 염기서열을 보였으므로 개체간 연관성이 매우 높은 것으로 추정된다.
- 본 실험에서 이용한 DGES 방법은 TDGS 방법을 응용한 것으로, 여러쌍의 프라이머들을 이용하여 multiplex PCR을 하는데 mitochondria DNA와 같은 커다란 유전자를 동시 에 검색할 수 있다. 일반적으로 TDGS는 5~ 10개 정도의 multiplex PCR 산물을 수평 방향으로 전기영동을 실시한 다음 다시 DNA 크기 별로 구분하기 위해 2차 수직 방향의 denature and gradient gel을 전기영동하여 각각의 단일 가닥의 DNA (ssDNA)의 다양성을 구별할 수 있는 방법이다[9, 15].
- 주문진 근해의 동해산 넙치, 통영 및 거제의 양식 넙치, 그리고 북한 해역 동해산 넙치의 Cyt b-lz 2, 3, 4, 5 영역의 PCR 생산 DNA를 염기서열 분석한 결과 GenBank에 기록된 cytochrome b (AF370628) 유전자의 염 기서 열과 동일한 염 기서 열을 보였다(Data not shown).
- 변이가 발견되었다. 주문진 근해의 동해산 넙치는 C515G, C538T, G714A, C736T, G756A, A759T, 그리고 T817C의 DNA 변이가 있었으며, 통영의 양식산 넙치는 C515G, A567G, G756A, T817C, 그리고 T829G의 DNA 변이가 있었고, 거제의 양식산 넙치는 C515del, C537T, C538T, 그리고 T829G의 DNA 변이가 있었다. 한편, 북한 해역의 동해산 넙치에서는 C515G, C538T, G756A, 그리고 T817C의 DNA 변이가 있었다.
- 특히 넙치의 ND43에서는 매우 빈번한 유전자 변이가 발견되었는데, 우선 DGES 검색에서 매우 다양한 크기의 degenerating DNA band가 관찰되 었고 이들 DNA들을 각각 염기서열 분석한 결과 ND-4-3 DNA 영역에서 C515G, C537T, C538T, A567G, G714A, C736T, G756A, A759T, T817C, 그리고 T829G 등의 빈번한 DNA 변이가 확인되었다. 반면에 본 연구에서 조사한 4 군데의 지역에서 얻은 넙치들은 ND-4-1, ND-4-4, 그리고 ND-4-5 영역에서 DNA 변이가 발견되지 않았으며, 넙치의 cytochrome b 유전자를 5 영역으로 나누어 조사하였으나 DGES와 DNA 염기서열 분석에서 모두 DNA 변이가 발견되지 않았다.
후속연구
- 따라서 여러 종류의 유전자와 커다란 유전자를 신속하게 검색하기 위해서는 DGES와 같은 방법이 유용한데, 본 연구에서 얻은 결과를 자세히 분석하자면 DGES가 DNA 변이의 가능성을 예측할 수는 있지만 아직도 DGES의 degenerating DNA band 변화만을 보고 DNA 변이가 발생하였는가 정확하게 판정하기는 어려우며, 특히 여러 개의 DNA 변이가 생겼을 때는 몇 개의 DNA 변이가 발생하였는지를 예측할 수가 없다. 그러므로 DGES 방법은 유전자 변이를 쉽게 예측하는 방편으로 사용될 수 있으나 유전자 변이를 확인하기 위해서는 반드시 DNA 염기서열을 확인해야 할 것이다.
- 따라서 본 연구에서 넙치의 지역별 차이를 구별하는 원산지 판별에는 사용된 DGES와 DNA 염기서열 검색 방법이 효과적이었으며, 넙치의 유전자에서는 개체간의 변이가 ND-4-2와 ND- 4-3 영역에서 구별되는 유전자 다양성이 관찰되었으므로, 넙치의 원산지 판정을 위한 유전자 검사에는 ND4-2와 ND4-3 영역의 검색이 필요하다.
- 본 연구에서 사용된 DGES 방법은 비록 원래의 TDGS (two dimensional gel electrophoresis scanning) 방법을 개체 간 DNA 검색에 맞게 고안한 것이며 DGES를 위하여 urea, formamide 등의 농도와 gradient gel의 농도, 그리고 PCR 프라이머 DNA의 고안 등에 대한 조건을 맞추기 위하여 반복적인 연구를 수행하여 최적의 상태를 얻었으나 아직도 degenerating DNA melting이 동일한 재연성으로 완전하게 구별되는 DNA band를 확인하기 위하여는 향후 보다 심도 있는 연구가 더 필요할 것으로 여겨진다. 아울러 이러한 연구기법의 개선은 해양생물은 물론 다른 종류의 개체들에서 genomic 또는 mitochondria DNA를 사용하여 각각의 원산지 판정하는 방법을 개발하는데 중요한 도움이 될 것이다.
- 연구가 더 필요할 것으로 여겨진다. 아울러 이러한 연구기법의 개선은 해양생물은 물론 다른 종류의 개체들에서 genomic 또는 mitochondria DNA를 사용하여 각각의 원산지 판정하는 방법을 개발하는데 중요한 도움이 될 것이다.
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