RAW 264.7 Cell에서 세이지에 의한 염증성 Cytokine 및 iNOS억제 효과 Inhibitory Effect of Salvia officinalis on the Inflammatory Cytokines and Inducible Nitric Oxide Synthasis in Murine Macrophage RAW264.7원문보기
Primary pro-inflammatory cytokines are a trio: tumor necrosis- $\alpha$ (TNF-$\alpha$), interleukine-$\beta$ (IL-$\beta$), and interleukine-6 (IL-6). These cytokines initiate and regulate the acute-phase inflammatory response during infection, trauma, or s...
Primary pro-inflammatory cytokines are a trio: tumor necrosis- $\alpha$ (TNF-$\alpha$), interleukine-$\beta$ (IL-$\beta$), and interleukine-6 (IL-6). These cytokines initiate and regulate the acute-phase inflammatory response during infection, trauma, or stress and appear to play an important role in the immune process. Nitric oxide (NO) is a multi-functional mediator, which plays an important role in regulating various biological functions in vivo. NO production by inducible nitric oxide synthase (iNOS) in macrophages is essential for the defense mechanisms against microorganisms and tumor cells. However, over-expression of iNOS by various stimuli, resulting in over-production of NO, contributes to the pathogenesis of septic shock and some inflammatory and auto-immune disease. Solvent fractions of sage ( Salvia officinalis L.), which is cultivated in Jeju-Do, was assayed for their effects on TNF-$\alpha$ and IL-6 production in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. Hexane and ethylacetate (EtOAc) fraction of sage inhibited the protein and mRNA expression of TNF-$\alpha$ and IL-6 in LPS stimulated RAW 264.7 cells at the concentration of 100 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$. Also, incubation of RAW 264.7 cells with the fraction of hexane or EtOAc (50 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$) inhibited the LPS induced nitrite accumulation and the LPS/IFN-${\gamma}$ induced iNOS protein. And this inhibition of iNOS protein is concordant with the inhibition of iNOS mRNA expression. Above results suggest that extract of sage may have anti-inflammatory activity through the inhibition of pro-inflammatory cytokines (TNF-$\alpha$, IL-1$\beta$, IL-6), iNOS and NO.
Primary pro-inflammatory cytokines are a trio: tumor necrosis- $\alpha$ (TNF-$\alpha$), interleukine-$\beta$ (IL-$\beta$), and interleukine-6 (IL-6). These cytokines initiate and regulate the acute-phase inflammatory response during infection, trauma, or stress and appear to play an important role in the immune process. Nitric oxide (NO) is a multi-functional mediator, which plays an important role in regulating various biological functions in vivo. NO production by inducible nitric oxide synthase (iNOS) in macrophages is essential for the defense mechanisms against microorganisms and tumor cells. However, over-expression of iNOS by various stimuli, resulting in over-production of NO, contributes to the pathogenesis of septic shock and some inflammatory and auto-immune disease. Solvent fractions of sage ( Salvia officinalis L.), which is cultivated in Jeju-Do, was assayed for their effects on TNF-$\alpha$ and IL-6 production in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. Hexane and ethylacetate (EtOAc) fraction of sage inhibited the protein and mRNA expression of TNF-$\alpha$ and IL-6 in LPS stimulated RAW 264.7 cells at the concentration of 100 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$. Also, incubation of RAW 264.7 cells with the fraction of hexane or EtOAc (50 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$) inhibited the LPS induced nitrite accumulation and the LPS/IFN-${\gamma}$ induced iNOS protein. And this inhibition of iNOS protein is concordant with the inhibition of iNOS mRNA expression. Above results suggest that extract of sage may have anti-inflammatory activity through the inhibition of pro-inflammatory cytokines (TNF-$\alpha$, IL-1$\beta$, IL-6), iNOS and NO.
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문제 정의
일반적으로 꿀풀과에 많이 포함되어 있는 천연 정유는 면역성증강, 항암 및 노화억제 등 약리적인 효과와 항균, 항산화 활성 등을 가지고 있어 의약, 식품 및 화장품업계에서 이를 이용하려는 연구들이 활발하게 이루어지고 있다그 중 세이지의 생리활성에 의한 연구는 항산화 활성 연구에 많이 치중되어 왔으나 항염증과 관련된 연구는 미약한 수준이다. 1246)따라서, 본 논문에서는 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 세이지 추출물에 대한 TNF-a, IL-6 및 NO 생성억제효과를 조사하였으며 또한 iNOS의 유전자와 단백질 발현을 검색하였다.
제안 방법
RAW264.7 세포(1.5>를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 total RNA 추출은 TRI-reagent(MRC)를 이용하여 분리하였으며, 모든 실험은 RNase-free한 조건 하에서 이루어졌디-.
RAW264.7 세포에 1 卜ig/mZ의 LPS와 100 |ig/mN의 세이지 용매분획 추출물을 동시 처리하여 염증성 cytokine 억제 효과를 mouse ELISA kit를 이용하여 정량하였다. 그 결과 hexane 분획물과 EtOAc 분획물이 TNF-a를 각각 71.
RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 생성된 NO의 양은 Griess reagent로 측정하였다. RAW264.
Sage 용매분획 추출물의 NO 생성억제 활성 측정 세이지 용매분획 추출물이 iNOS의 산물인 NO 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Griess 시약을 이용하여 NO 생성량을 측정하였다. 1卩矽m2의 LPS와 세이지의 용매분획 추출물을 50昭/ml 농도로 처리하였을 때 LPS 단독 처리군에서 43.
1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 측정하기 위해 1차 항체로서 anti-mouse iNOS (1:1000)(Santa-Cruz)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2 시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG(Amersham Co.
2% agarose gel에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromideS. 염색하여 특정 band를 확인하였다. RT-PCR게서 사용된 primer는 Table I과 같다.
7 세포cells/mZ)를 24 microwell plate에 넣고 18시간 전 배양을 하였다. 이 후 배지를 제거하고, 시료와 LPS(1 卩刎)가 함유된 배지를 동시 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 2那]간 동안 배양하였다. 100 W의 배양액을 96 microwell plate에 넣고 동량의 Griess reagent[0.
이러한 과정을 설명하기 위하여 RAW 264.7 세포에 LPS(1 卩以 nd)로 자극시켜 세이지(Sage; Salvia officinalis L.)의 용매분획추출물을 세포독성이 없는 농도에서 처리하여 TNF-a, IL-6 생성을 관찰한 결고卜 hexane 분획물과 EtOAc 분획물이 TNF-a 생성과 IL-6 생성을 LPS 단독처리 군에 비하여 생성 억제효과를 나타내었다. 또한 hexane 분획물과 EtOAc 분획물이 TNF-a, IL- 邛, IL-6 유전자의 발현을 LPS 단독처리 군에 비하여 현저하게 억제하는 것을 확인 할 수 있었다.
대상 데이터
7 세포는 KCLB (Korean Cell Line Ba아c)로부터 분양 받아 100 units/m/ penicillin-streptomycin2 3 * *]- 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3~4일에 한번씩 시행하였다. Lipopolys- accharide(LPS. E. coll serotype 0111: B4)는 Sigma로부터 구입히여 사용하였으며, Interferon-7(mIFN-Y, recombinant E. coll) 는 Roche로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
Murine macrophage cell line인 RAW264.7 세포는 KCLB (Korean Cell Line Ba아c)로부터 분양 받아 100 units/m/ penicillin-streptomycin2 3 * *]- 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3~4일에 한번씩 시행하였다. Lipopolys- accharide(LPS.
5><1()6 cells/mZ)를 18 시간 전 배잉하고 시험 약물과 LPS(최종농도 叩以m/>를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 total RNA 추출은 TRI-reagent(MRC)를 이용하여 분리하였으며, 모든 실험은 RNase-free한 조건 하에서 이루어졌디-. cDNA 합성은 Improm-II™ cDNA kit(Promega)를 이용하였고., 1 卩g의 total RNA를 oligo(dT)18 primer; dNTP(().
미세말 시료(65 g)를 80% methan이(MeOH)로 2회 교반 추출 후 여과하여 감압농축하여용매를 중발시켰다. 여기에서 얻은 MeOH 추출물(12.18 g)을 계통적 추출 방법에 의하여 hexane 분획(1.45 g), ethylacetate (EtOAc) 분획 (1.73 g), butanol(n-BuOH) 분획 (L22 g), H2O 분획 (4.97 g)을 얻어 실험시료로 사용하였다(Fig. 1).
제주도에서 재배되고 있는 세이지 지상부를 채집하여 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세말로 하였다. 미세말 시료(65 g)를 80% methan이(MeOH)로 2회 교반 추출 후 여과하여 감압농축하여용매를 중발시켰다.
이론/모형
RAW264.7 세포에서 iNOS의 mRNA 발현을 RT-PCR 방법으로 조사하였다. 1卩刎의 LPS와 세이지의 용매분획 추출물을 50 ng/m/ 농도로 처리하였을 때, hexane 분획물이 가장 강한 발현 억제효과를 나타내었고, EtOAc 분획물과 BuOH 분획물에서도 iNOS 발현이 현저하게 저해되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
RAW264.7 세포에서 염증성 cytokine인 TNF-a, IL-6와 IL-ip 를 mRNA 수준에서 RT-PCR 방법으로 분석하였다. Ipg/mZ의 LPS와 세이지의 용매분획 추출물을 100 卩如 농도로 처리하였을 때 hexane, EtOAc 분획물이 TNF-a와 IL-6 발현을 강하게 억제하였으며, hexane 분획물이 IL-ip 발현을 강하게 억제하였고, EtOAc 분획물은 약한 IL-ip 발현 억제 효과를 보였다(Fig.
3). 그리고, iNOS의 protein level에 미치는 억제효과를 Immunoblot 방법으로 분석하였다. Hexane 분획물과 EtOAc 분획물에서 iNOS 단백질이 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
성능/효과
7 세포에서 iNOS의 mRNA 발현을 RT-PCR 방법으로 조사하였다. 1卩刎의 LPS와 세이지의 용매분획 추출물을 50 ng/m/ 농도로 처리하였을 때, hexane 분획물이 가장 강한 발현 억제효과를 나타내었고, EtOAc 분획물과 BuOH 분획물에서도 iNOS 발현이 현저하게 저해되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 그리고, iNOS의 protein level에 미치는 억제효과를 Immunoblot 방법으로 분석하였다.
그리고, iNOS의 protein level에 미치는 억제효과를 Immunoblot 방법으로 분석하였다. Hexane 분획물과 EtOAc 분획물에서 iNOS 단백질이 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).
5(A)). Hexane 분획물과 EtOAc 분획물을 농도별로 처리하였을 때, 농도 의존적으로 NO 생성량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5(B), 5(C)).
7 세포에서 염증성 cytokine인 TNF-a, IL-6와 IL-ip 를 mRNA 수준에서 RT-PCR 방법으로 분석하였다. Ipg/mZ의 LPS와 세이지의 용매분획 추출물을 100 卩如 농도로 처리하였을 때 hexane, EtOAc 분획물이 TNF-a와 IL-6 발현을 강하게 억제하였으며, hexane 분획물이 IL-ip 발현을 강하게 억제하였고, EtOAc 분획물은 약한 IL-ip 발현 억제 효과를 보였다(Fig. 2).
7 세포에 1 卜ig/mZ의 LPS와 100 |ig/mN의 세이지 용매분획 추출물을 동시 처리하여 염증성 cytokine 억제 효과를 mouse ELISA kit를 이용하여 정량하였다. 그 결과 hexane 분획물과 EtOAc 분획물이 TNF-a를 각각 71.0%, 33.1%, IL-6를 각각 78.1%, 70.2% 억제하였다(Eble II). 또한 실험에 사용된 농도는 세포독성 평가에서 독성을 나타내지 않았다(결과는 나타내지 않음).
그리고, LPS에 의한 iNOS의 발현 정도를 mRNA 수준과 단백질 수준에서 관찰한 결과 hexane 분획물과 EtOAc 분획물이 LPS 단독처리 군에 비하여 iNOS 발현을 현저하게 억제시키는것을 확인 할 수 있었고, iNOS의 산물인 NO 생성량도 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 , NO의 생성 억제는 iNOS의발현 저해를 경유한 것임을 알 수 있었다.
것을 확인할 수 있었다. 따라서 , NO의 생성 억제는 iNOS의발현 저해를 경유한 것임을 알 수 있었다.25)이러한 iNOS 발현에는 NF-kB가 promoter로 작용하여 발현을 조절함으로써 이러한 유전자의 발현 조절물질 등의 활성도 연구되어야 한다.
)의 용매분획추출물을 세포독성이 없는 농도에서 처리하여 TNF-a, IL-6 생성을 관찰한 결고卜 hexane 분획물과 EtOAc 분획물이 TNF-a 생성과 IL-6 생성을 LPS 단독처리 군에 비하여 생성 억제효과를 나타내었다. 또한 hexane 분획물과 EtOAc 분획물이 TNF-a, IL- 邛, IL-6 유전자의 발현을 LPS 단독처리 군에 비하여 현저하게 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 염증 전구물질인 TNF-a, IL- 邛 그리고 IL-6은 in vivo 및 in 0", , 。에서 서로 상호작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 염증 반응을 일으키는 동안 일정하게 생성된다.
36(JM5. 생성되었으나 hexane 분획물과 EtOAc 분획물에서 각각 NO 생성량이 2.93 皿, 5.541洲로 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5(A)).
후속연구
따라서 , NO의 생성 억제는 iNOS의발현 저해를 경유한 것임을 알 수 있었다.25)이러한 iNOS 발현에는 NF-kB가 promoter로 작용하여 발현을 조절함으로써 이러한 유전자의 발현 조절물질 등의 활성도 연구되어야 한다. 본 실험 결과를 요약하면, 세이지의 hexane 분획물과 EtOAc 분획물에서 iNOS의 발현 및 NO 생성 그리고 TNF-a, IL-ip, IL- 6 생성을 강하게 억제되는 것을 알 수 있었으며, 세이지의 유효성분 추출을 통한 항염증 물질의 연구와 치료할 수 있는 염증 억제 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다.
25)이러한 iNOS 발현에는 NF-kB가 promoter로 작용하여 발현을 조절함으로써 이러한 유전자의 발현 조절물질 등의 활성도 연구되어야 한다. 본 실험 결과를 요약하면, 세이지의 hexane 분획물과 EtOAc 분획물에서 iNOS의 발현 및 NO 생성 그리고 TNF-a, IL-ip, IL- 6 생성을 강하게 억제되는 것을 알 수 있었으며, 세이지의 유효성분 추출을 통한 항염증 물질의 연구와 치료할 수 있는 염증 억제 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다.
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