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- I® 이와는 달리 저용량의 LPS를 투여하면 조직을 손상시키지는 않지만 호중구의 축적이나 TNF-a, IL-lp, IL-12 같은 염증 유발 사이토카인 을 유리하며 염증반응을 촉매한다.17)LPS에 의해 유도되는 조직의 손상은 여러 가지 사이토카인들의 발현과 밀접한 관계가 있다.18) 본 실험에서 LPS의 투여는 2시간으로 한정되어서 림프세 포의 수에는 영향을 미치지 않았다.
- 17)LPS에 의해 유도되는 조직의 손상은 여러 가지 사이토카인들의 발현과 밀접한 관계가 있다.18) 본 실험에서 LPS의 투여는 2시간으로 한정되어서 림프세 포의 수에는 영향을 미치지 않았다. 그러나 각 면역 장기에서 염증 유발 사이토카인의 발현을 증가 시켜 염증 반응을 유발 하였고, 또한 수은은 LPS에 의해 유발되는 사이토카인의 발현에 영향을 나타내었다.
제안 방법
- RT-PCR의 조건은 김 등의 방법7에 준하여 실험하였고 각각의 PCR cyclee 예비실험을 통해 최적화하였다. PCR 산물 25 W을 2% agarose 젤로 전 기영동하여 분리하고 ethidium bromide 용액으로 염색한 후 UN- SCAN-IT softwaref- 이용하여 수치화하였다. 각 사이토카인의 밴 드는 같은 샘플에서의 伊actin의 양으로 정량화하였다.
- 조직 내 RNA 분리는 Tbunoda와 Sharimi의 방베)을 이용하여 분리하였다. cDNA는 Superscript H(Life Technologies 사, USA)를 이용하여 만들고 RT-PCR를 이용하여 TNF-以, IFN-y, IL-ip, IL-12, 그리고 g-actin의 발현량을 분석하였다. RT-PCR의 조건은 김 등의 방법7에 준하여 실험하였고 각각의 PCR cyclee 예비실험을 통해 최적화하였다.
- 5% 포르말린이 함유된 PBS 용액에 재 부유 시켰다. 고정된 세포들은 세포 수용체 특이적 항체를 이용하여 EPICS XL-MCL flow cytometer로 유세포 분석하였다.
- 5 ppm의 농도로 음용수에 섞어 2주 동안 투여하였다. 대조군 동물은 증류수를 투여하였다. 매번 새롭게 만든 수은 용액을 이틀 간격으로 교체하였으며, 매일 생쥐의 체중과 섭취한 음용수 그리고 사료의 양을 기록하였다.
- 대조군 동물은 증류수를 투여하였다. 매번 새롭게 만든 수은 용액을 이틀 간격으로 교체하였으며, 매일 생쥐의 체중과 섭취한 음용수 그리고 사료의 양을 기록하였다. 수은 투여의 마지막 날 생쥐를 하룻동안 금식시키고 LPS(0.
- 2。) 본 실험 결과에서 수은 투여에 의해 흉선 CD8+ T 림 프세포수가 현저히 감소되었기 때문에 아마도 IL12가 CD8+ T 림프세포로의 분화를 위해 다량으로 발현된 것으로 추측된다. 본 실험에서 보여준 여러 가지 사이토카인의 발현 결과는 수은을 2주 동안 투여한 후 측정되었다. 사이토카인의 발현은 시간에 따라 변화됨으로 시간 의존적 点 실험을 하는 것이 이상적인 실험이라 사료된다.
- 매번 새롭게 만든 수은 용액을 이틀 간격으로 교체하였으며, 매일 생쥐의 체중과 섭취한 음용수 그리고 사료의 양을 기록하였다. 수은 투여의 마지막 날 생쥐를 하룻동안 금식시키고 LPS(0.5 ㎎/㎏)를 복강 내로 투여하고 2시간 후에 마취시킨 후 생쥐의 혈액과 비장, 그리고 흉선조직을 채취하였으며 각각의 장기의 무게를 기록하였다.
- 수은(mercuric chloride)을 0, 0.3, 1.5, 7.5, 37.5 ppm의 농도로 음용수에 섞어 2주 동안 투여하였다. 대조군 동물은 증류수를 투여하였다.
- 조직 내 RNA 분리는 Tbunoda와 Sharimi의 방베)을 이용하여 분리하였다. cDNA는 Superscript H(Life Technologies 사, USA)를 이용하여 만들고 RT-PCR를 이용하여 TNF-以, IFN-y, IL-ip, IL-12, 그리고 g-actin의 발현량을 분석하였다.
- 투여한 약물에 의한 간독성은 혈장 중 alanine aminotransferase (ALT)와 aspartate aminotransferase(AST) 를 Hitachi 912 automatic analyzer를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- Mercuric chloride, lipopolysaccharide(LPS) 및 tryphan blue는 Sigma 사로부터 구입하여 사용하였다. Hitachi 912 automatic analyzer는 Roche사(USA), Stomacher blender는 STOW (UK), EPICS XL-MCL flow cytometer는.
- 실험에 사용한 BALB/c계 수컷 생쥐(6주령)는 Harlan 사(USA) 에서 구입하여 온도 21℃, 상대습도 50% 및 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 빛을 조절한 동물 사육실에서 1주일 이상 순화 시켜 체중 25-30 g 범위의 것을 사용하였다.
데이터처리
- 각 실험 결과의 통계학적 분석은 SAS statistical software (SAS 사, USA)를 이용하였다. 수치의 분석은 one way analysis cif variance(ANOVA)와 post-hoc Duncan's Multiple Range test 법을 이용하였고 p<0.
- 각 실험 결과의 통계학적 분석은 SAS statistical software (SAS 사, USA)를 이용하였다. 수치의 분석은 one way analysis cif variance(ANOVA)와 post-hoc Duncan's Multiple Range test 법을 이용하였고 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Johnson과 Sharma의 방법地에 의하여 분리하였다. 즉 RPMI 배지에 보관시킨 조직을 Stomacher blender를 이용해 단일 세포 상태로 만들고 결합조직들은 120 μm 스크린을 이용하여 제거하였다.
- cDNA는 Superscript H(Life Technologies 사, USA)를 이용하여 만들고 RT-PCR를 이용하여 TNF-以, IFN-y, IL-ip, IL-12, 그리고 g-actin의 발현량을 분석하였다. RT-PCR의 조건은 김 등의 방법7에 준하여 실험하였고 각각의 PCR cyclee 예비실험을 통해 최적화하였다. PCR 산물 25 W을 2% agarose 젤로 전 기영동하여 분리하고 ethidium bromide 용액으로 염색한 후 UN- SCAN-IT softwaref- 이용하여 수치화하였다.
성능/효과
- 그러나 TNF-a, IL-1P 및 IL-12의 발현에는 영향이 없었다. LPS의 투여는 IFN-y, IL-ip 및 IL-12의 발현을 증가 시 켰고 37.5 ppm 수은 투여군은 LPS에 의한 IFN-7의 발현을 억제하였다. 흉선에서의 반응은 비장과 다른 양상으로 나타났다.
- 18) 본 실험에서 LPS의 투여는 2시간으로 한정되어서 림프세 포의 수에는 영향을 미치지 않았다. 그러나 각 면역 장기에서 염증 유발 사이토카인의 발현을 증가 시켜 염증 반응을 유발 하였고, 또한 수은은 LPS에 의해 유발되는 사이토카인의 발현에 영향을 나타내었다.
- 대표적인 독성물질 중의 하나인 수은은 생체 내로 투여되었을 때 독성을 일으키지 않는 범위인 저농도라 할지라도 비장과 흉선에서 T 림프 세포수를 감소시키고 사이토카인의 발현을 조절함으로 서 면역반응에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 즉 RPMI 배지에 보관시킨 조직을 Stomacher blender를 이용해 단일 세포 상태로 만들고 결합조직들은 120 μm 스크린을 이용하여 제거하였다. 분리한 세포는 RPMI 배지에 현탁 시 켰으며 tryphan blue 염색으로 생존율 검사 시 95% 이상의 생존율을 나타나었다. 분리된 세포들은 BYB(PBS with 1% bovine serum albumin and 0.
- 5㎎/㎏)를 복강 주사로 2시간 투여한 군에 대해 心 와 AST를 측정하였을 때 수은의 농도에 따라 약간 감소하였으나 유의성을 나타내지는 않았다(data not shown). 생쥐가 섭취한 사료와 음용수의 양은 가장 높은 농도의 수은 투여군 (37.5 ppm)에서만 감소되었다.
후속연구
- 수은은 면역억제에서부터 면역자극까 지 넓은 범위의 면역반응을 나타내는 특징을 가지고 있어 외부 물질에 의한 면역독성의 실험에서 가장 좋은 물질 중의 하나로 여겨지고 있다.用) 그러므로 면역계 특히 비장과 흉선 같은 면역 장기에서 수은의 영향과 LPS 같은 염증 유발물질에 의해 야기되는 사이토카인에 대한 연구는 면역조절의 현상 이해에 좋은 방향을 제시할 수 있으리라 사료된다.
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