[논문]Babesia bovis rap-1 및 B equi ema-1 intergenic 뉴클레오타이드에서 프로모터로 추정되는 위치 분석

곽동미

Babesia bovis rap-1 및 B equi ema-1 intergenic 뉴클레오타이드에서 프로모터로 추정되는 위치 분석
Analysis of putative promoter sites in Babesia bovis rap-l and B equi ema-l intergenic nucleotides 원문보기

韓國家畜衛生學會誌 = Korean journal of veterinary service, v.27 no.1, 2004년, pp.95 - 101

곽동미 (워싱턴주립대학교 수의과대학)

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Babesia bovis rap-1 and B equi ema-1 intergenic(IG) nucleotides were analyzed and compared for identifying putative promoter sites using computer programs. The reason to initiate this research was to determine if IG nucleotides of Babesia genes that are predicted to be involved in erythrocyte invasion have functions regulating gene transcription and translation, which can be applied to functional gene knockout. Four IG sequences used included BbIG5(B bovis rap-1 5' IG), BblG3(B bovis rap-1 3' IG), BeIG5(B equi ema-1 5' IG) and BeIG3(B equi ema-1 3' IG). BbIG5 contained a putative promoter at nucleotide 197-246 with a predicted TATA-box and a transcription start site. BbIG3 had a putative promoter at nucleotide 270-320 with two predicted TATA-boxes and a transcription start site. BeIG3 had a putative promoter at nucleotide 155-205 with a predicted TATA-box and a transcription start site. Putative promoter sites in these three sequences mentioned above were identified with score cutoff 0.8, which means detection of about 40% recognized promoters with 0.1-0.4% false positives. In contrast, BeIG5 had a putative promoter at nucleotide 163-213 with score cutoff 0.8, but neither TATA-box nor transcription start site were recognized. However, BeIG5 had a putative promoter at nucleotide 388-438 with a predicted TATA-box and a transcription start site when score cutoff was decreased to 0.18, which means detection of about 70% recognized promoters with 2.2-5.3% false positives. These sequences with putative promoters can be tested if they have functions regulating gene transcription and translation.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

Babesia spp에서 숙주적혈구의 침입에 관여할 것으로 가정되어온 B bovis RAP-1과 B equi EMA-1의 역할을 밝히기 위한 장기적 목표 하에서 이 연구를 진행하였다. RAP-1 과 EMA-1 의 역할을 밝히기 위한 전 단계로 이들 유전자들의 전사와 발현을 조절하는 프로모터로 예상되는 위치를 찾는 것이 이 연구의 목적이었다.
하에서 이 연구를 진행하였다. RAP-1 과 EMA-1 의 역할을 밝히기 위한 전 단계로 이들 유전자들의 전사와 발현을 조절하는 프로모터로 예상되는 위치를 찾는 것이 이 연구의 목적이었다. 프로모터를 찾음으로 나아가 각각의 유전자를 기능적으로 knockout함으로써 그 유전자의 기능을 밝힐 수 있을 것이다.
보고되었다9-11). 따라서, 5' 및 3' IG 뉴클레오타이드에서 프로모터 기능이 밝혀졌으므로, 이 연구는 기생충의 적혈구 침입에 관련이 있을 것으로 가정되는 mlT과 erm-1 유전자의 5' 및 3' IG 뉴클레오타이드를 이용하여 프로모터로 추정되는 위치와 프로모터에서의 중요한 부분인 TATA-box와 전사시작 위치(2)로 추정되는 위치를 밝혀 이에 보고한다. 프로모터 부분을 포함하는 DNA는 앞으로의 연구에서 rap-1과 ema-1 유전자가 어떻게 전사, 번역되는지를 밝히는 것과 이들 유전자의 기능을 밝히는데 이용될 수 있을 것으로 추정된다.
8 이상으로 하였다. 이것은 score 범위를 낮게 하였을 때 여러 sequence가 확인될 것을 예상하여 보다 높은 가능성을 나타내는 하나의 프로모터를 선택하기 위한 목적이었다. 이렇게 한 결과 모든 BbIG5, BbIG3, BeIG5 및 BeIG3 에서 각각 하나의 프로모터로 추정되는 부위가 확인되었다.

제안 방법

프로모터로 추정되는 위치를 찾기 위하여 Neural Network Promoter Prediction 프로그램을 이용하였으며 프로모터의 중요한 부분인 TATA-box 와전사시작위치를 확인하였다 (Table 1). 추정되는 뉴클레오타이드의 확인은 먼저 score 범위를 0.

대상 데이터

이 연구에서 사용된 B bovis rap-1 5' IG(BbIG5)와 3' IG(BbIG3) 뉴클레오타이드는 미국의 National Institue of Health 에 있는 National Center for Biotechnology Center (http:"www.ncbi.nlm.nih.gov/) 의 GenBank data base 에서 선택하였다 (accession no. 2731569). B egi의 ema-1 5' IG(BeIG5)와 3' IG(BeIG3) 뉴클레오타이드는 실험실에서 genomic DNA library를 구죽하는 중 ermtT을 포함하는 10 kb 유전자를 sequencing 하면서 밝혀졌다.
전체적인 sequence 배열은 San Diego Supercomputer Center Biology WorkBench (http://workbench.sdsc.edu/) 의 CLUSTALW를 사용하였으며 밝혀진 뉴클레오타이드 배열은 EMBnet의 BOXSHADE 3.21 (http://www.ch. embnet.org/software/BOX_form.html) 을 사용하였다. 예상되는 프로모터의 확인은 Neural Network Promoter Prediction(http:"www.

이론/모형

다음으로, 위에서 밝혀진 프로모터에서 TATA-box를 검정하기 위하여 Institute for Biomedical Technology의 Hamming-Clustering Method for TATA Signal Prediction in Eukaryotic Genes 프로그램을 이용하였다. Table 1에서 나타난 것처럼 각 프로모터에서 하나 또는 두 개의 TATA-box로 추정되는 부분들이 확인되었다.

성능/효과

4종의 sequences를 배열한 결과 6% 정도의 낮은 동일성을 보였다. 그러나, 특이한 것은 BbIG5와 BbIG3를 배열하였을 때 74%의 높은 동일성을 보였다.
B bovis rap-1과 B equi ema-1의 IG 뉴클레오타이드에서 프로모터로 추정되는 위치는 BbIG5 에서는 197-246 뉴클레 오타이 드에 서, BbIG3 에서는 270-320 뉴클레 오타이 드에 서, BeIG5에서는 388-438 뉴클레오타이드에서, 그리고 BeIG3에서는 155-205 뉴클레오타이드에서 각각 프로모터로 추정되는 위치가 확인되었으며, 각각의 TATA-box와 전사 시작 위치로 예상되는 위치도 확인되었다. 이 결과를 토대로 실제로 이들의 뉴클레오타이드에서 프로모터의 기능이 있는지를 밝힌 후 RAP-1 과 EMA-1의 기생충체 내에서의 역할도 밝힐 수 있을 것으로 생각된다.
2%의 false positive에 해당될 수 있을 것이다. 그러나, BeIG5에서 TATA-box와 전사 시작 위치 모두를 갖고 있는 프로모터를 찾기 위하여 score 범위를 0.18까지 낮추었을 때 388-438 뉴 클레오타이드가 확인되었다. 이 두 sequence가운데 어느 것이 실제로 프로모터 역할을 하는지를 밝히는 것은 서로 다른 범위의 뉴클레오타이드를 설정하여 클로닝, 형질전환 혹은 transfection을 함으로써 밝힐 수 있을 것이다.
이것은 score 범위를 낮게 하였을 때 여러 sequence가 확인될 것을 예상하여 보다 높은 가능성을 나타내는 하나의 프로모터를 선택하기 위한 목적이었다. 이렇게 한 결과 모든 BbIG5, BbIG3, BeIG5 및 BeIG3 에서 각각 하나의 프로모터로 추정되는 부위가 확인되었다. 또한, 이들 sequence는 각각 TATA-box 와전 사 시작 위치로 예측되는 부위를 지니고 있었다.
그러나, BeIG5 163-213 뉴클레오타이드에서는 TATA-box로 추정되는 부분들이 확인되지 않았다. 좀 더 많은 프로모터를 확인하기 위하여 score 범위를 0.18까지 낮추었을 때 BeIG5 388-438 뉴클레오타이드에서 TATA-box와 전사시작 위치로 추정되는 부분들이 확인되었다. Score 0.
확인된 각 프로모터에서 프로모터의 중요한 부분인 TATA-box와 전사시작 위치도 확인되었다. 여기서 밝혀진 프로모터 부위를 포함한 뉴 클레오타이드가 프로모터 기능을 갖고있는지를 밝히게 되면 이sequence를 사용하여 g-J과 ema-1 유전자의 전사와 발현을 조절할 수 있을 것이고 마침내는 이들 유전자를 기능적으로 kmockout함으로 이들의 기능을 밝힐 수 있을 것으로 추정된다.

후속연구

여기서 밝혀진 결과를 토대로 프로모터로 예측되는 sequence와 reporter 유전자인 luciferase 혹은 chloramphenicol acetyl transferase gene을 함께 복제하여 이들 효소의 활성을 확인함으로써 어느s sequence가 프로모터의 기능이 있는지를 밝힐 수 있을 것이다9-11) 더 나아가, 강한 프로모터의 기능이 있는 것을 선발하여 바베시아 기생충을 transfection하는데 이용할 수 있을 것으로 예상된다.
확인된 각 프로모터에서 프로모터의 중요한 부분인 TATA-box와 전사시작 위치도 확인되었다. 여기서 밝혀진 프로모터 부위를 포함한 뉴 클레오타이드가 프로모터 기능을 갖고있는지를 밝히게 되면 이sequence를 사용하여 g-J과 ema-1 유전자의 전사와 발현을 조절할 수 있을 것이고 마침내는 이들 유전자를 기능적으로 kmockout함으로 이들의 기능을 밝힐 수 있을 것으로 추정된다.
위치도 확인되었다. 이 결과를 토대로 실제로 이들의 뉴클레오타이드에서 프로모터의 기능이 있는지를 밝힌 후 RAP-1 과 EMA-1의 기생충체 내에서의 역할도 밝힐 수 있을 것으로 생각된다.
따라서, 5' 및 3' IG 뉴클레오타이드에서 프로모터 기능이 밝혀졌으므로, 이 연구는 기생충의 적혈구 침입에 관련이 있을 것으로 가정되는 mlT과 erm-1 유전자의 5' 및 3' IG 뉴클레오타이드를 이용하여 프로모터로 추정되는 위치와 프로모터에서의 중요한 부분인 TATA-box와 전사시작 위치(2)로 추정되는 위치를 밝혀 이에 보고한다. 프로모터 부분을 포함하는 DNA는 앞으로의 연구에서 rap-1과 ema-1 유전자가 어떻게 전사, 번역되는지를 밝히는 것과 이들 유전자의 기능을 밝히는데 이용될 수 있을 것으로 추정된다.
RAP-1 과 EMA-1 의 역할을 밝히기 위한 전 단계로 이들 유전자들의 전사와 발현을 조절하는 프로모터로 예상되는 위치를 찾는 것이 이 연구의 목적이었다. 프로모터를 찾음으로 나아가 각각의 유전자를 기능적으로 knockout함으로써 그 유전자의 기능을 밝힐 수 있을 것이다. 이 방법은 malaria 기생충에서 이미 사용되고 있다.

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상세보기
Liston DR, Johnson PJ 1999. Analysis of a ubiquitous promoter element in a primitive eukaryote: early evolution of the initiator element. Mol Cell Biol 19 : 2380-2388

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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