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문제 정의
- 본 실험은 사염화탄소 독성 에 대한 몇 가지의 식물소재들 - 솔잎, 콩나물, 인진쑥, 표고버섯 - 의 간보호 효과를 조사하기 위하여 수행되었다. 우선적으로 일차 간세포 배양실험에서 식물추출물(열수 또는 에탄올)을 첨가(20 mg/mL 배지)하고 2시간 후에 사염화탄소를 처리(5011L)한 결과, 배지내의 AST와 ALT 효소활성은 다음과 같았다.
- 본 연구는 우리가 일상생활에서 식용이나 약용으로 사용해 왔을 뿐만 아니라 주변에서 쉽 게 이용 가능한 인진쑥, 콩나물, 솔잎 및 표고버섯 등의 식물을 대상으로 식물의 특성 중에서 항산화적 기능성 을 조사하고자 하였다. 생 체 노출시 외래생체이물질로서 간손상을 유발하는 산업용 유기용매인 CC14 를 독성물질로 사용하여 (6) in vitro 및 in。沁。에서 이들 식물추출물의 간보호 효과를 혈액과 간조직을 대상으로 실시하였다.
제안 방법
- 간 조직으로부터 분리 한 microsome 분획을 CO gas로 1분간 기포가 생기는 약한 압력으로 포화시킨 후에 환원제로 sodium dithionite를 넣고 혼합하였을 때 생기는 환원된 microsome 분획 과 CO-microsome 복합체의 분획간의 차이를 400 -500 nm에서 스펙트럼을 그렸다. 450-490 nm에서 흡광도의 天]"이를 cytochrome P-450-CO complex에 의 한 흡광량으로 하고 cytochrome P-450 complex의 mole흡광계수 91 mM-1cm-1-g- 이용하여 cytochrome P-450 함량을 계산하고, 단백질 1 mg당 nmoles로 표시하였다.
- 또한 에 탄올 추출방법 은 열수 추출방법 과 동일한 과정을 통하여 에탄올 추출 시 료를 제조하였다. 각각의 추출물들은 흰쥐의 간세포 배양액에 직접 첨가하였거나, 또는 그 추출물을 곱게 분쇄하여 실험동물의 사료조제에 첨가하였다. 본 실험의 기본 식이는 AIN-76 식이조성(7)에 따랐고, 각각의 식물 추출물별 첨가 식이의 조성은 기본식이에 5%씩 포함되도록 조제하였다(Table 1).
- 간 조직에 처리한 사염화탄소의 독성유발에 대응하는 식물 추출물들의 세포보호 효능을 직접 확인하고자 200 〜 250 g 의 Sprague-Dawley 수컷 흰쥐를 사용하여 일차 간세포 배양을 수행하였다. 간세포의 분리는 Meijer 등의 방법(8)에따라 collagenase(Sigma, Type IV)용액을 간 조직내로 관류시 키는 방법으로 실시 하였다.
- 멸균된 petri-dish에 3X 1013개의 세포들을 분주하고 각각의 해 당 식 물추출물을 20 mg/mL 함유된 배지의 총배양액이 3 mL가 되도록 조정한 후에 CO2-배양기(5% CO2, 95% O2)에서 2시간 동안을 배양시켰다. 그다음에는 50 UL의 사염 화탄소(동량의 dimethyl sulfoxide에용해)를 배지에 첨가하였고, 2시간 후에 세포를 원심분리 (800 rpm, 4°C) 시켜 배지 내로 유출된 AST와 ALT의 효소활성 을 측정 하였다. 이 효소들의 활성은 Reitman과 Frankel 방법 (9)에 따라 AST/ALT 효소활성 측정용 kit(AM 1010- K)를 사용하였다.
- 실험 동물군별로 해당 식이를 3주 동안 급여한 후에 대조군을 제외한 실험군들에게 2일간 연속하여 olive oil과 사염화탄소(1 : 1)의 혼합액을 1 mL/kg 체중에 상응하는 용량을 2회 복강에 주사하였다. 단, 대조군은 사염 화탄소를 투여 하는 대신 동량의 olive oil만을 주사하였다. 모든 실험동물들은 2일 간의 사염화탄소를 모두 처리한 다음날 희생시켜 혈액과 간을 다음 실험에 사용되었다.
- 열수 추출방법은 음건 세절한 시료 200 g에 증류수 2 L를 가하고 환류냉각기에서 12시간 끓임을 2회 반복한 후에 감압 여 과한 여 과액을 동결 건조하여 열수 추출 시 료로 사용하였다. 또한 에 탄올 추출방법 은 열수 추출방법 과 동일한 과정을 통하여 에탄올 추출 시 료를 제조하였다. 각각의 추출물들은 흰쥐의 간세포 배양액에 직접 첨가하였거나, 또는 그 추출물을 곱게 분쇄하여 실험동물의 사료조제에 첨가하였다.
- 간세포의 분리는 Meijer 등의 방법(8)에따라 collagenase(Sigma, Type IV)용액을 간 조직내로 관류시 키는 방법으로 실시 하였다. 맨 처 음에 pentobarbital(5 mg/ 100 g 체중)로 마취된 쥐를 개복한 후에 문정맥에서 하대정맥 방향으로 Ca++-free Hank's buffer를 관류시 켜 간 조직 내의 혈액을 세척한 다음 하대정맥을 묶고 0.05% collagenase 용액을 상대정맥으로 보내면서 간세포 분리를 행하였다. 소화된 간 조직은 normal Hank's buffer(pH 7.
- 4%) 염색 후에 현미경상에서 세포수를 측정하였다. 멸균된 petri-dish에 3X 1013개의 세포들을 분주하고 각각의 해 당 식 물추출물을 20 mg/mL 함유된 배지의 총배양액이 3 mL가 되도록 조정한 후에 CO2-배양기(5% CO2, 95% O2)에서 2시간 동안을 배양시켰다. 그다음에는 50 UL의 사염 화탄소(동량의 dimethyl sulfoxide에용해)를 배지에 첨가하였고, 2시간 후에 세포를 원심분리 (800 rpm, 4°C) 시켜 배지 내로 유출된 AST와 ALT의 효소활성 을 측정 하였다.
- 각각의 추출물들은 흰쥐의 간세포 배양액에 직접 첨가하였거나, 또는 그 추출물을 곱게 분쇄하여 실험동물의 사료조제에 첨가하였다. 본 실험의 기본 식이는 AIN-76 식이조성(7)에 따랐고, 각각의 식물 추출물별 첨가 식이의 조성은 기본식이에 5%씩 포함되도록 조제하였다(Table 1).
- 05% collagenase 용액을 상대정맥으로 보내면서 간세포 분리를 행하였다. 소화된 간 조직은 normal Hank's buffer(pH 7.45)에 넣어 원심분리 (800 rpm, 4°C)를 한 다음 10% FBS와 항생제 (penicillin: 100 units/mL, streptomycin: 100 uL/mL)를 포함하는 DME 배지에 분산시켜 trypan-blue(0.4%) 염색 후에 현미경상에서 세포수를 측정하였다. 멸균된 petri-dish에 3X 1013개의 세포들을 분주하고 각각의 해 당 식 물추출물을 20 mg/mL 함유된 배지의 총배양액이 3 mL가 되도록 조정한 후에 CO2-배양기(5% CO2, 95% O2)에서 2시간 동안을 배양시켰다.
- 동물사육실의 온도는 20土2°C를 유지하였으며, 조명은 12시간 주기로 조절하였다. 실험 동물군별로 해당 식이를 3주 동안 급여한 후에 대조군을 제외한 실험군들에게 2일간 연속하여 olive oil과 사염화탄소(1 : 1)의 혼합액을 1 mL/kg 체중에 상응하는 용량을 2회 복강에 주사하였다. 단, 대조군은 사염 화탄소를 투여 하는 대신 동량의 olive oil만을 주사하였다.
- 에탄올과 열수로 추출된 4종류(솔잎, 콩나물, 인진쑥, 표고버섯)의 식 물 추출물에 의 한 간보호 효과를 확인하기 위해 사염화탄소를 처리한 일차 간세포 배양 배지 내(Table 2)와 사육동물의 혈청 내 (Table 3)로 유출된 AST 및 ALT의 효소활성을 각각 비교하였다. 이 미 잘 알려진 바와 같이, 혈청이나 배지 내 에서 이들 효소의 활성증가는 간세포 손상 유발물질에 의한 간세포들의 손상을 의미할 수 있다(15).
- 추출하였다. 열수 추출방법은 음건 세절한 시료 200 g에 증류수 2 L를 가하고 환류냉각기에서 12시간 끓임을 2회 반복한 후에 감압 여 과한 여 과액을 동결 건조하여 열수 추출 시 료로 사용하였다. 또한 에 탄올 추출방법 은 열수 추출방법 과 동일한 과정을 통하여 에탄올 추출 시 료를 제조하였다.
- 위하여 수행되었다. 우선적으로 일차 간세포 배양실험에서 식물추출물(열수 또는 에탄올)을 첨가(20 mg/mL 배지)하고 2시간 후에 사염화탄소를 처리(5011L)한 결과, 배지내의 AST와 ALT 효소활성은 다음과 같았다. 솔잎은 에탄올및 열수 추출물(p<0.
- 흰쥐가 평균체중(약150 g)으로 성 장한 후에 실험 목적 에 따라 3주 동안 기 본 식이 (정 상군), 또는 식 물소재 첨 가식 이 (실 험 군)를 해 당 군들에게 급여 하였다. 정 상군은 2군의 대조군과 사염 화탄소투여 군으로 나누었고, 실험군은 식 물소재 추출물의 첨가에 여부에 따라 4군의 솔잎첨가군, 콩나물첨가군, 인진쑥첨가군 및 표고버 섯 첨 가군으로 나누어 실 험 동물군은 총 6군으로 구분하였다. 동물사육실의 온도는 20土2°C를 유지하였으며, 조명은 12시간 주기로 조절하였다.
- 실험실 환경에 적응시켰다. 흰쥐가 평균체중(약150 g)으로 성 장한 후에 실험 목적 에 따라 3주 동안 기 본 식이 (정 상군), 또는 식 물소재 첨 가식 이 (실 험 군)를 해 당 군들에게 급여 하였다. 정 상군은 2군의 대조군과 사염 화탄소투여 군으로 나누었고, 실험군은 식 물소재 추출물의 첨가에 여부에 따라 4군의 솔잎첨가군, 콩나물첨가군, 인진쑥첨가군 및 표고버 섯 첨 가군으로 나누어 실 험 동물군은 총 6군으로 구분하였다.
대상 데이터
- (Costa Mesa, CA, USA)에서 구매 하여 AIN-%""?)에 따라 조제 하여 사용하였다. Aspartate aminotransferase(AST)오} alanine aminotransferase (ALT) 효소활성 측정용 kit는 아산제약(주)(서울, 한국) 제품을, 그 외의 시약은 특급이상의 제품을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 4종류의 식물성 소재들은 - 솔잎(pine leaf) Pinus strobus, 콩나물(soybean sprout), 인진쑥(mug wort) Artemisia capillaris 및 표고버 섯 (shiitake) Lentinus edodes - 응달에서 말린 후에 열수 및 에탄올로 추출하였다. 열수 추출방법은 음건 세절한 시료 200 g에 증류수 2 L를 가하고 환류냉각기에서 12시간 끓임을 2회 반복한 후에 감압 여 과한 여 과액을 동결 건조하여 열수 추출 시 료로 사용하였다.
- 실험 대상의 식물성 소재들은 모두 국내산으로 봄에 산에서 채취, 또는 시장에서 구매(강원, 한국)하여 사용하였다. Collagenase(Type IV), pentobarbital, fetal bovine serum (FBS), penicillindOO units/mL), streptomycin(100 uL/mL), trypan-blue, CCU, dimethyl sulfoxide, sodium dodecyl sul-fate(SDS), xanthine sodium(XOD), hypoxanthine, Hank's buffer(pH 7.
- 실험 동물은 이유한 후 1주령 이 된 Sprague-Dawley 종의 수컷 흰쥐를 분양받아 1주일간 시판 고형사료(삼양사료)를 급여하면서 실험실 환경에 적응시켰다. 흰쥐가 평균체중(약150 g)으로 성 장한 후에 실험 목적 에 따라 3주 동안 기 본 식이 (정 상군), 또는 식 물소재 첨 가식 이 (실 험 군)를 해 당 군들에게 급여 하였다.
- 독성물질로 사용하여 (6) in vitro 및 in。沁。에서 이들 식물추출물의 간보호 효과를 혈액과 간조직을 대상으로 실시하였다.
데이터처리
- **Significant test was performed by the Student's t-test (p< 0.01) in comparing to the values of CCI4-treated group.
- **Significant test was performed by the Student's t-test (p< 0.01) in comparing to the values of CCh'treated group.
- **Significant test was performed by the Student's t-test (p< 0.01) in comparing to the values of CCktreated group.
- 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 표시하였고, Students t-test로 유의성 검정을 행하였다.
이론/모형
- Cytochrome P-450 함량은 Omura와 Sato의 방법 (13)에의 해 측정 하였다. 간 조직으로부터 분리 한 microsome 분획을 CO gas로 1분간 기포가 생기는 약한 압력으로 포화시킨 후에 환원제로 sodium dithionite를 넣고 혼합하였을 때 생기는 환원된 microsome 분획 과 CO-microsome 복합체의 분획간의 차이를 400 -500 nm에서 스펙트럼을 그렸다.
- XOD활성 은 Stripe과 Della Corte의 방법 (14)에 따라 측정하였다. 0.
- 간세 포의 microsome 분리 는 Palozza 등(10)의 방법 에 따라 4°C에서 실시 하였다. 적 출된 간조직을 1 g당 5배의 0.
- 수행하였다. 간세포의 분리는 Meijer 등의 방법(8)에따라 collagenase(Sigma, Type IV)용액을 간 조직내로 관류시 키는 방법으로 실시 하였다. 맨 처 음에 pentobarbital(5 mg/ 100 g 체중)로 마취된 쥐를 개복한 후에 문정맥에서 하대정맥 방향으로 Ca++-free Hank's buffer를 관류시 켜 간 조직 내의 혈액을 세척한 다음 하대정맥을 묶고 0.
- 사염화탄소 투여로 생성된 간의 과산화지질은 Draper와 Hadley의 방법 (12)으로 정 량하였다. 즉, 간 조직 으로부터 분리한 0.
- 그다음에는 50 UL의 사염 화탄소(동량의 dimethyl sulfoxide에용해)를 배지에 첨가하였고, 2시간 후에 세포를 원심분리 (800 rpm, 4°C) 시켜 배지 내로 유출된 AST와 ALT의 효소활성 을 측정 하였다. 이 효소들의 활성은 Reitman과 Frankel 방법 (9)에 따라 AST/ALT 효소활성 측정용 kit(AM 1010- K)를 사용하였다.
성능/효과
- 반면에 인진쑥은 에탄올추출물인 경우에 ALT 효소활성에서, 표고버섯은 열수 추출물인 경우에 AST와 ALT 효소 모두에서 낮은 활성을 보였다. 따라서 본 실험 에서는 솔잎과 표고버섯이 다른 추출물들에 비하여 간 보호 기능이 탁월하다고 나타났다. 또한 실험에 사용된 식물소재들은 전반적으로 열수 추출물로도 충분한간 보호효과를 발휘할 수 있음을 보여주었다.
- 01)으로 나타난 반면에, cytochrome P-450의 함량 증가는 솔잎과 인진쑥의 첨가군에서 관찰되었다. 따라서 본 실험에서 cytochrome P-450의 함량증가에 대한 식물 추출물들의 효과는 확실하지 않았지만, 솔잎과 콩나물의 추출물은 항산화관련 실험에서 대부분 탁월한 효과를 나타내었다.
- 따라서 본 실험 에서는 솔잎과 표고버섯이 다른 추출물들에 비하여 간 보호 기능이 탁월하다고 나타났다. 또한 실험에 사용된 식물소재들은 전반적으로 열수 추출물로도 충분한간 보호효과를 발휘할 수 있음을 보여주었다. 이와 유사한 연구결과는 5%의 식물 추출물이 첨가된 조제사료를 3주 동안 급여 받은 실험 동물군들을 사염화탄소로 처리한 실험동물의 혈청에서도확인할수 있었다(Table3).
- 01) 감소를 보였다. 또한, 3주간의 식물 추출물을 첨가한 사료를 사전급여 하고 사염화탄소를 2일간 복강주사(1 mg/kg 체중)한 동물실험에서 혈청내의 AST 및 ALT 활성은 간세포 배양의 결과와 유사하게 솔잎과 콩나물에서낮은 활성효과(p<0.01)를 보였다. 정상군에 대한 사염화탄소의 투여는 지 질과산화물과 cytochrome P-450의 함량, 그리 고 xanthine oxidase(XOD) 활성 을 크게 증가시 켰다.
- 본 실험에서도 콩나물의 경우에 에탄올 추출물은 ALT, 그리고 열수 추출물에서는 AST에서 낮은 활성을 나타내었다. 반면에 인진쑥은 에탄올추출물인 경우에 ALT 효소활성에서, 표고버섯은 열수 추출물인 경우에 AST와 ALT 효소 모두에서 낮은 활성을 보였다. 따라서 본 실험 에서는 솔잎과 표고버섯이 다른 추출물들에 비하여 간 보호 기능이 탁월하다고 나타났다.
- Table 6에서 나타난 사염화탄소의 투여로 높아진 XOD의 활성증가는 이전에 보고된 에탄올(24), 사염화탄소(25), streptozotocin(26), xylene(27) 등의 외래의 생체이물질에 관한 실험결과들과 일치하였다. 본 실험에서 식물소재의 첨가는 사염화탄소첨가군에 비하여 표고버섯을 제외한솔잎, 콩나물 및 인진쑥 등의 첨가군에서 유의성 있는(p< 0.01) 억제효과를 보여 주었다.
- Choi와 Kim(18)은 사염화탄소를 처리한 흰쥐에 대한 몇 가지 식물들(어성초, 오갈피, 인진쑥, 표고버섯, 솔잎, 콩나물, 메밀싹)의 간 보호효과를 비교했을 때 솔잎과 콩나물은 혈청 AST와 ALT의 효소활성 뿐만 아니 라 간장 내 의 지방산합성도 월등하게 억제한다고 보고하였다. 본 실험에서도 콩나물의 경우에 에탄올 추출물은 ALT, 그리고 열수 추출물에서는 AST에서 낮은 활성을 나타내었다. 반면에 인진쑥은 에탄올추출물인 경우에 ALT 효소활성에서, 표고버섯은 열수 추출물인 경우에 AST와 ALT 효소 모두에서 낮은 활성을 보였다.
- 우선적으로 일차 간세포 배양실험에서 식물추출물(열수 또는 에탄올)을 첨가(20 mg/mL 배지)하고 2시간 후에 사염화탄소를 처리(5011L)한 결과, 배지내의 AST와 ALT 효소활성은 다음과 같았다. 솔잎은 에탄올및 열수 추출물(p<0.05)에서, 표고버섯은 열수 추출물(p<0.01 〜0.05)에서, 그리고 콩나물과 인진쑥은 추출방법에 따라 유의성 있는(p<0.01) 감소를 보였다. 또한, 3주간의 식물 추출물을 첨가한 사료를 사전급여 하고 사염화탄소를 2일간 복강주사(1 mg/kg 체중)한 동물실험에서 혈청내의 AST 및 ALT 활성은 간세포 배양의 결과와 유사하게 솔잎과 콩나물에서낮은 활성효과(p<0.
- 이 미 잘 알려진 바와 같이, 혈청이나 배지 내 에서 이들 효소의 활성증가는 간세포 손상 유발물질에 의한 간세포들의 손상을 의미할 수 있다(15). 우선적으로 일차 간세포 배양 결과에서, 솔잎의 에탄올 추출물인 경우에 AST와 ALT 효소활성 모두는 사염 화탄소투여 군에 비하여 유의성 있게 낮은 활성(p<0.05)을 나타내었고, 그 외의 식물 추출물 첨가군들은 ALT에서 낮은 활성 (p<0.01)을 나타내었다. 특히, 솔잎의 열수 추출물에서도 AST 및 ALT 효소는 모두 유의성 있게 낮은 활성을 나타냄으로서 솔잎의 탁월한 간보호 효과를 확인할 수 있었다.
- 이와 유사한 연구결과는 5%의 식물 추출물이 첨가된 조제사료를 3주 동안 급여 받은 실험 동물군들을 사염화탄소로 처리한 실험동물의 혈청에서도확인할수 있었다(Table3). 즉, 동물실험에서도 상기 두 효소들의 활성은 솔잎과 콩나물에서 유의성 있게 (p<0.01) 낮은 활성을 나타냈으며, 인진쑥과 표고버섯은다른 식 물 소재에 비 하여 상대적으로 높은 활성을 나타내 었다.
- 01)을 나타내었다. 특히, 솔잎의 열수 추출물에서도 AST 및 ALT 효소는 모두 유의성 있게 낮은 활성을 나타냄으로서 솔잎의 탁월한 간보호 효과를 확인할 수 있었다. 이러한 실험결과는 이전에 보고된 여러 연구결과들과 잘 일치하였다(16, 17).
- 흰쥐에 대한 사염화탄소의 투여는 간세포 내의 micro-some 산화를 크게 증가시킨 것으로 나타났으며, 실험동물에 투여한 사염화탄소의 독성에 대항하여 표고버섯을 제외한 솔잎, 콩나물과 인진쑥 등의 추출물을 첨가한 실험동물 군에서 다소 유의성 있는(p<0.01) 간세포의 지질산화 억제효과가 있었음을 보였다(Table 4). 이와 같은 결과는 3주 동안 조제사료에 첨 가된 식 물소재 들의 사전섭 취 가 사염 화탄소 처리에 의한 간세포의 산화독성을 억제한 것으로 사료되었다.
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