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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 L w施〃hs로부터 lumbrokinase 분리 정제한 후에 쥐를 이용하는 혈전유도모델을 이용하여 혈전 용해효과, 혈소판응집효과, 혈관 평활근 이완효과, 혈관 근 이완 기작시험을 통한 효소의 약리학적인 연구를 실시하였다.
- 작용해 회수 및 재사용이 어려웠다. 본 연구에서는 이를 개선하고자 라세미화 반응을 위한 고효율 고체 염기를 탐색해 보았다. 45。。, 아이소옥탄 내에서 (S)-나프록센 2, 2, 2- 트리플로로에틸 씨오에스터를 기질로 무기 염기류, 염기성 음이 온 교환수 지류, resin-bound 염기류 등을 시험한 결과, 약염기성 음이온교환수지인 DIAION WA30을 사용하였을 때가장 효과적이었다.
- 현재 L. rubellus lumbrokinase에 관한 연구는 효소의 분리와 기본적인 특성에 관한 연구(2, 9)와 lumbmkinase의 고정화를 이용한 인공장기로의 개발 등(6)의 응용연구에 있는 단계에 있으나 혈전용해효소에 대한 본격적인 약리학적 및 생화학적 연구에 관한 연구는 미흡한 상태이므로 이러한 연구의 필요성이 제기되어 본 연구를 하였다.
제안 방법
- 상기의 방법에 의해 제조된 동맥 환을 2개 군으로 나누고혈관의 장력이 90분 동안 기저장력 1.0 g을 유지하면서 평형된 혈관을 05 "M phenylephrine으로 수축시키고 수축고가평형을 유지하면 한 개의 군에는 soybean trypsin inhibitor 5 pg/ml, trypsin 0.5 unit/ml, LK/ASF 0.5 #g/ml, thrombin 0.5 unit/ml을 연속적으로 투여하면서 이완반응을 관찰하였고 다른 한 군은 KXTC에서 10분간 처리한 LK/ASF 0.5 您/ml, 1.8 /jM NG-methyl-L-arginine (NMA), LK/ASF 0.5 “g/ml, trypsin 0.5 unit/ml, thrombin 0.5 unit/ml< 연속적으로 첨가하면서 이완반응을 관찰하였다.
- 이 조 추출물을 30~60% ammonium sulfate 분별침전을 실시하고 초 여과장치로 탈염, 농축한 후 동결 건조하여 17, 300 unit/g의 casein 분해능이 있는 44 g의 1차 정제물인 lumbrokinase ammonium sulfate fraction (LK/ASF)을 얻었다(2). 1 차 정제 물을 DEAE-toyopearl 650 column을 사용해 0~ 0.5 M NaCl 농도로 anion exchange chromatograph하여 fibrin 분해능이 있는 세 가지 분획물 I, Ⅱ, Ⅲ을 얻었고, DEAE-분획물 I로부터 phenyl-toyopearl column 을 이용한 hydrophobic interaction chromatograph 에서 1~ 0M ammonium sulfate 로 descending gradient하여 fibrin 분해 역가가 있는 분획 Fl과 F2를 얻었으며, DEAE-분획물 II를 phenyl-toyopearl column을 이용하여 l~0M ammonium sulfate 농도로 descending gradient하여 fibrin 분해 역가가 있는 분획 F3을 얻었다(2). DEAE-분획물 Ⅲ을 benzamidine sepharose 6B column를 사용하여 affinity chromatograph 를 실시하였고 benzamidine sepharose 6B column에 부착하지 않고 용출되는 분획 F4와 Benzamidine sepharose 6B c이umn에 부착하여 0~ 0.
- 5, 10, 25 Ug/ml 농도의 LK/ASF와 대조약물로 5 mg/ml 농도의 aspirin을 10 R1 씩 첨가하고 30분간 반응시켰다. 2 unit thrombin을 첨가하여 혈소판응집을 유도하여 응집의 변화를 관찰하였다.
- 현탁액 2 ml를 플라스틱반응 튜브에 넣고 37℃ 수조에서 30분 동안 방치하였다. 50, 100, 200 ug/ml 농도의 LK/ASF와 100 ug/ml 농도의 aspirin 을 각각 0.1 ml씩 넣어 30분간 반응시키었고 thrombin 10 unit을 첨가하여 30분 동안 혈소판 응집을 유도하였다. TCA (IN HC1 에 용해된 TCA 용액, 100% w/v.
- 5 M NaCl 농도로 anion exchange chromatograph하여 fibrin 분해능이 있는 세 가지 분획물 I, Ⅱ, Ⅲ을 얻었고, DEAE-분획물 I로부터 phenyl-toyopearl column 을 이용한 hydrophobic interaction chromatograph 에서 1~ 0M ammonium sulfate 로 descending gradient하여 fibrin 분해 역가가 있는 분획 Fl과 F2를 얻었으며, DEAE-분획물 II를 phenyl-toyopearl column을 이용하여 l~0M ammonium sulfate 농도로 descending gradient하여 fibrin 분해 역가가 있는 분획 F3을 얻었다(2). DEAE-분획물 Ⅲ을 benzamidine sepharose 6B column를 사용하여 affinity chromatograph 를 실시하였고 benzamidine sepharose 6B column에 부착하지 않고 용출되는 분획 F4와 Benzamidine sepharose 6B c이umn에 부착하여 0~ 0.5M arginine gradient 에 의해 용출되는 2개 분획 F5와 F6을 얻었다(2).
- 효소 활성 에 필수적 인 물의 양에 따른 DIAION WA30의 라세미화 효율에 관하여 실험한 결과, 물의 양이 증가할수록 그 효율은 감소하였다. DIAION WA30을 라세미화 촉매로 사용하여 아이소옥탄 내에서 라세믹 나프록센 2, 2, 2-트리플로로에틸 씨오에스터의 효소적 DKR 반응을 수행해 보았다. 그 결과 DIAION WA30을 사용하지 않은 경우에 비해 반응 전환율과 생성물의 광학 순도는 급격히 향상되었다.
- LK가 serine protease 활성에 의해 내피세포 의존적으로 혈관근을 이완시키므로 LK가 혈관근 내피세포에 존재하는 thrombin receptor와 PAR-2 중 어느 수용체에 작용흐卜는 지를 확인하기 위해 혈관근에 thrombin 0.5 unit/ml을 2회 연속 투여하여 thrombin receptor를 탈감작한 후 LK 0.5 ng/ml를 처리하여 혈관근이 이완되는지를 조사하였고, 또한 이미 PAR-2 를 선택적으로 활성화하는 것으로 보고된 trypsin 0.5 unit/ml 을 탈감작된 혈관근에 투여하여 LK와 비교하였다. LK는 thrombin receptor가 탈감작된 혈관근을 이완시켰으며 PAR-2 활성화 양성 비교물질로 사용한 trypsin 역시 LK와 같이 탈감작된 혈관근을 이완시켰다(Fig.
- 0 unit/ml까지 FPB로 희석한 후 fibrin 평판에 10 pl 을 점적하고 37℃에서 15시간 항온 처리한 후 분해된 투명한 원의 면적을 이용하여 표준곡선을 작성하였다. Lun血okinase의 활성은 각각의 분획을 1 mg/ml의 농도로 FPB에 용해한 후 fibrin 평판에 10 μ1을 점적하고 37℃에서 15시간 항온 처리한 후 생성된 원의 면적을 구하고 미리 얻은 표준곡선을 이용하여 역가를 plasmin unit로 산출하였다 (11).
- PSS 용액은 95%。2와 5% CO?로 포화시켰다. Phenylephrine에 의해 근수축이 일정한 높이로 유지될 때 lumbrokinase 6개 분획을 0.1, 1, 10 pg/ml 농도로 3분 간격으로 투여하였다. 각 실험에서 이완약물에 대한 용량 의존곡선은 60분 간격으로 반복하였다.
- 위해 P-mercaptoethanol °] 첨가되지 않은 500 pl loading buffer에 용해하고 열처리는 실시하지 않았다. 각각의 분획당 6 씩 두 시료를 준비히•여 2장의 gel에 나누어 loading하고 종료되면 한 쪽의 gele brilliant blue G colloidal concentrate (Sigma Co., USA)로 단백질을 염색하여 분석하고, 다른 한 쪽의 gele SDS를 제거하기 위해서 2% triton X-100 (Sigma Co., USA) 용액에 10분 동안 담가 교반시켰으며 triton을 제 거하기 위해서는 증류수로 gel을 충분히 씻어 주었다. 이 gel 을 fibrin plate layer에 얹은 후 37℃ 항온기에서 약 5시간 방 치하여 단일 밴드에 의해 fibrin 이 분해되어 생성되는 zymogram을 얻었다.
- 흉동맥과 장간막동맥을 적출한 후 주위의 지방조직 및 결합조직을 제거하고 2 mm 길이로 고리를 만들었다. 내피세포제거 혈관은 혈관 내면을 부드럽게 문질러 내피세포를 제거한 뒤 같은 방법으로 제작하였다. 혈관 고리는 95% C6 로 포화시킨 37 ℃ physiological salt solution (PSS) (130 mM NaCl, 4.
- Glacial acetic acid 50 μ1을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 405 nm에서의 홉광도를 측정하였다. 대조군은 glacial acetic acid, plasmin, sample, 기질을 각각 50 씩 순서대로 혼합한 후사용하였다.
- 이러한 결과는 lumbrokinase의 혈관근 이완 효과가 특이적 단백분해효소 활성, 즉 serine proteinase 활성에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한, lumbrokinase의 혈관 근 이완이 endothelial derived relaxing factor (EDRF)인 nitric oxide (NO) 에 의해서 매개되는 지를 알아보기 위해, nitric oxide synthase 저해물질인 NG-methyl- L-arginine (NMA)에 의해 이완 반응이 억제되는지를 조사하였다. LK/ASF 0.
- 반응 종료 후 상온에방치하고 3, 000 X g로 1시간 원심분리하였다. 상층액을 532 皿에서 흡광도를 측정하여 MDA를 정량 하였다(MDA 분자흡광계수 = 1.56 X 105).
- 세척 혈소판이 0.9 X io8 cells/ml인 현탁액 0.5 ml을 flat cuvette 에 넣고 37 ℃ 로 보온된 aggregometer (560-VS, CHRONO-LOG, Havertown, PA, USA) 내에서 5분간 배양 후 5, 7.5, 10, 25 Ug/ml 농도의 LK/ASF와 대조약물로 5 mg/ml 농도의 aspirin을 10 R1 씩 첨가하고 30분간 반응시켰다. 2 unit thrombin을 첨가하여 혈소판응집을 유도하여 응집의 변화를 관찰하였다.
- 3 Rg/ml)으로 세척하였다. 세척된 혈소판은 현탁용 완충액 (130 mM NaCl, 4.74 mM KC1, 11.5 mM glucose, 10 mM HEPES, 1.2 mM KH2PO4, 4.0 mM NaHCO3, 1.2 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0.2% BSA, pH 7.4)로 일정 혈소판 수가 되도록 용량을 조절하여 현탁하였다.
- 이 gel 을 fibrin plate layer에 얹은 후 37℃ 항온기에서 약 5시간 방 치하여 단일 밴드에 의해 fibrin 이 분해되어 생성되는 zymogram을 얻었다. 염색된 gel의 밴드와 zymogram의 투명 환과 비교하여 fibrin 분해활성을 확인하였다.
- 0 kg을 얻었다. 이 조 추출물을 30~60% ammonium sulfate 분별침전을 실시하고 초 여과장치로 탈염, 농축한 후 동결 건조하여 17, 300 unit/g의 casein 분해능이 있는 44 g의 1차 정제물인 lumbrokinase ammonium sulfate fraction (LK/ASF)을 얻었다(2). 1 차 정제 물을 DEAE-toyopearl 650 column을 사용해 0~ 0.
- 등(2)의 방법을 사용하여 분리 정제하였다. 정제 순서는 10 kg의 지렁이의 분쇄액을 ammonium sulfate precipitatione으로침전을 시킨 후에, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography 와 gel filtration chromatography롤 거처서 순수정제를 하였다(2).
- 만들었다. 즉, 횐쥐를 ketamine 100 ㎎/㎏ (i.p.)으로 마취하고 복부중앙을 약 3 cm 절개한 후 하대 정맥의 좌신정맥에서 장골 정맥 쪽으로 stainless steel wire coil을 삽입한 후봉합하였다. 혈전유발 후 7 일간 lumbrokinase ammonium sulfate fraction (LK/ASF)을 10, 50, 250 ㎎/㎏ 용량으로 매일 1회 경구 투여하였다.
- 평형된 혈관근을 0.5 μM phenylephrine으로 수축시키고 수축고 가 평형을 유지하면 0.5 unit/ml 농도의 thrombin을 연속투여하여 혈관 내피세포와 평활근세포에 존재하는 thrombin TeceptoT들을 탈감작시키고 0.5 unit/ml 농도가 되도록 trypsin 을 첨가하거나 0.5 Ug/ml 농도가 되도록 LK/ASF를 첨가하여 Proteinase activated receptor 2 (PAR-2) 활성화에 따른 혈관근 이완반응을 관찰하였다';
- 혈소판 응집도 측정은 Rodomski 등(15)의 방법을 변형하여 수행하였다. 횐쥐의 하대동맥에서 9 ml의 혈액을 뽑은 후 3.
- 혈장으로부터 분획한 euglobulin 효소액이 합성기질인 chromogenic substrate를 분해하는 amidolytic activity로 측정하였고, 활성도는 international unit (IU) 로 표시하였다. euglobulin 또는 표준액 0.
- 혈전유발 후 7 일간 lumbrokinase ammonium sulfate fraction (LK/ASF)을 10, 50, 250 ㎎/㎏ 용량으로 매일 1회 경구 투여하였다. 혈전유발 7일째에 하대동맥에서 동맥혈을 채혈한 훅 혈액부피 10%에 해당하는 3.2% sodium citrate를 첨가하여 응고를 방지하였으며 이를 2, 500 xg로 원심분리하여 혈장을 얻었다.
- )으로 마취하고 복부중앙을 약 3 cm 절개한 후 하대 정맥의 좌신정맥에서 장골 정맥 쪽으로 stainless steel wire coil을 삽입한 후봉합하였다. 혈전유발 후 7 일간 lumbrokinase ammonium sulfate fraction (LK/ASF)을 10, 50, 250 ㎎/㎏ 용량으로 매일 1회 경구 투여하였다. 혈전유발 7일째에 하대동맥에서 동맥혈을 채혈한 훅 혈액부피 10%에 해당하는 3.
- 횐쥐 (250~300 g) 및 토끼 (2.5-3 kg)를 마취 없이 경동맥을 절단하여 방혈 치사시켰다. 흉동맥과 장간막동맥을 적출한 후 주위의 지방조직 및 결합조직을 제거하고 2 mm 길이로 고리를 만들었다.
- 횐쥐의 복부중앙을 절개하여 하대정맥을 노출시킨 후 stainless steel wire coil 삽입부위의 앞뒤의 혈류를 억제하고 3.2% sodium citrate를 혈관 내로 주입하여 혈액의 응고를 방지한 다음 혈관을 길이 방향으로 절개하여 혈전이 포함된 코일을 적출 하였다. 2%의 NazCO이 포함된 0.
- 5-3 kg)를 마취 없이 경동맥을 절단하여 방혈 치사시켰다. 흉동맥과 장간막동맥을 적출한 후 주위의 지방조직 및 결합조직을 제거하고 2 mm 길이로 고리를 만들었다. 내피세포제거 혈관은 혈관 내면을 부드럽게 문질러 내피세포를 제거한 뒤 같은 방법으로 제작하였다.
대상 데이터
- Plasmin, antiplasmin, plasminogen activator, plasminogen activator inhibitor, D-dimer 정량 등은 혈전우발용 starless steel wire coil (dental paste carrier, Zipperer, size 40 cst) 은 Pforzheim (Gemany)에서 구입하였다.
- Prostaglandine El (PGE1), bicinchoninic acid (BCA), aspirin, N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N1-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES), ethylene glycol-bis[6-aminoethylether]N, N, N', N'-tetia acetic acid (EGTA), phenylephrine 등은 Sigma (USA)사로부터 구입하였다.
- Sprague-dawley계 수컷 횐쥐 (250—350 g, 6 ~8 주령)와 New Zealand White계 수컷 횐 토끼 (2.5 ~3 kg)는 Charles River Japan (3371-8 Kotoh-Cho, Hamamamtsu, Shizuoka, Japan)에서 생산된 것을 우정화학(한국, 서울 서초구 양제동 103)을 통해 구입하여 사용하였다 모든 동물은 온도 23±1℃, 습도 55±5%, 환기 10~18회/시간, 명암 12시간 주기, 조도 300~500 Lux의 환경의 사육실에서 폴리카보네이트 사육 상자에 넣어 사육하였다.
- 구입하였다. 마취용 ketaminee 유한양행 (한국 경기도 군포시 당정동)에서 구입하였다
- 본 연구에는 한국산 L. rubellus 분쇄액으로 부터 lumbrokinase (LK)의 일차 정제는 염농도에 의한 분별 침전방법을 적용하였는데 30% —60% ammonium sulfate 포화용액에서 얻은 침전물에 67% 이상의 fibrin용해 활성이 존재하였다Qable 1). 다양한 column chromatography를 수행하여 F1, F2, F3, F4, F5 F6의 6종류의 효소를 정제하였고 분리된 각분획으로 zymography를 실시하여 fibrin 분해능을 관찰한 결과 6개 분획 모두 활성이 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 지렁이목 낚시지렁이과에 속하는 붉은지렁이 (Lumbricus nibelms)는 기흥 소재의 지렁이 전문 사육장에서 구입하였다. 마취용 ketaminee 유한양행 (한국 경기도 군포시 당정동)에서 구입하였다
데이터처리
- 모든 결과는 평균士표준오차로 표시하였고 결과는 Student's t-test로 분석하여 비교하였다. 이들의 차이는 P < 0.
이론/모형
- Hwa 등(17)의 방법을 이용하여 혈관 이완작용을 측정하였다. 횐쥐 (250~300 g) 및 토끼 (2.
- Lumbricus 湖湖必에서 himbr이dnase의 정제는 Scopes(lO)와 Cho 등(2)의 방법을 사용하여 분리 정제하였다. 정제 순서는 10 kg의 지렁이의 분쇄액을 ammonium sulfate precipitatione으로침전을 시킨 후에, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography 와 gel filtration chromatography롤 거처서 순수정제를 하였다(2).
- MDA (malondialdehyde) 5] 측정은 Buege 등(16)의 방법에따라 수행하였다. 현탁용 완충액으로 현탁하여 혈소판수가 2.
- Figure 2. Thromolytic effects by oral administration of lumbrokinase ammonium sulfate fraction (LK/ASF) on the vena cava thrombosis model. **, p<0.
- 전기영동은 Laemmli 방법(13)에 따라 12% polyacrylamide gel 2장을 만들었고, 각 분획 1 mg에 단백질의 활성을 유지하기 위해 P-mercaptoethanol °] 첨가되지 않은 500 pl loading buffer에 용해하고 열처리는 실시하지 않았다. 각각의 분획당 6 씩 두 시료를 준비히•여 2장의 gel에 나누어 loading하고 종료되면 한 쪽의 gele brilliant blue G colloidal concentrate (Sigma Co.
- 지렁이에서 분리한 Lumbrokinase에 의해 casein이 분해되는 정도를 Cho 등(2)의 방법을 이용하여 측정하였다 기질로 사용한 4% a-casein (Sigma Co., USA) 2 ml에 67 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) 1.6 ml와 0.4 ml의 lumbrokinase (1.0 mg/ml)를 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시키고 15% trichloroacetic acid (TCA) 6 ml을 가하여 반응을 중지시킨 뒤 30분 방치하고 반응액을 filter paper (Whatman, No. 1, Whatman international Ltd, Maidstone, En曲nd)로 여과한 후 여액을 spectrophotometer (Hewlett- Packard 8453, Germany)를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 효소의 역가를 결정하였다. 효소역가는 1시간동안 450 μg의 TCA-soluble tyrosine을 유리시키는 효소량을 1 unit 로 하였다.
- 흰쥐를 이용한 정맥혈전 모델은 Kumada의 방법(14)에 따라 만들었다. 즉, 횐쥐를 ketamine 100 ㎎/㎏ (i.
성능/효과
- 정제정도를 확인하기 위하여。-mercaptoethanol을 첨가하지않고 가열하지 않은 상태에서 SDS-PAGE와 zymograph를 실시한 결과, 6개 분획 모두 피브린 분해력을 가지는 것으로나타났다(Fig. 1). 순수 분리된 lumbrokinase의 각 분획을 SDS-PAGE 를 수행하여 얻은 분자량은 분획 F1 이 24.
- 2). 250 ㎎/㎏/day투여군의 혈전 양은 대조군에 비해 약 64.3%의 혈전중량 감소 효과가 나타났다. 항선용계에 있어서 plasminogen activator inhibitor (PAI)가 LK/ASF 10 mg/k응/day 투여 군에서만 음성대조 군에 비해 유의적으로 활성이 저하되었고 antiplasmin 활성의 변화는 관찰되지 않았다.
- 나타내었다. Lumbrokinase ammonium sulfate fraction (LK/ASF) 을 경구로투여하였을 때, 혈액응고계 중 외인계인 prothrombin time 四)는 음성대조군에 비헤 LK/ASF의 10, 50, 250 ㎎/㎏/day 투여군 모두에서 유의적으로 증가하였고, 또한 내인계인 activated partial thromboplastin time (APTT)도 음성대조군에비해 LK/ASF의 10, 50, 250 ㎎/㎏/day 투여군 모두에서 유의적으로 증가하였다. 그러나 혈액응고계 중 외인계와 내인계 모두에 영향을 받는 thrombin time (TT)의 변화는 없었다.
- Thrombin (2 unit/ml)으로 유도된 혈소판 응집은 LK/ASF에 의해 농도 의존적으로 억제되었으며, 양성대조물인 aspirine 5 mg/ml 투여군에서 약 65%의 억제를 나타내었다(Fig. 3). 또한 혈소판 응집시 방출되는 TXB2의 indicator인 MDA 양도 혈소판 응집 억제정도와 같이 농도 의존적으로 감소되었고, 비교약물인 aspirin 100 μ g/ml 투여군에서는 0.
- rat venous thrombosis를 이용한 실험모델에서, LK분획을 oral administration한 쥐에서 thrombus 중량은 유의하게 감소하였고, APTT, PT와 plasmin 활성도유의하게 증가하였고, PAI activity도 유의하게 감소하였다. rat platelets< LK 분획으로 전 처리하였을 때에 thrombin에의한 응고는 억제되었고, MDA 생산도 감소되었다. 쥐의 흉대동맥과 장간막동맥을 phenylephrine으로 수축을 시킨 후에 LK 분획을 각각 처리하였을 때에 혈관이 이완되었다.
- 1 kDa 사이였다. rat venous thrombosis를 이용한 실험모델에서, LK분획을 oral administration한 쥐에서 thrombus 중량은 유의하게 감소하였고, APTT, PT와 plasmin 활성도유의하게 증가하였고, PAI activity도 유의하게 감소하였다. rat platelets< LK 분획으로 전 처리하였을 때에 thrombin에의한 응고는 억제되었고, MDA 생산도 감소되었다.
- 본 연구에서는 이를 개선하고자 라세미화 반응을 위한 고효율 고체 염기를 탐색해 보았다. 45。。, 아이소옥탄 내에서 (S)-나프록센 2, 2, 2- 트리플로로에틸 씨오에스터를 기질로 무기 염기류, 염기성 음이 온 교환수 지류, resin-bound 염기류 등을 시험한 결과, 약염기성 음이온교환수지인 DIAION WA30을 사용하였을 때가장 효과적이었다. DIAION WA30의 2차 interconversion constant (扁。는 8.
- 1, 1, 10 pg/ml 농도로 3분 간격으로 투여하였다. 각 실험에서 이완약물에 대한 용량 의존곡선은 60분 간격으로 반복하였다. 장력의 변화는 force tranducei.
- 각각의 LK 분획에 대한 흰쥐와 토끼의 흉부 대동맥과 장간막동맥의 이완작용을 조사한 결과는 횐쥐의 평활근에 대해 각 분획들이 농도 의존적으로 이완반응을 증가시켰다. 특히 분획 F6은 0.
- 상기의결과는 LK분획이 fibrinolytic activity 뿐만 아니라 platelet 응집의 억제와 혈관의 이완작용에도 영향을 준다는 것을 의미한다. 결론적으로 LK는 fibrin clot치료를 위한 hemolytic agent로서 유용하다고 판단한다.
- DIAION WA30을 라세미화 촉매로 사용하여 아이소옥탄 내에서 라세믹 나프록센 2, 2, 2-트리플로로에틸 씨오에스터의 효소적 DKR 반응을 수행해 보았다. 그 결과 DIAION WA30을 사용하지 않은 경우에 비해 반응 전환율과 생성물의 광학 순도는 급격히 향상되었다. 전통적 광학 분할 반응의 최대 50%라는 전환율의 제한이 본 연구에서 찾은 DIAION WA30을 첨가함으로써 성공적으로 극복되었다.
- rubellus 분쇄액으로 부터 lumbrokinase (LK)의 일차 정제는 염농도에 의한 분별 침전방법을 적용하였는데 30% —60% ammonium sulfate 포화용액에서 얻은 침전물에 67% 이상의 fibrin용해 활성이 존재하였다Qable 1). 다양한 column chromatography를 수행하여 F1, F2, F3, F4, F5 F6의 6종류의 효소를 정제하였고 분리된 각분획으로 zymography를 실시하여 fibrin 분해능을 관찰한 결과 6개 분획 모두 활성이 있음을 알 수 있었다(Fig. 1)
- 3). 또한 혈소판 응집시 방출되는 TXB2의 indicator인 MDA 양도 혈소판 응집 억제정도와 같이 농도 의존적으로 감소되었고, 비교약물인 aspirin 100 μ g/ml 투여군에서는 0.03 nM/2xlO2 platelets로 나타났다(Fig. 4).
- 1). 순수 분리된 lumbrokinase의 각 분획을 SDS-PAGE 를 수행하여 얻은 분자량은 분획 F1 이 24.6 kDa, F2는 26.8 kDa, F3은 28.2 kDa, F4는 25.4 kDa, F5는 33.1 kDa 그리고 분획 F6 은 33.0 kDa으로 확인되었으며 (Fig. 1A), 또한 각 분획의 효소들이 혈전분해능이 있는 것을보여주고 있다(Fig. 1B).
- 9). 이 결과로 LK가 혈관 내피세포에 작용하여 혈관근이 이완되는 것을 알 수 있었다.
- 10B). 이러한 결과는 lumbrokinase의 혈관근 이완 효과가 특이적 단백분해효소 활성, 즉 serine proteinase 활성에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한, lumbrokinase의 혈관 근 이완이 endothelial derived relaxing factor (EDRF)인 nitric oxide (NO) 에 의해서 매개되는 지를 알아보기 위해, nitric oxide synthase 저해물질인 NG-methyl- L-arginine (NMA)에 의해 이완 반응이 억제되는지를 조사하였다.
- 5 11M phenylephrine으로 수축된 혈관근이 LK에 의해 농도 의존적으로 이완되었으나 혈관내피세포를 제거했을 때는 이완되지 않았는데(司* 9), 이것은혈관내피세포에 LK가 작용하여 혈관근이 이완되는 것으로판단된다. 이러한 혈관근 이완반응이 LK의 proteinase 활성에의한 것언지를 조사한 결과는 trypsin inhibitor 5 ug/ml로 전처리한 혈관근은 trypsin 0.5 unit/ml 또는 LK 0.5 阐函에 의해 이완이 유발되지 않았으나, trypsin inhibitor에 의해 활성이 저해되지 않는 thrombin 0.5 unit/mle 이완반응을 나타냈고(Fig. 10A), 가열하여 단백질을 변성시킨 LK 0.5 yg/mie혈관근 이완효과가 없음을 알 수 있었다. 또 nitric oxide synthase 억제제인 NG-methyl-L-arginine 1.
- 10B). 이상의 결과로 LK는 trypsin 유사 serine proteinase의 일종이며(9) 고유의 단백분해활성에 의해 혈관근을 이완시키며, 이러한 반응에 nitric oxide가 일부 관여하는 것으로 판단되어진다.
- 11). 이상의 결과로 LK는 trypsin과 같이 PAR-2를 선택적으로 활성화시키는 것으로 판단된다.
- 5). 이상의 결과로 LK는 혈행 개선에 매우 효과적인데 이 효과는 직접적인 혈전 용해효과와 간접적인 PAR-2 활성화에 따른 혈관근 이완 및 혈소판 응집억제에 기인한 것으로 생각된다.
- 그 결과 DIAION WA30을 사용하지 않은 경우에 비해 반응 전환율과 생성물의 광학 순도는 급격히 향상되었다. 전통적 광학 분할 반응의 최대 50%라는 전환율의 제한이 본 연구에서 찾은 DIAION WA30을 첨가함으로써 성공적으로 극복되었다. 또한 고체 염기촉매인 DIAION WA30의 사용은 라세미화 촉매의 회수 및 재사용이 가능하게 해준다.
- 특히 분획 F6은 0.1 ng/ml의 저 농도에서도 흰쥐 평활근에 대한 이완 효과가 큰 것으로 나타났는데(Fig. 5와 6), 토끼의 평활근에서는 분획 F2가 저 농도에서 이완효과가 큰 것으로 나타나 (Fig. 7과 8) 동물의 종간에 어느 정도 차이가 있는 것으로 판단되어 진다.
- 혈소판 응집 억제 효과에서도 血ombin으로 유도된 혈소판응집이 LK에 의해 농도의존적으로 억제되었는더}, LK 25 阐 ml 투여 군에서는 혈소판 응집이 95% 억제되었고(Fig. 3), 혈소판 응집시 방출되는 TXB2의 indicator인 MDA 양도 LK 에 의해 방출 양이 농도 의존적으로 감소되는 것으로 나타나 (Fig. 4), LK에 의해 혈소판의 응집이 억제되는 것을 알 수 있었다. 이러한 응집 억제는 혈소판에 존재하는 thrombin receptor에 대해 LK가 thrombin과 경쟁적으로 작용하는 것으로 추측되는데 이에 대한 연구가 더 이루어져야 될 것으로 여겨진다.
- 5x10』mM-'h")에 비해 약 3배가 높았다. 효소 활성 에 필수적 인 물의 양에 따른 DIAION WA30의 라세미화 효율에 관하여 실험한 결과, 물의 양이 증가할수록 그 효율은 감소하였다. DIAION WA30을 라세미화 촉매로 사용하여 아이소옥탄 내에서 라세믹 나프록센 2, 2, 2-트리플로로에틸 씨오에스터의 효소적 DKR 반응을 수행해 보았다.
- 5와 6에 제시되었다. 흉부 대동맥과 장간막 동맥에 0.3 μM phenylephrine으로 수축을 일으킨 후 각각의 lumbrokinase 분획들을 0.1, 1.0, 10 Ug/ml 농도로 투여하였을 때, 흉부대동맥에서 F1 분획이 3.2, 38.2, 84.0%, F2 분획은 2.2, 36.4, 78.9%, F3 분획은 12.9, 52.8, 80.0, F4 분획은 1.6, 4.9, 13.5%, F5 분획은 30.0, 78.9, 81.0%, F6 분획은 57.3, 85.1, 76.7%의 이완효과가 있었으며(Fig. 5), 장간막 동맥에서는 F1 분획이 2.1, 39.6, 82.2%, F2 분획은 0.9, 38.1, 88, 7%, F3 분획은 2.9, 57.3, 90.9%, F4 분획은 0.9, 12.4, 17.1%, F5 분획은 35.2, 81.9, 86.9%, F6 분획은 54.4, 76.0, 84.0%의 이완효과를 보여 농도가 증가함에 따라 이완효과도 증가함을 알 수 있었다(Fig. 6).
- 흰 토끼의 흉부 대동맥과 장간막 동맥에 0.3 11M phenyleph曲ne으로 수축을 일으킨 후 각각의 lumbrokinase 분획들을 0.1, 1.0, 10 gg/ml 농도로 투여하였을 때 흉부대동맥에서 F1 분획은 17.8, 23.2, 66.1%, F2 분획은 21.4, 36.6, 76.7%, F3 분획은 0.9, 9.8, 53.6%, F4 분획은 1.8, 6.3, 7.2%, F5 분획은 1.8, 28.6, 80.4%, F6 분획은 8.9, 62.5, 67.9%의이완효과가 있었으며(Fig. 7), 장간막 동맥에서는 F1 분획이 22.3, 28.6, 67%, F2 분획은 28.6, 32.1, 69.7%, F3 분획은 6.3, 11.6, 25.9%, F4 분획은 1.8, 7.1, 8.0%, F5 분획은 15.2, 35.7, 87.5%, F6 분획은 13.4, 68.8, 79.5%의 이완효과를 보여토끼의 혈관근 역시 농도가 증가함에 따라 이완효과도 증가함을 알 수 있었으나(Fig. 8) 흰쥐에서와는 달리 0.1 題/ml 농도로 투여시에는 흉부대동맥과 장간막 동맥에서 F1 분획과 F2 분획이 F5 분획과 F6 분획보다 이완효과가 큰 것으로 나타나 동물 종간의 차이가 있음을 알 수 있었다.
- 흰쥐 정맥혈전모델을 통한 혈액학적 연구와 혈전 용해효과를 보면, LK에 의해 혈액응고의 내인계인자인 APTT와 외 인계 인자인 PT 모두 음성 대조군에 비해 증가하였으나 TT에는 변화가 없었고, 師血을 분해하는 선용계의 중추적 역할을 담당하는 효소인 plasmin의 활성이 LK 투여군 모두에서 유의하게 증가되었으나 plasminogen activator 활성에는 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다<Table 1). LK 투여에 의해 혈전 중량이 현저히 감소하였는데 특히 LK 250 ㎎/㎏ 투여군의 혈전량은 대조군에 비해 약 64.
- 흰쥐 흉부 대동맥 혈관의 내피 세포가 제거된 혈관근과 제거되지 않은 혈관근으로 동맥환을 만들어 0.5 /jM phenylephrine으로 수축시킨 다음, LK/ASF를 투여하였을 때, 혈관내피세포가 제거되지 않은 혈관근은 LK/ASF 10 ug/ml 농도에서는 최대 수축고의 약 83% 정도가 이완되었으며 혈관근 이완작용에 대한 LK/ASF의 ECso (median effective concentration)은 1.25 Rg/ml이었으나, 혈관내피세포가 제거된혈관근은 LK의 투여에도 불구하고 이완되지 않았다 (Fig. 9). 이 결과로 LK가 혈관 내피세포에 작용하여 혈관근이 이완되는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- " data-ocr-fix="">수 있었다. 이러한 응집 억제는 혈소판에 존재하는 thrombin receptor에 대해 LK가 thrombin과 경쟁적으로 작용하는 것으로 추측되는데 이에 대한 연구가 더 이루어져야 될 것으로 여겨진다.
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