두릅나무의 엽병을 1.0 mg/L 2,4-D가 포함된 MS 고체배지에서 배발생캘러스를 유도하였다. 배발생세포와 배발생세포괴는 1.0 mg/L 2.4-D가 포함된 MS 액체배지에서 배발생캘러스를 2주간 현탁배양하여 대량으로 얻었다. 그물망을 통과한 배발생세포는 1.0 mg/L 2.4-D가 포함된 MS 액체배지에서 배양하면 배발생능이 소실되지 않고 지속적으로 유지 및 증식시킬 수 있었다. 그물망을 통과하지 못한 배발생세포괴를 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 1/2 MS 액체배지에 옮겨 2주간 배양하면 구상형의 체세포배로 발달하였다. 구상형의 체세포배는 5 L의 bioreactor를 이용하여 배양하면 심장형, 어뢰형, 자엽형의 배와 유식물체로 발달하였다. Bioreactor 배양을 통해 두릅나무의 체세포배를 효과적으로 대량증식 시킬 수 있었다.
두릅나무의 엽병을 1.0 mg/L 2,4-D가 포함된 MS 고체배지에서 배발생캘러스를 유도하였다. 배발생세포와 배발생세포괴는 1.0 mg/L 2.4-D가 포함된 MS 액체배지에서 배발생캘러스를 2주간 현탁배양하여 대량으로 얻었다. 그물망을 통과한 배발생세포는 1.0 mg/L 2.4-D가 포함된 MS 액체배지에서 배양하면 배발생능이 소실되지 않고 지속적으로 유지 및 증식시킬 수 있었다. 그물망을 통과하지 못한 배발생세포괴를 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 1/2 MS 액체배지에 옮겨 2주간 배양하면 구상형의 체세포배로 발달하였다. 구상형의 체세포배는 5 L의 bioreactor를 이용하여 배양하면 심장형, 어뢰형, 자엽형의 배와 유식물체로 발달하였다. Bioreactor 배양을 통해 두릅나무의 체세포배를 효과적으로 대량증식 시킬 수 있었다.
Embryogenic calli were induced from petioles of Aralia elata on MS solid medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D. When embryogenic calli were transferred to MS liquid medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D, embryogenic cells and embryogenic cell clusters were developed after 2 weeks of culture. Emb...
Embryogenic calli were induced from petioles of Aralia elata on MS solid medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D. When embryogenic calli were transferred to MS liquid medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D, embryogenic cells and embryogenic cell clusters were developed after 2 weeks of culture. Embryogenic cells were filtered through a 250 ${\mu}{\textrm}{m}$ sieve and the passed cells were proliferated and maintained in MS liquid medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D. Embryogenic cell clusters entrapped on the sieve were transferred to 1/2 MS liquid medium without plant growth regulators, globular-shaped embryos were developed from embryogenic cell clusters after 2 weeks of culture. Numerous early stage somatic embryos could be developed to heart-shaped, torpedo-shaped, cotyledonary embryos and plantlets in 5 L bioreactor. Above results suggest that effective somatic embryo proliferation can be achieved via bioreactor culture systems in Aralia elata.
Embryogenic calli were induced from petioles of Aralia elata on MS solid medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D. When embryogenic calli were transferred to MS liquid medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D, embryogenic cells and embryogenic cell clusters were developed after 2 weeks of culture. Embryogenic cells were filtered through a 250 ${\mu}{\textrm}{m}$ sieve and the passed cells were proliferated and maintained in MS liquid medium supplemented with 1.0 mg/L 2,4-D. Embryogenic cell clusters entrapped on the sieve were transferred to 1/2 MS liquid medium without plant growth regulators, globular-shaped embryos were developed from embryogenic cell clusters after 2 weeks of culture. Numerous early stage somatic embryos could be developed to heart-shaped, torpedo-shaped, cotyledonary embryos and plantlets in 5 L bioreactor. Above results suggest that effective somatic embryo proliferation can be achieved via bioreactor culture systems in Aralia elata.
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문제 정의
본 연구는 두릅나무의 엽병을 배양 재료로 사용하여 캘러스를 유도한 후 현탁 배양하여 반복적으로 배발생세포를 유지 및 증식 시켜 균일한 체세포배를 대량으로 유도하여 생물반응기에 투입되는 양을 확보한 후, 생물반응기를 이용하여 체세포배와 유식물체를 대량으로 생산하는 시스템을 개 발하고자 실시하였다.
제안 방법
두릅나무 엽병 절편을 2, 4-D가 함유된 MS 고체 배지에서 배양하면 비배발생캘러스와 함께 배발생캘러스가 엽병 절 단면으로부터 유도되는데 노란색의 부서지기 쉬운 배발생 캘러스만 선별하여 고체 배지에서 계대 배양하여 증식시켰다. 이 배발생캘러스를 MS 액체배지에서 배양하면 각각의 세포로 분리되는 배발생세포와 여러 개의 배발생세포가 서로 엉겨 분리되지 않은 배발생세포괴로 분리되며 이를 유지 및 증식시키기 위해 0, 0.
본 연구에서는 두릅나무의 배발생캘러스를 고체배양과 현탁배양을 통해 배발생능을 소실시키지 않고, 지속적으로 유지 및 증식 시켜 생물반응기에 접종하여 2주, 4주 만에 반 복적으로 체세포배와 유식물체를 대량생산 할 수 있는 체계를 확립하였다. 페트리디쉬나 플라스크를 이용한 체세포 배 생산은 대량증식에 한계가 있고 많은 노동력과 시간을 필요로 하기에 생물반응기를 이용한 체세포배 대량증식은 저비용에 순화 개체를 확보하고, 배양체 자체를 직접 사용하여 산업화 할 수 있는 기본 자료를 제공할 것으로 사료된다.
두릅나무 엽병 절편을 2, 4-D가 함유된 MS 고체 배지에서 배양하면 비배발생캘러스와 함께 배발생캘러스가 엽병 절 단면으로부터 유도되는데 노란색의 부서지기 쉬운 배발생 캘러스만 선별하여 고체 배지에서 계대 배양하여 증식시켰다. 이 배발생캘러스를 MS 액체배지에서 배양하면 각각의 세포로 분리되는 배발생세포와 여러 개의 배발생세포가 서로 엉겨 분리되지 않은 배발생세포괴로 분리되며 이를 유지 및 증식시키기 위해 0, 0.5, 1.0, 2.0 m^L의 2, 4-D를 처 리하여 비교하였다. 250 mL 플라스크에 50 ml의 배지를 넣고, 생중량 2.
현탁배양을 통해 유도한 구상형의 체세포배는 5 L bio- reactor에 식물 생장조절물질이 첨가되지 않은 1/3 MS, 1/2 MS, 1 MS, 2 MS 액체배지 4 L를 넣고, 체세포배 10 g을접종하여 2주간 배양 후 체세포배 발달 양상을 비교하였고, 주기적으로 시료를 채취하여 생중량을 측정하고 생장률을 조사하였다. 자엽형 배까지 발달한 체세포배는 식물 생장조절물질이 첨가되지 않은 1/2 MS 배지의 bioreactor에서 2주간 배양하여 유식물체를 대량생산하였다.
대상 데이터
배발생캘러 스를 유도하기 위해 살균된 엽병을 5〜7 mm 크기로 잘라 배지에 옮겨 24±1 °C, 암소에서 배양하였다. 배지는 0.5,1.0, 2.0 mg/L 2, 4-D, 3% sucrose 그리고 0.4% gelite가 포함된 MS (Murashige and Skoog 1962) 배지를 사용하였다. 배발생캘러스 유도 배지를 포함한 모든 배지는 pH를 5.
전라북도 산림환경연구소의 온실에서 생육하는 2년생 두릅나무 (Aralia eZma)의 엽병을 채취하여 흐르는 물에 수세한 후, 70% 에탄올에 30초, 1% sodium hypochlorite에 10분간 표면 살균하고 멸균수로 4회 세척하였다. 배발생캘러 스를 유도하기 위해 살균된 엽병을 5〜7 mm 크기로 잘라 배지에 옮겨 24±1 °C, 암소에서 배양하였다.
성능/효과
그래서 1/2 MS 액체배지를 50~ 100 mL를 플라스크에 넣어 플라스크를 흔든 후 약 20초간 기다리면 구상형 배는 가라앉고 배발생세포괴는 배지면 위에 떠있으므로 서서히 따라내면 대부분 구상형 배만 남게 되었다. 구상형의 체세포배를 1/2 MS 액체배지에서 2주간 더 배양하여 bioreactor에 투입할 수 있는 충분한 양을 확보하였다.
4- D의 처리구에서 계속 배양하면 배발생세포와 배발생세 포괴의 비율이 일정하게 유지되며, 배발생능이 소실되지 않고 지속적으로 유지, 증식되었다 2(Table 2). 그러나 0, 0.5 mg/L 2, 4-D의 농도에서는 계대배양 횟수가 늘어남에 따라 배발생세포의 비율이 줄어들었고, 배양 8주째 (계대배양 4회)에 접어들어 대부분의 배발생세포가 배발생세포괴로 발달하여 지속적으로 유지 및 증식시킬 수 없었다. 2.
4-D가 포함된 MS 액체배지에서 배발생캘러스를 2주간 현탁 배양하여 대량으로 얻었다. 그물망을 통과한 배발생세포는 1.0 mg丄 2.4-D가 포함된 MS 액체배지에서 배양하면 배발생능이 소실되지 않고 지속적으 로 유지 및 증식시킬 수 있었다. 그물망을 통과하지 못한 배 발생세포괴를 식물 생장조절물질이 첨가되지 않은 1/2 MS 액체배지에 옮겨 2주간 배양하면 구상형의 체세포배로 발달하였다.
배발생 캘러스를 MS 액체배지에 0, 0.5, 1.0, 2.0 mg/L 2.4- D를 첨가하여 2주간 배양한 결과 배발생세포와 배발생 세포괴가 모든 농도에서 정상적으로 증식하였으나, 1.0 mg/L의 농도가 가장 효과적이었다 2(Table 2). Kim과 Kim (2001)은 가시오갈피 배발생세포를 250 例 스테인레스 그물망을 이용하여 배 발생 세 포와 배 발생 세 포괴 로 분리하고, 배 발생 세포괴를 생장 물질이 첨가되지 않는 MS 액체배지로 옮겨 체세포배를 유도하였다.
1999). 본 실험에서 그물망을 통과하지 못한 배발생세포괴를 식물 생장조절물질이 첨가되지 않은 1/2 MS 액체배지에 옮겨 형광등 하에서 2주간 배양하면 배발생세포괴와 구상형 배가 혼재되어 나타났다. 이들을 그물망을 이용하여 동조화하려고 했지만 크기가 비슷하여 용이하지 못했다.
체세포배는 배양 5일째까지 서서히 증식하다가 이후 급속히 생장하였고 배양 12일째가 지나면서 증식율이 감소하였다. 본 연구에서는 1/2 MS 액체 배지가 체세포배 발달에 가장 효과적이었고, 초기 접종 농도 10 g보다 약 62배 증가하여 620 g까지 증식하였다 (Figure3). Bioreactor에서 배양된 자엽 형태의 체세포배 (Figure IE)의 정상적인 발아를 확인하기 위하여 1/2 MS 고체 배지 에 평판 배양한 결과 대부분 유식물체로 발달하였고 (Figure IF) 5 L bioreactor로 계대 배양하여 2주간 배양하면 유식물 체가 많이 발달하였다 (Figure 1G).
Kim과 Kim (2001)은 가시오갈피 배발생세포를 250 例 스테인레스 그물망을 이용하여 배 발생 세 포와 배 발생 세 포괴 로 분리하고, 배 발생 세포괴를 생장 물질이 첨가되지 않는 MS 액체배지로 옮겨 체세포배를 유도하였다. 본 연구에서도 증식된 배발생캘러 스를 액체배지에서 배양한 후, 250 丿加 그물망을 이용하여 동질화하였을 때 250 例 그물망을 통과하는 배발생세포 (Figure IB)와 통과하지 못한 배발생세포괴로 분리하였는 데(Fi駛e 1C), 그물망을 통과한 배발생세포는 1.0 mg/L2.4- D의 처리구에서 계속 배양하면 배발생세포와 배발생세 포괴의 비율이 일정하게 유지되며, 배발생능이 소실되지 않고 지속적으로 유지, 증식되었다 2(Table 2). 그러나 0, 0.
구상형 (globular-shaped)의 처세포배는 5 L의 bioreactor를 이용하여 2주간 배양하면 심장형 (heart-shaped), 어뢰형(torpedo-shaped), 자엽형 (cotyledonary-shaped)의 배로 발달하였다 (Figure ID). 염류의 농도가 낮은 배지 (1/3 MS,1/2 MS)에서 정상적인 배 형태를 갖춘 체세포배의 발달 빈도가 높았으며 생중량도 높게 나타났다 (Figure 2). 반면 염류 농도가 너무 높으면 (2 MS) 체세포배가 비대 되거나 다 배를 형성하여 정상적으로 발달하지 못하고 증식량도 적어 낮은 염류 농도보다 생중량이 감소하였다 (Figure 3).
후속연구
페트리디쉬나 플라스크를 이용한 체세포 배 생산은 대량증식에 한계가 있고 많은 노동력과 시간을 필요로 하기에 생물반응기를 이용한 체세포배 대량증식은 저비용에 순화 개체를 확보하고, 배양체 자체를 직접 사용하여 산업화 할 수 있는 기본 자료를 제공할 것으로 사료된다. 또한, 체세포배와 유식물체를 이용한 효율적인 재분화 시스템이 확립된다면 묘의 대량생산이나 품질개량에 유용하게 이용될 수 있고, 외래 유전자 도입에 의한 형질전환 연구에도 효율적으로 이용할 수 있을 것이다.
본 연구에서는 두릅나무의 배발생캘러스를 고체배양과 현탁배양을 통해 배발생능을 소실시키지 않고, 지속적으로 유지 및 증식 시켜 생물반응기에 접종하여 2주, 4주 만에 반 복적으로 체세포배와 유식물체를 대량생산 할 수 있는 체계를 확립하였다. 페트리디쉬나 플라스크를 이용한 체세포 배 생산은 대량증식에 한계가 있고 많은 노동력과 시간을 필요로 하기에 생물반응기를 이용한 체세포배 대량증식은 저비용에 순화 개체를 확보하고, 배양체 자체를 직접 사용하여 산업화 할 수 있는 기본 자료를 제공할 것으로 사료된다. 또한, 체세포배와 유식물체를 이용한 효율적인 재분화 시스템이 확립된다면 묘의 대량생산이나 품질개량에 유용하게 이용될 수 있고, 외래 유전자 도입에 의한 형질전환 연구에도 효율적으로 이용할 수 있을 것이다.
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