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문제 정의
- 1999). 본 연구는 방사선을 처리한 고추 식물체를 대상으로 comet 분석을 통하여 식물세포의 핵 DNA 손상정도를 조사하여 방사선의 식물에 대한 잠재적인 돌연변이 유발능력을 알아보고자 수행하였다.
제안 방법
- 이용하였다. 1차 방사선처리는 2002년 3월 15일에 고추 (Capsicum annuum L.) 종자에 0, 4, 20 Gy를 처리하였으며, 처리한 종자는 즉시 묘상에 파종하였다. 방사선을 처리한 종자에서 발아한 식물체를 1/2,000 a 폿트에 이식하고 5월 21일에 다시 후속 방사선 0, 50, 100 Gy를 처리하였다.
- 손상정도를 조사하였다. Comet 분석에서 꼬리부분의 길이 (T)와 머리부분의 길이 (H)를 측정하여 T/H 비율을 조사하였다. 무처리세포는 T/H 비율이 1.
- 5% DMSO)를 첨가하여 잎을 잘게 썰어 핵의 나출을 유도하였 고，나출된 핵은 1,000 rpm에 10분간 원심분리하여 수거하였다. Comet 분석은 슬라이드 준비, 단세포전기영동, 핵의 염색 및 관찰 순으로 실시하였다. 먼저 슬라이드의 준비를 위해 충분히 냉각된 슬라이드에 1.
- 5)으로 5분간 2회 세척하여 중화시키고, ethidium bromide (20 pL/mL) 40 μL로 염색한 후 형광현미경 (400x, DM IL, Leica)으로 처리당 60개의 핵을 관찰하였다. Comet 이미지는 'Komet 5.0' software (Kinetic Imaging, UK)을 사용하여 핵의 머리부분 직경 (head length, H), 꼬리부분의 길이 (tail length, T) 및 머리부분 DNA의 함량비 (% head DNA)를 구하였다.
- 방사선에 노출된 고추유묘의 잎으로부터 세포핵을 분리하여 단세포전기영동방법인 comet 분석을 통하여 핵 DNA의 손상정도를 조사하였다. Comet 분석에서 꼬리부분의 길이 (T)와 머리부분의 길이 (H)를 측정하여 T/H 비율을 조사하였다.
- 방사선을 처리한 종자에서 발아한 식물체를 1/2,000 a 폿트에 이식하고 5월 21일에 다시 후속 방사선 0, 50, 100 Gy를 처리하였다. 방사선을 처리한 고추종자의 발아율을 조사하였고, 방사선 처리 전후의 식물체 초장을 일정간격으로 조사하였다. 후속 방사선을 처리한 식물체를 대상으로 핵 DNA의 손상정도를 관찰하기 위해 comet 분석을 실시하였다
- ) 종자에 0, 4, 20 Gy를 처리하였으며, 처리한 종자는 즉시 묘상에 파종하였다. 방사선을 처리한 종자에서 발아한 식물체를 1/2,000 a 폿트에 이식하고 5월 21일에 다시 후속 방사선 0, 50, 100 Gy를 처리하였다. 방사선을 처리한 고추종자의 발아율을 조사하였고, 방사선 처리 전후의 식물체 초장을 일정간격으로 조사하였다.
- 본 실험에서는 방사선(60Co)을 고추 종자와 식물체에 일정한 간격으로 처리하여 핵 DNA가 손상되는 정도를 분석하였다. 고선량의 방사선을 처리하기 전에 미리 20 Gy 이하의 저선량 방사선을 종자에 전처리하였을 경우 종자의 발아 및 생장에 대한 영향은 없었지만, 후속 고선량에 의한 핵 DNA의 손상은 경감되는 경향을 보였다.
- 2001), 방사선의 전처리가 후속 고선량 (50 및 100 Gy)에 대한 영향을 경감 혹은 증가시키는 효과도 나타나지 않았다. 이와 같이 고선량의 방사선 영향을 받은 고추 식물체를 대상으로 잎의 핵 DNA의 손상정도를 알아보기 위하여 comet 분석을 실시하였다.
- 5 M NaCl, 1% sodium sarcosinate, 100 mM NazEDTA, 10 mM Tris, pH 10 with 1% Triton X-100)에 1시간 동안 침지시킨 후 unwinding 완충액 1 mM NazEDTA, 300 mM NaOH, pH 13)에서 30분간 침지시키고, 25 V, 300 mA에서 25분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 각각의 슬라이드그라스를 0.4 M Tris완충액 (pH 7.5)으로 5분간 2회 세척하여 중화시키고, ethidium bromide (20 pL/mL) 40 μL로 염색한 후 형광현미경 (400x, DM IL, Leica)으로 처리당 60개의 핵을 관찰하였다. Comet 이미지는 'Komet 5.
- 0%의 일반융점을 가진 agarose를 골고루 퍼지도록 깐 후 40 ~50℃에서 수 분간 건조시킨 후, 수거한 세포핵 10 μL와 1% 저융점 agarose 90 μL를 혼합하여 슬라이드에 도포하고 커버글라스를 덮어 4℃에서 10분간 방치하였다. 제조된 슬라이드를 해리완충액 (2.5 M NaCl, 1% sodium sarcosinate, 100 mM NazEDTA, 10 mM Tris, pH 10 with 1% Triton X-100)에 1시간 동안 침지시킨 후 unwinding 완충액 1 mM NazEDTA, 300 mM NaOH, pH 13)에서 30분간 침지시키고, 25 V, 300 mA에서 25분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 각각의 슬라이드그라스를 0.
- 방사선을 처리한 고추종자의 발아율을 조사하였고, 방사선 처리 전후의 식물체 초장을 일정간격으로 조사하였다. 후속 방사선을 처리한 식물체를 대상으로 핵 DNA의 손상정도를 관찰하기 위해 comet 분석을 실시하였다
대상 데이터
- 방사선원은 한국원자력연구소 방사선 조사시설의 60Co 감마선을 이용하였다. 1차 방사선처리는 2002년 3월 15일에 고추 (Capsicum annuum L.
이론/모형
- 후속 방사선을 처리한 고추의 완전히 전개된 잎을 모두 채취하여 Rojas 등 (1999)의 방법에 따라 핵을 분리하였다. 채취한 잎을 90 mm petri-dish에 놓고 0℃의 Sorensen buffer(50 mM sodium phosphate pH 6.
성능/효과
- 1999). 5 mM EMS를 처리한 고추 잎의 핵 DNA의 꼬리길이가 현저히 길어 졌으며 T7H비율이 4.23으로 본 실험에서 처리한 가장 고선량 방사선인 100 Gy보다 핵 DNA의 손상이 심한 것으로 나타났다.
- 39로 방사선처리에 의해 상당량의 핵 DNA가 손상을 입은 것으로 나타났다. Comet의 head-DNA량은 무처리가 76.8%였으나 50 및 100 Gy를 처리한 세포는 각각 55.9% 및 59.5%를 보였다. 고선량의 방사선을 처리하기 전에 미리 20 Gy 이하의 저선량 방사선을 종자에 전처리하였을 경우 종자의 발아 및 생장에 대한 영향은 없었지만, 후속 고선량에 대한 핵 DNA의 손상은 경감되는 경향을 보였다.
- 5%를 보였다. 고선량의 방사선을 처리하기 전에 미리 20 Gy 이하의 저선량 방사선을 종자에 전처리하였을 경우 종자의 발아 및 생장에 대한 영향은 없었지만, 후속 고선량에 대한 핵 DNA의 손상은 경감되는 경향을 보였다.
- 고선량의 방사선을 처리하기 전에 미리 20 Gy 이하의 저선량 방사선을 종자에 전처리하였을 경우 종자의 발아 및 생장에 대한 영향은 없었지만, 후속 고선량에 의한 핵 DNA의 손상은 경감되는 경향을 보였다. 50 Gy 이상의 고선량 방사선을 처리 한 식물체는 초장의 증가나 생육의 진전이 거의 나타나지 않는 것이 본 실험의 결과에 나타난 핵 DNA의 손상과도 밀접한 연관이 있을 것으로 추정된다.
- 2배 이상 길어진 것을 볼 수 있다. 따라서 T/H비율이 무처리가 1.28, 50 Gy를 처리세포가 3.54로 약 3배 증가하여 방사선 처리에 의해 상당한 량의 핵 DNA가 손상을 입은 것을 알 수 있었다. 100 Gy를 처리한 세포와 50 Gy를 처리한 세포는 T/H비율에서 유의성이 인정되지 않았다.
- 3 cm로 방사선 처리 유무 간에 유의차가 없었다. 따라서 후속처리 없이 종자에 1회 처리할 경우 20 Gy이하의 방사선량은 고추종자의 발아와 생장에 아무런 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 그러나 3월 15일 방사선을 1차 처리한 종자를 파종한 후 발아된 유묘를 이식하고 5월 21일 식물체에 50 및 100 Gy를 2차로 처리한 경우에는 처리 29일 후인 6월 19일에 조사한 초장과 53일 후인 7월 13일에 조사한 초장의 차이가 거의 없었다.
- 2000). 무처리 세포는 상당수의 핵이 머리길이는 길고 꼬리길이는 짧은 쪽으로 분포하고 있으나, EMS나 방사선을 처리함으로서 각각의 핵이 머리길이는 짧아지고 꼬리길이는 길어지는 쪽으로 분포하고 있음을 알 수 있었다. 무처리에서도 DNA의 손상을 받은 전형적인 모양인 꼬리가 길고 머리가 짧은 핵이 상당수 관찰되었는데, 이러한 현상이 핵을 분리하는 과정에서 DNA가 손상을 입어 나타난 것인지 또는 무처리 세포에서도 실제로 핵 DNA의 손상이 일어나는 것 인지는 좀더 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 방사선을 처리하지 않은 무처리 종자의 발아율은 89.5%이었으며, 4 혹은 20 Gy의 방사선을 처리한 종자의 발아율은 각각 87.1% 및 86.7%로 무처리와 유의차를 나타내지 않았다 (Table 1). 초장을 비교할 경우에도 7월 13일에 조사결과 방사선을 처리하지 않은 식물체의 길이는 56.
- 방사선을 처리한 고추의 잎에서 핵을 분리하여 comet 분석을 실시한 결과 DNA의 손상정도에 따라 다양한 형태의 핵 모양을 관찰할 수 있었다 (Figure 1). DNA가 손상을 받지 않은 핵은 모양이 거의 구형에 가까운 형태 (Figure 1의 왼쪽 위)를 보이나 DNA가 손상된 핵은 파괴된 DNA 조각이 전기영동의 원리에 의해 양(+)전기 쪽으로 이동하여 긴 꼬리를 가진 혜성모양을 형성하게 된다.
- 100 Gy를 처리한 세포와 50 Gy를 처리한 세포는 T/H비율에서 유의성이 인정되지 않았다. 한편 방사선의 전처리 효과를 보면, 방사선 50 Gy를 처리하기 전에 0, 4 및 20 Gy를 종자에 전처리한 것의 T/H비율이 각각 3.54, 3.13 및 3.07이었고 100 Gy 처리에서는 각각 3.39, 2.91 및 2.88로 나타났는데, 50 혹은 100 Gy의 고선량 방사선을 처리하기 전에 미리 종자에 4 혹은 20 Gy를 전처리를 한 것이 전처리를 하지 않은 것 보다 T7H값이 줄어드는 경향 이었다. EMS는 핵 DNA의 손상을 일으키는 돌연변이 유기물질로 잘 알려져 있으며, comet 분석에서 DNA 손상여부를 판단하는 표준물질로 가장 많이 사용되는 물질이다 (Rojas et al.
- 핵의 머리부분에 존재하는 DNA의 량 (% head DNA)을 보면, 방사선을 처리한 세포의 핵 DNA의 량이 뚜렷이 감소하는 것을 알 수 있는데, 무처리 세포의 경우 평균 76.8%의 head-DNA를 나타낸 반면, 종자 전처리 없이 50 및 100 Gy를 처리한 세포의 핵은 각각 55.9% 및 59.9%를 보여 상당한 DNA가 손상을 입은 것을 알 수 있었다. 정상세포의 % head-DNA가 100%가 되지 못하는 것은, 스트레스가 없는 상태에서도 일부의 식물세포들은 끝임 없이 소실되고 생성되는 과정을 반복하는 것으로 추정하고 있으며, 일부는 핵을 분리하는 실험과정에서 핵들이 손상을 받을 수도 있다고 한다 (Navarrete et al.
후속연구
- 50 Gy 이상의 고선량 방사선을 처리 한 식물체는 초장의 증가나 생육의 진전이 거의 나타나지 않는 것이 본 실험의 결과에 나타난 핵 DNA의 손상과도 밀접한 연관이 있을 것으로 추정된다. 금후 이 연구는 식물의 환경스트레스에 대한 유전독성과 돌연변이 유발정도를 평가하는 유용한 수단으로 이용 될수 있을 것이다.
- 무처리 세포는 상당수의 핵이 머리길이는 길고 꼬리길이는 짧은 쪽으로 분포하고 있으나, EMS나 방사선을 처리함으로서 각각의 핵이 머리길이는 짧아지고 꼬리길이는 길어지는 쪽으로 분포하고 있음을 알 수 있었다. 무처리에서도 DNA의 손상을 받은 전형적인 모양인 꼬리가 길고 머리가 짧은 핵이 상당수 관찰되었는데, 이러한 현상이 핵을 분리하는 과정에서 DNA가 손상을 입어 나타난 것인지 또는 무처리 세포에서도 실제로 핵 DNA의 손상이 일어나는 것 인지는 좀더 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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