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문제 정의
- 이상의 결과에서 마의 MeOH 추출물은 담배배양세포의 방사선에 의한 피해를 경감 시키는 효과가 있는 것으로 인정되고, 그 중 EtOAc 분획에서 추출된 물질이 가장 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 방사선에 의한 세포의 핵 DNA 손상을 경감시키는데 어떠한 작용을 알아보기 위하여 comet 분석을 실시하였다.
- 본 연구는 마의 성분이 동식물 세포의 돌연변이 방지에 효과적이라는 연구보고에 착안하여(Kim et al., 1989; Baek et al., 1994), 마 추출물이 손상된 DNA를 회복시키는 능력을 알아보고자 실시하였으며, 마 추출물을 처리한 식물세포가 방사선 스트레스에서 세포의 활력과 생장 및 핵 DNA 손상에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 5% DMSO)를 첨가하여 핵의 나출을 유도하였고, 나출된 핵은 1,000 rpm에 10분간 원심분리하여 수거하였다. Comet 분석은 슬라이드 준비, 전기영동, 핵의 염색 및 관찰 순으로 실시하였다. 먼저 슬라이드의 준비를 위해 충분히 냉각된 슬라이드에 1.
- 전기영동 후 각각의 슬라이드그라스를 EtBr로 염색한 후 형광현미경으로 처리당 10-20개의 핵을 관찰하였다. Comet 이미지는 머리부분 직경(head length, H), 꼬리부분의 길이(tail length, T) 및 머리부분 DNA의 함량(% head DNA)을 구하였다.
- Fig. 2와 Fig. 3의 결과에서 마의 추출물을 처리한 배양 세포가 방사선 처리에 의한 세포활력과 생체중의 억제를 현저히 감소시키는 효과가 인정되어, MeOH 추출물을 다시 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH 및 water 층으로 분획한 추출물을 담배배양세포에 처리하였다(Fig. 4).
- 마의 지하부를 2-3 mm의 크기로 절편하여 30℃에서 감압 건조하고 70% methanol에 120시간 추출하였다. 농축된 추출물은 다시 n-hexane, chloroform (CHCl3), ethylacetate(EtOAc), n-butanol(n-BuOH) 및물 층으로 분획하여 완전히 건조시켜 최종 무게를 측정하였다(Fig. 1). 모든 추출물은 ethanol로 다시 녹여 농도가 10 mg/mL이 되도록 용액을 제조하였다.
- , 2001), 계대배양은 매7일 간격으로 실시하였고, 모든 처리는 배양 후 3일째된 세포를 이용하였다. 담배 배양세포에 마 추출액의 최종 농도가 10 mg/L이 되도록 3일간 전처리하여, 방사선(60Co,선원강도 150 TBq) 0, 20 및 50 Gy/4 hr를 조사하였다. 방사선과 마 추출액을 처리한 세포를 일정기간 정상상태에 배양하면서 세포의 생체중과 TTC(triphenyl tetrazolium chloride)에 의한 세포활력(Towil and Masure, 1975)을 측정하였다.
- 담배배양세포에 단순히 방사선 20 및 50 Gy를 처리한 것과 마 추출물 10 mg/L을 3일간 전처리한 후 동일한 선량의 방사선을 처리한 것의 경과 시간별 배양세포의 활력변화를 조사하였다(Fig. 2). 먼저 50 Gy의 고선량을 처리한 세포는 무처리 세포나 마 추출물을 전처리한 세포 모두 세포활력이 현저히 억제되어, 방사선 처리 12일이 경과한 후에도 세포의 활력이 회복되지 않았다.
- 담배 배양세포에 마 추출액의 최종 농도가 10 mg/L이 되도록 3일간 전처리하여, 방사선(60Co,선원강도 150 TBq) 0, 20 및 50 Gy/4 hr를 조사하였다. 방사선과 마 추출액을 처리한 세포를 일정기간 정상상태에 배양하면서 세포의 생체중과 TTC(triphenyl tetrazolium chloride)에 의한 세포활력(Towil and Masure, 1975)을 측정하였다.
- KY14를 사용하였다. 배양세포는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 기본염류에 2,4-D 0.5 + kinetin 0.1 mg/L 및 sucrose 30 g/L가 함유된 액체배지에서 분당 100회 속도로 현탁배양을 하였으며(Kwon et al., 2001), 계대배양은 매7일 간격으로 실시하였고, 모든 처리는 배양 후 3일째된 세포를 이용하였다. 담배 배양세포에 마 추출액의 최종 농도가 10 mg/L이 되도록 3일간 전처리하여, 방사선(60Co,선원강도 150 TBq) 0, 20 및 50 Gy/4 hr를 조사하였다.
- 본 실험에서는 마 추출물을 담배배양세포에 전 처리한후 방사선을 처리하여 세포의 활력, 세포의 생체중 및 핵 DNA가 손상되는 정도를 분석하였다. 20 Gy의 방사선을 처리하기 전에 마 추출물 중 MeOH 또는 EtOAc 분획 추출물을 처리한 경우 방사선에 의한 세포활력과 생체중의 억제를 현저히 감소시키는 효과가 인정되었다.
- 5M NaCl, 1%sodium sarcosinate, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH10)에 침지시킨 후 unwinding 완충액(1 mM Na2EDTA, 300 mM NaOH, pH 13)에서 30분간 침지시키고, 25 V, 300 mA에서 25분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 각각의 슬라이드그라스를 EtBr로 염색한 후 형광현미경으로 처리당 10-20개의 핵을 관찰하였다. Comet 이미지는 머리부분 직경(head length, H), 꼬리부분의 길이(tail length, T) 및 머리부분 DNA의 함량(% head DNA)을 구하였다.
- 0% 저융점 agarose 90 ㎕를 혼합하여 슬라이드에 도포하고, 커버글라스를 덮어 4℃에서 10분간 방치하였다. 제조된 슬라이드를 해리용액(2.5M NaCl, 1%sodium sarcosinate, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH10)에 침지시킨 후 unwinding 완충액(1 mM Na2EDTA, 300 mM NaOH, pH 13)에서 30분간 침지시키고, 25 V, 300 mA에서 25분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 각각의 슬라이드그라스를 EtBr로 염색한 후 형광현미경으로 처리당 10-20개의 핵을 관찰하였다.
대상 데이터
- 방사선을 처리한 식물세포는 담배 Nicotiana tabacum cv. KY14를 사용하였다. 배양세포는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 기본염류에 2,4-D 0.
- 본 실험에 사용된 마(Dioscorea batatas Dence)의 종류는 단마이며, 경상북도 농업기술원 생물자원연구소로부터 분양받아 사용하였다. 마의 지하부를 2-3 mm의 크기로 절편하여 30℃에서 감압 건조하고 70% methanol에 120시간 추출하였다.
이론/모형
- 마 추출액과 방사선을 처리한 배양세포를 채취하여 Rojas 등(1999)의 방법에 따라 핵을 분리하였다. 방사선을 처리한 직 후 배양세포에 0℃의 Sörensen buffer(50 mM sodium phosphate pH 6.
성능/효과
- 9%까지 회복된 것을 알 수 있었다. EtOAc 분획 추출물은 MeOH 추출물을 처리한 것보다 방사선에 의한 세포활성 및 생체중 억제를 더욱 경감시키는 것으로 나타났다. 이 결과로 보아 MeOH 추출물의 방사선 피해 감소효과는 MeOH 추출물에 함께 포함된 EtOAc 분획에 존재하는 물질일 것으로 판단된다.
- MeOH 추출물로부터 분획된 5개의 추출물 중 방사선처리에 의한 세포활성과 세포의 생체중억제효과를 가장 감소 시키는 것은 EtOAc층으로 나타났다(Fig. 4). 추출물을 처리하지 않고 방사선 20 Gy만을 처리한 세포의 생체중은 1.
- 먼저 50 Gy의 고선량을 처리한 세포는 무처리 세포나 마 추출물을 전처리한 세포 모두 세포활력이 현저히 억제되어, 방사선 처리 12일이 경과한 후에도 세포의 활력이 회복되지 않았다. 그러나 비교적 저선량의 방사선인 20 Gy를 처리한 세포는 무처리에 비해 마 추출물을 전처리한 세포가 세포활력의 회복 속도가 빠르게 나타났다(Fig. 2). 방사선을 처리한 후 12일째의 세포활력을 보면 방사선을 처리하지 않은 무처리 세포가 94%, 방사선 20 Gy만 단독으로 처리한 세포가 58%였고, 마 추출물을 전처리한 후 방사선 20 Gy를 처리한 세포가 73%의 활력을 보였다.
- 7%)보다 현저히 낮은 값을 보였다. 마 추출물 중 n-hexane, chloroform 및 물층을 전처리한 후 20 Gy의 방사선을 처리한 담배배양세포의 T/H비율은 각각 1.52, 1.58 및 1.65이며, head DNA는 각각 69.3%, 70.3% 및 74.3%로 전처리 없이 방사선 20 Gy만을 처리한 세포의 T/H 비율(1.68)과 head DNA(71.3%)간에는 유의차가 인정되지 않았다.
- 2). 먼저 50 Gy의 고선량을 처리한 세포는 무처리 세포나 마 추출물을 전처리한 세포 모두 세포활력이 현저히 억제되어, 방사선 처리 12일이 경과한 후에도 세포의 활력이 회복되지 않았다. 그러나 비교적 저선량의 방사선인 20 Gy를 처리한 세포는 무처리에 비해 마 추출물을 전처리한 세포가 세포활력의 회복 속도가 빠르게 나타났다(Fig.
- Comet 분석에서 핵의 머리길이(head-lenght, H)와 꼬리길이(tail-length, T)의 비율(T/H ratio)과 머리부분에 남아있는 DNA 량(% head DNA)을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 무처리 세포의 핵 DNA의 머리길이(H)와 꼬리길이(T)는 각각 31.7 ㎛ 및 33.4 ㎛로 나타나 T/H 비율은 1.05이었고, 머리부분에 남아있는 DNA량(% head DNA)는 86.7%로 나타났다. 한편 핵 DNA 손상물질로 알려진 (Rojas et al.
- 방사선 20 Gy를 처리한 경우 머리길이와 꼬리길이는 각각 29.5 ㎛ 및 49.8 ㎛로 관찰되어 T/H 비율이 1.68로 무처리 세포의 T/H 비율(1.05)보다 큰 값을 나타내어 방사선 처리에 의해 핵 DNA가 상당히 손상된 것을 알 수 있었고, head DNA도 71.3%로 나타나 무처리(86.7%)보다 현저히 낮은 값을 보였다. 마 추출물 중 n-hexane, chloroform 및 물층을 전처리한 후 20 Gy의 방사선을 처리한 담배배양세포의 T/H비율은 각각 1.
- 방사선을 처리한 담배배양세포에서 핵을 분리하여 comet 분석을 실시한 결과 DNA의 손상정도에 따라 다양한 형태의 핵 모양을 관찰할 수 있었다(Fig. 5). DNA가 손상을 받지 않은 핵은 거의 구형에 가까운 형태(Fig.
- 2). 방사선을 처리한 후 12일째의 세포활력을 보면 방사선을 처리하지 않은 무처리 세포가 94%, 방사선 20 Gy만 단독으로 처리한 세포가 58%였고, 마 추출물을 전처리한 후 방사선 20 Gy를 처리한 세포가 73%의 활력을 보였다.
- 7% 수준을 보였다. 이 결과로 보면, 마 추출물을 전처리한 세포가 전처리를 하지 않은 세포보다 20 Gy방사선에 의한 세포의 생체중 억제활성이 약 20% 경감되는 것으로 나타났다.
- EtOAc 분획 추출물은 MeOH 추출물을 처리한 것보다 방사선에 의한 세포활성 및 생체중 억제를 더욱 경감시키는 것으로 나타났다. 이 결과로 보아 MeOH 추출물의 방사선 피해 감소효과는 MeOH 추출물에 함께 포함된 EtOAc 분획에 존재하는 물질일 것으로 판단된다.
- 이상의 결과에서 마의 MeOH 추출물은 담배배양세포의 방사선에 의한 피해를 경감 시키는 효과가 있는 것으로 인정되고, 그 중 EtOAc 분획에서 추출된 물질이 가장 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 방사선에 의한 세포의 핵 DNA 손상을 경감시키는데 어떠한 작용을 알아보기 위하여 comet 분석을 실시하였다.
- 4). 추출물을 처리하지 않고 방사선 20 Gy만을 처리한 세포의 생체중은 1.34 g이고, 세포활력은 58%로 무처리 세포에 비하여 생체중 50.2%, 세포활력 61.1% 수준을 보인 반면, EtOAc 분 획의 추출물을 처리하고 방사선 20 Gy를 처리한 세포의 생체중은 2.13 g, 세포활력은 74%로 무처리 세포에 비해 각각 78.9%, 77.9%까지 회복된 것을 알 수 있었다. EtOAc 분획 추출물은 MeOH 추출물을 처리한 것보다 방사선에 의한 세포활성 및 생체중 억제를 더욱 경감시키는 것으로 나타났다.
- 5 g로 방사선을 처리한 이후에는 식물세포를 정상상태로 되돌려도 세포의 증식이 이루어 지지 않았다. 한편 20 Gy를 처리한 세포의 생체중은 플라스크 당 1.3 g으로 방사선을 처리하지 않은 세포(2.7 g)의 48.1% 수준을 보였으나, 마 추출물을 처리한 후 방서선 20 Gy를 처리한 경우는 1.8 g을 나타내어 무처리 세포와 비교하여 66.7% 수준을 보였다. 이 결과로 보면, 마 추출물을 전처리한 세포가 전처리를 하지 않은 세포보다 20 Gy방사선에 의한 세포의 생체중 억제활성이 약 20% 경감되는 것으로 나타났다.
- 한편 MeOH, EtOAc 및 n-Butanol 분획 추출물을 전처리한 경우는 T/H비율이 각각 1.37, 1.01 및 1.10이며, head DNA는 각각 81.5%, 87.6% 및 88.7%로 핵 DNA의 손상정도가 현저히 낮아진 것을 알 수 있었다. 특히 EtOAc 층과 n-Butanol층을 전처리하고 20 Gy의 방사선을 처리한 경우는 방사선을 처리하지 않은 무처리 세포의 T/H 비율(1.
- 20 Gy의 방사선을 처리하기 전에 마 추출물 중 MeOH 또는 EtOAc 분획 추출물을 처리한 경우 방사선에 의한 세포활력과 생체중의 억제를 현저히 감소시키는 효과가 인정되었다. 한편 분획추출물 중 EtOAc 또는 n-Butanol 추출물의 전처리는 방사선이 처리에 의한 세포의 핵 DNA의 손상에 대해 상당한 보호 효과가 있는 것으로 나타났다. 한편 EtOAc 분획 추출물이 방사선을 처리한 세포의 활력과 생체중의 억제를 현저하게 경감한 효과와 동일한 분획 추출물이 방사선에 의한 핵 DNA의 손상을 경감하는 효과와는 밀접한 관련성이 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 한편 이들 물질이 동식물의 타 환경스트레스에 의한 DNA 손상에 미치는 영향에 관한 연구도 필요하다. 금후 이 연구는 마 추출물이 식물의 환경스트레스에 의한 유전독성과 돌연변이 유발을 경감하는 원인물질을 탐색하여 작물보호에 이용될 수 있을 것이다.
- 지금까지 식물체 추출물을 대상으로 생물체의 핵 DNA 손상 억제효과를 연구한 결과가 없으나, 추출물의 구체적인 효과와 기작을 밝히기 위해서는 마 추출물로부터 핵 DNA의 손상을 억제하는 물질의 분리 동정이 필요할 것으로 사료된다. 한편 이들 물질이 동식물의 타 환경스트레스에 의한 DNA 손상에 미치는 영향에 관한 연구도 필요하다. 금후 이 연구는 마 추출물이 식물의 환경스트레스에 의한 유전독성과 돌연변이 유발을 경감하는 원인물질을 탐색하여 작물보호에 이용될 수 있을 것이다.
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