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문제 정의
- , 1999; Mann and Bidwell, 2000). 본 연구에서는한국산개구리 중 정자형성주기와 번식기의 난자 내호르몬 변화 양상 및 난자의 성숙현상 등이 알려져 있는 산개구리(R. dybowskii)(yjo et. al., 1997; Ko and Lee, 1997; Ko et al., 1998) 배아의 발생 과정을 이용하여 FETAX 방법에 따라 PCB(Arochlor)가 산개 구리배아발생에 미치는 영향을 조사하고자 한다.
제안 방법
- 4로 맞추어 사용하였다. 암컷의 배란을 유도하기 위한 뇌하수체 추출물(Frog Pituitary Homogenate: FPH)은 암컷 개구리 뇌하수체를 10개 정도 모은 다음 AR용액 에서 초음파 분쇄기로 부순 후(20sec), 원심분리(20min, lOOOrpm, 4tJ, VISION, VS-15000CF)하여 상층액을 1 pituitary equivalent/m2 (pit. equiv./mf) 농도로 만들었으며 , 이를 소량씩(1 m2) 분주하여 냉동보관(-20℃)하여 사용하였다. 배양액에 첨가한 polychlorinated biphenyls(Arochlor: AccuStandard Co)는 hexane에 녹인 후 hexane만을 제거 하고 dimethly sulfonyl oxaloacetate(DMSO)로 재구성하여 Stock solution으로 제조하고 이를 AR용액으로 희석하여 직접 배양액에 첨가하였다.
- 암컷의 배란 유도를 위해 뇌하수체 추출물을 암컷의 복부에 주사하고 24시간 후에 배란을 유도하였으며, 수컷의 정소를 적출하여 AR 2㎖이 포함된 배양접시에 정소를 터뜨려 정자들을 배양액 내로 방출시켜 정자 현탁액을 준비한 후 정자들의 운동성을 확인한 다음(약 70% 정도) 정자의 .현탁액을 배 란된 난자에 뿌려 주어 수정을 유도하였다.
- 배아의 발달과정에 미치는 PCB의 효과를 파악하기위해 유리 배양접시에 시험물질이 농도별로 포함된 실험군과 시험물질이 포함되지 않는 대조군의 배양액 10mC에 포배기에서 낭배기 사이까지 배양된 배아들을각 농도별로 25개씩 넣고 18±2℃의 온도에서 96시간 배양하면서 24시간마다 새로운 용액으로 교환하였으며 시험물질의 농도는 5개 이상으로 정하여 실시하고 모든 농도구간에 대해 각기 다른 개체에서 채취한 배아들을 사용하여 3회 반복 실험하였다.
- 시험물질 처리에 대한 결과처리 및 분석을 위해 각 농도별로 사망률을 조사하여 죽은 것을 제거하고 96 시간 후 생존한 개체들을 대상으로 기형 개체 수 및 양상을 조사하였다. ASTMQ993)의 방법에 따라 그 결과들을 %로 환산한 후 Probit analysis Program으로 분석하여 LC50, EC50을 구하였으며 아울러 96h LC50 값을 96h EC5q 값으로 나누어 Teratogenic Index(TI)를 구하여 TI 값이 1.
- 조사하였다. ASTMQ993)의 방법에 따라 그 결과들을 %로 환산한 후 Probit analysis Program으로 분석하여 LC50, EC50을 구하였으며 아울러 96h LC50 값을 96h EC5q 값으로 나누어 Teratogenic Index(TI)를 구하여 TI 값이 1.5 이상이 되면 유해성이 있는 물질로 판정하였다. 기형의 종류는 Bantie 등(1991)의 방법에 따라 정상발생 올챙이를 기준으로 올챙이 꼬리가 파상을 나타내는 양상, 꼬리가 휘어지는 양상 등을 관찰하여 꼬리기형으로 판정하였고, 복부의 돌출현상 등을 관찰하여 복부기형으로 판정하였다.
- 5 이상이 되면 유해성이 있는 물질로 판정하였다. 기형의 종류는 Bantie 등(1991)의 방법에 따라 정상발생 올챙이를 기준으로 올챙이 꼬리가 파상을 나타내는 양상, 꼬리가 휘어지는 양상 등을 관찰하여 꼬리기형으로 판정하였고, 복부의 돌출현상 등을 관찰하여 복부기형으로 판정하였다. 또한 몸 전체에 형성된 수포(물집)의 형성을 관찰하여 수포형 성기형(Edema)으로 판정하였으며 머리와 복부 및 꼬리 등이 명확히 구분되지 않는 경우는 profound형의 기형으로 판정하였다.
- 기형의 종류는 Bantie 등(1991)의 방법에 따라 정상발생 올챙이를 기준으로 올챙이 꼬리가 파상을 나타내는 양상, 꼬리가 휘어지는 양상 등을 관찰하여 꼬리기형으로 판정하였고, 복부의 돌출현상 등을 관찰하여 복부기형으로 판정하였다. 또한 몸 전체에 형성된 수포(물집)의 형성을 관찰하여 수포형 성기형(Edema)으로 판정하였으며 머리와 복부 및 꼬리 등이 명확히 구분되지 않는 경우는 profound형의 기형으로 판정하였다. 배아의 성장률은 도립현미경 (inverted microscope; Zeiss) 아래서 접 안눈금자(ocular meter)를 이용하여 머리에서 꼬리까지의 길이를 측정한 후 결과는 student’s t-test로 통계 적 유의 성 (p < 0.
- 3m 정도였다. 산개구리의 배아발생에 미치는 PCB의 효과를 알아보기 위해 산개구리의 포배기 배아들을 PCB가 첨가되지 않는 대조군과 PCB를 각 농도별로 처리하여 96시간 배양 후 배아들에게 나타난 치사율, 기형률, 기형의 종류 등을 조사하였다. 그 결과 PCB가 포함되지 않는 대조군에서는 죽는 개체가 거의 나타나지 않았으나 PCB O.
대상 데이터
- 본 연구에 이용된 실험동물은 2002년 11월~2003년 1월 동안 광주 및 전남 일대에서 산개구리(R.dybowskii) 암컷(약 30g 이상)과 수컷(약 20g 이상)의 성체를 각각 30개체씩 채집하여 암수를 분리한 후 4~5℃가 유지된 냉장실에서 가 동면을 유도하며 보관하여 실험에 사용하였다.
- 배양액으로는 Amphibian Ringer's 용액 (AR: NaCl, 6.6g/1; CaCl2, O.15g/l; KCl, 0.15g/l)에 Penicillin G(30mg/Z), Streptomycin sulfate(50mg/Z) 및 Sodium bicarbonate 완충용액(200mg/Z)을 사용 직전에 첨가하여 사용하였으며, 배양액의 pH는 0.1NHC1 을 사용하여 7.4로 맞추어 사용하였다. 암컷의 배란을 유도하기 위한 뇌하수체 추출물(Frog Pituitary Homogenate: FPH)은 암컷 개구리 뇌하수체를 10개 정도 모은 다음 AR용액 에서 초음파 분쇄기로 부순 후(20sec), 원심분리(20min, lOOOrpm, 4tJ, VISION, VS-15000CF)하여 상층액을 1 pituitary equivalent/m2 (pit.
- 배양액에 첨가한 polychlorinated biphenyls(Arochlor: AccuStandard Co)는 hexane에 녹인 후 hexane만을 제거 하고 dimethly sulfonyl oxaloacetate(DMSO)로 재구성하여 Stock solution으로 제조하고 이를 AR용액으로 희석하여 직접 배양액에 첨가하였다. 배양액 내의 DMSO양은 배아발달과정에 손상을 받지 않는 농도(0.02%)를 사용하였으며, PCB를 포함하지 않은 배양액을 동시에 사용하여 대조군으로 사용하였다.
- 수정란을 채취하기 위해 수정을 유도한 후 3시간 이내에 2세포의 배아들이 출현하기 시작하면(Johnson and Volpe, 1973), 2세포의 배아들 중 세포질들이 정확히 나누어져 균일한 할구들을 가진 배아들만을 선택하여 포셋으로 젤리층을 제거하고 18幻에서 포배기에서 낭배기까지 배양하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용했던 포배기의 배아는 산개구리의 뇌하수체 추출물을 주사한 후 배란을 유도하고 정자현탁액을 뿌려 인공수정을 유도하여 채취했으며 배아의 크기는 그 직경이 2.1~2.3m 정도였다. 산개구리의 배아발생에 미치는 PCB의 효과를 알아보기 위해 산개구리의 포배기 배아들을 PCB가 첨가되지 않는 대조군과 PCB를 각 농도별로 처리하여 96시간 배양 후 배아들에게 나타난 치사율, 기형률, 기형의 종류 등을 조사하였다.
- , 1999; Fischer and Dietrich, 2000). 본 실험에 사용된산개구리의 배아는 산개구리의 뇌하수체 추출물을 주사하여 효율적인 배란을 유도하였으며 대조군의 배아들은 .정상적인 발달상태를 나타냈다(Figure 2, A).
성능/효과
- 산개구리의 배아발생에 미치는 PCB의 효과를 알아보기 위해 산개구리의 포배기 배아들을 PCB가 첨가되지 않는 대조군과 PCB를 각 농도별로 처리하여 96시간 배양 후 배아들에게 나타난 치사율, 기형률, 기형의 종류 등을 조사하였다. 그 결과 PCB가 포함되지 않는 대조군에서는 죽는 개체가 거의 나타나지 않았으나 PCB O.lppb에서부터는 죽는 배아들이 3.0%의 비율로 나타나기 시작하여 lppb(20%), 5ppb(71%)로 농도가 높아지면서 그비율도 증가하였고(Figure 1), 배양 후 생존한 일부의개체들은 O.lppb 농도에서부터 기형이 관찰되었으며 (Figure 2), lOppb의 농도에서는 대부분의 배아들이치사되는 현상을 나타냈다.
- 이러한 농도별 비율을 Probit analysis Program을 활용하여 분석한 결과 산개구리의 배아 발달에 대한 PCB 영향의 LG*은 1.48, EC5oe 0.26을 나타냈으며, LC50 값을 EC50 값으로 나누어 Teratogenic Index(TI)를 구한 결과 5.7을 나타냈다(Table 1).
- PCB의 농도에 따라 각기 다른 비율을 나타냈다. 즉, PCB O.lppb에서는 수포형성기형(62%), 꼬리 기형(20.5%)의 순으로 다른 기형 종류(10% 미만)에 비해 높았고, PCB Ippb에서는 꼬리기형(32%), 복부기 형(24%), 척추기형(20%), 수포형성기형(19%), profound형(5%)을 각각 나타냈으며, PCB 5ppb에서는 profound형 (68%)이 가장 높은 비율을 나타냈다. PCB가 일정농도에서 배아들을 치사시키고 다양한 기형을 유발한다는 사실을 토대로 PCB의 농도를 세분화하여 배아의 성장에 미치는 효과를 조사하기 위해 각 농도별 개체들의 체장을 측정한 결과 대조군에서는 약 7.
- 5%)의 순으로 다른 기형 종류(10% 미만)에 비해 높았고, PCB Ippb에서는 꼬리기형(32%), 복부기 형(24%), 척추기형(20%), 수포형성기형(19%), profound형(5%)을 각각 나타냈으며, PCB 5ppb에서는 profound형 (68%)이 가장 높은 비율을 나타냈다. PCB가 일정농도에서 배아들을 치사시키고 다양한 기형을 유발한다는 사실을 토대로 PCB의 농도를 세분화하여 배아의 성장에 미치는 효과를 조사하기 위해 각 농도별 개체들의 체장을 측정한 결과 대조군에서는 약 7.5 mm를 나타냈고 O.Olppb, O.lppb, 0.05ppb의 농도에서는 약 7.3~7.4mm를 나타내어 대조군과 유사한 크기를 나타냈으나 lppb, 2ppb의 농도에서는 PCB의 영향에 의해 약 6.0mm 정도로 대조군에 비해 그 크기가 작게 나타났다(P< 0.05). PCB의 농도가 높아짐에 따라 대조군에 비해 커다란 차이를 나타내어 개체들의 성장에 심 한 저해현상을 나타냈다(Figure 3).
- 정상적인 발달상태를 나타냈다(Figure 2, A). 높은 지질친화성과 낮은 생분해성을 나타내어 난분해성물질로 알려진 PCB를 산개구리의 배아 발달과정에 노출시킨 본 실험의 결과로부터 중금속이나 농약의 종류의 효과(unpublished data)와는 다르게 매우 낮은 농도인 수ppb 농도 수준에서 배아를 치사시키거나 (Figure 1) 심한 기형을 유발하며(Figure 2) 배아의 성장을 저해하여 (Figure 3) PCB는 산개구리 배아발달과정에 치사 및 기형유발, 성장억제 등의 뚜렷한 형태적 변화를 유발하는 치명적인 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있었다(Figure 1, 2). 또한 PCB를 처리한 O.
- 높은 지질친화성과 낮은 생분해성을 나타내어 난분해성물질로 알려진 PCB를 산개구리의 배아 발달과정에 노출시킨 본 실험의 결과로부터 중금속이나 농약의 종류의 효과(unpublished data)와는 다르게 매우 낮은 농도인 수ppb 농도 수준에서 배아를 치사시키거나 (Figure 1) 심한 기형을 유발하며(Figure 2) 배아의 성장을 저해하여 (Figure 3) PCB는 산개구리 배아발달과정에 치사 및 기형유발, 성장억제 등의 뚜렷한 형태적 변화를 유발하는 치명적인 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있었다(Figure 1, 2). 또한 PCB를 처리한 O.lppb 농도에서부터는 죽는 배아들이 나타나기 시작하였고 생존한 개체들 중 일부 개체들에서 기형이 나타나기 시작하여 LC50은 148을 나타내었고 EC5oe 0.26을 나타내었으며 TI는 5.7을 나타내어 PCB는 산개구리의 배아발달에 치명적인 영향을 미칠 수 있는 강력한 최기형성 물질임을 확인할 수 있었다.
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