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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 무리우산버섯균의 배양적 특징과 기초적인 자료를 연구함으로써 앞으로 있을 인공재배 및 균사체 대량증식법 등의 연구에 있어서 발판이 되고자 한다.
제안 방법
- mutabilis)은 전남대학교 산림자원 미생물학 실험실에 보관 중이던 CNU5-3을 사용하였으며, Potato dextrose agar( 이하 PDA)배지에 접종하여 25±1℃에서 2주간 배양 후 사용 하였다. PDA배지 20㎖를 Petri dish(Ø87mm)에 분주한 평판배지에 보존균을 접종하여 10일간 배양한 다음 고체 실험은 Cork borer NO 3.(Ø7mm), 액체실험은 Cork borer NO 1.(Ø3mm), 톱밥실험은 Cork borer NO 7.(Ø15mm)을 사용하여 떼어낸 절편을 접종원으로 사용하였다.
- 졸참나무 톱밥과 미강을 4 : 1(w/w)로 혼합한 배지에 무리우산버섯균을 접종하여 40일간 배양한 톱밥과 배양하지 않은 톱밥의 pH를 측정하였다. pH측정(ORION Model 290A)은 증류수 50㎖에 시료를 각각 5g씩 첨가하여 3시간 침전시킨 후 추출된 용액의 pH를 측정하였다.
- 공시균주의 최적 pH를 선발하기 위하여 Potato dextrose broth(이하 PDB)배지에 1N-HCl과 NaOH를 사용하여 배지의 pH범위를 4.0, 5.0, 6.0 및 7.0 으로 조절하여 100㎖ 삼각플라스크에 50㎖씩 넣은 후 30분간 살균(121℃, 1.2㎏/㎤) 하였다. 여기에 공시균을 접종하고 25±1℃의 배양실에서 18일간 배양 후 균체량을 측정하였다.
- 광학현미경을 이용한 세포벽 물질 분해의 초미시적 특성을 관찰하기 위하여 PDA배지에서 완전히 배양된 무리우산버섯균에 졸참나무의 심재부위를 0.5mm×0.5mm×2㎝로 조재하여 40일간 배양하였다. 이렇게 배양된 목편의 부후형태와 분해정도를 관찰하기 위해 시료를 2% glutaraldehyde (GA) + 2% paraformaldehyde (PA) 혼합고정액 (in 0.
- 균사배양에 적합한 최적온도를 구명하기 위하여 PDA배지 20㎖를 Petri dish(Ø87mm)에 일정하게 분주한 평판 배지에 보존균을 접종하였으며 접종된 배지는 15, 20, 25, 30 및 35℃로 조절된 항온기에서 10일간 배양하면서 균총 직경을 측정하고 균사밀도를 육안으로 조사하였다.
- 2㎏/㎤)하여 실온으로 냉각시킨 후 공시균을 접종, 25±1℃의 배양실에서 18일간 배양 후 균체량을 측정하여 최적 배지를 선정하였다. 균체량 측정은 Whatman No.2(110㎜)여과지로 여과시킨 후 균체량을 건조평량 하였다.
- 여기에 공시균을 접종하고 25±1℃의 배양실에서 18일간 배양 후 균체량을 측정하였다. 균체량 측정은 Whatman No.2여과지로 여과시킨 후 균체량을 건조평량 하였다. 무리우산버섯균의 균사생육을 위한 최적 탄소원, 질소원을 선발하기 위하여 상기 실험으로부터 얻은 최적조건(온도, 배지, pH)을 이용하여 다음과 같이 조사하였다.
- 001∼1%(in 1ml ethanol)를 첨가하였으며, 멸균후 배지를 petri dish에 분주하여 시험균을 접종하여 laccase발현 유무를 Bavendam 반응으로 알아보았으며 생육도 또한 조사하였다. 그리고 이에 따른 효소의 분비정도에 따라 목재성분의 분해특성을 분석하였다. 졸참나무 변재를 3×0.
- 무리우산버섯균 (K. mutabilis) CNU5-3 을 PDA 배지에 접종한 후 졸참나무 변재 목편을 이 배지상에서 40일 동안 배양한 다음 광학현미경과 주사형전자현미경으로 관찰한 결과는 다음과 같다. 무리우산버섯균에 의한 졸참나무 목편의 경우 목섬유의 세포벽의 일부분이 침식되고 세포 내강에서 중간층으로 점차 얇아지는 박벽화 현상이 관찰되었다 (Fig.
- 무리우산버섯균의 균사생육을 위한 최적 탄소원, 질소원을 선발하기 위하여 기본배지(PDB)와 상기 실험으로부터 얻은 최적조건(온도, 배지, pH)으로 배양하였으며 탄소원은 0.1%를 질소원은 0.04%를 첨가하여 18일간 배양하여 완전 건조시킨 균체량을 조사한 결과는 다음과 같다.
- 2여과지로 여과시킨 후 균체량을 건조평량 하였다. 무리우산버섯균의 균사생육을 위한 최적 탄소원, 질소원을 선발하기 위하여 상기 실험으로부터 얻은 최적조건(온도, 배지, pH)을 이용하여 다음과 같이 조사하였다.
- 선발된 공시균의 균사배양 최적온도를 규명하기 위하여 기본배지를 PDA배지로 15, 20, 25, 30 및 35℃로 조절된 Incubator에서 10일간 배양하면서 균사생장 및 균사밀도를 측정하여 최적 온도 범위를 조사한 결과는 fig 4. 5.
- 용해된 한천 기본배지 20㎖당 tannic acid를 0.001∼1%를 처리한 후 공시균을 접종하여 무리우산버섯균의 부후 특성을 파악하였다.
- 용해된 한천기본배지 20ml 당 α-naphtol 이나 tannic acid를 0.001∼1%(in 1ml ethanol)를 첨가하였으며, 멸균후 배지를 petri dish에 분주하여 시험균을 접종하여 laccase발현 유무를 Bavendam 반응으로 알아보았으며 생육도 또한 조사하였다. 그리고 이에 따른 효소의 분비정도에 따라 목재성분의 분해특성을 분석하였다.
- 주사형전자현미경의 경우 2% GA + 2% PA 혼합고정액으로 고정시킨 톱밥시료를 ethyl alcohol 계열 탈수를 실시한 다음 -20℃에서 1시간 냉동시킨 후 100% t-butyl alcohol로 치환한 다음 동결건조 시킨다. 이 시편을 ion sputter를 사용하여 gold coating하여 주사형전자현미경 (Hitachi S-4000 SEM)을 사용하여 관찰한다. 투과형 전자현미경 관찰 (TEM)은 LRW에 포매된 시편을 조제하여 diamond knife를 사용하여 70∼90㎚ (초박절편 두께의 색깔 : gold silver) 두께의 초박절편을 제작한다.
- 투과형 전자현미경 관찰 (TEM)은 LRW에 포매된 시편을 조제하여 diamond knife를 사용하여 70∼90㎚ (초박절편 두께의 색깔 : gold silver) 두께의 초박절편을 제작한다. 이 절편을 1% KMnO4(in sodium citrate)로 10분간 염색한 시편을 투과형 전자현미경으로 관찰하였다.
- 이어 ethyl alcohol과 xylene의 1:1 혼합액과 100% xylene으로 각각 처리하고 xylene과 paraffin의 1:1 혼합액에 처리 후 paraffin 원액으로 치환시킨 다음 paraffin 블록을 만들어 microtome을 사용하여 15-20㎛ 두께의 절편을 제작한다. 절편은 1% safranine과 2% astra blue로이중염색한 다음 광학현미경 관찰을 실시한다.
- 이어 ethyl alcohol과 xylene의 1:1 혼합액과 100% xylene으로 각각 처리하고 xylene과 paraffin의 1:1 혼합액에 처리 후 paraffin 원액으로 치환시킨 다음 paraffin 블록을 만들어 microtome을 사용하여 15-20㎛ 두께의 절편을 제작한다. 절편은 1% safranine과 2% astra blue로이중염색한 다음 광학현미경 관찰을 실시한다. 염색하지 않은 절편은 편광현미경 관찰에 사용한다.
- 로 절취하여 접종하였다. 접종된 배지는 25±1℃로 조절된 배양실에서 30일간 배양하면서 균사생장을 측정하였으며 균사밀도를 육안으로 조사하였다.
- 졸참나무 톱밥과 미강을 4 : 1(w/w)로 혼합한 배지에 무리우산버섯균을 접종하여 40일간 배양한 톱밥과 배양하지 않은 톱밥의 pH를 측정하였다. pH측정(ORION Model 290A)은 증류수 50㎖에 시료를 각각 5g씩 첨가하여 3시간 침전시킨 후 추출된 용액의 pH를 측정하였다.
- 첨가된 영양원은 table 3과 같으며 탄소원의 경우 최적배지에 0.1%를 첨가하였고, 질소원은 최적배지에 0.04%를 첨가하여 18일간 배양하여 완전 건조시킨 균체량을 조사하여 최적 영양원을 선발하였다. 균체량 측정은 Whatman No.
- 추출은 온수추출법을 이용 했으며 방법은 각 시료 2g을 200㎖ 삼각플라스크에 넣고 증류수 100㎖를 가한 다음 플라스크에 환류냉각기를 부착시켜 3시간동안 비등수조에서 처리하였다. 그 후 미리 측량된 glass filter(1 G3)으로 내용물을 흡인 여과시키고 열수로 세척하여 105±3℃에서 항량이 될 때 까지 건조하여 칭량한다.
- 이 시편을 ion sputter를 사용하여 gold coating하여 주사형전자현미경 (Hitachi S-4000 SEM)을 사용하여 관찰한다. 투과형 전자현미경 관찰 (TEM)은 LRW에 포매된 시편을 조제하여 diamond knife를 사용하여 70∼90㎚ (초박절편 두께의 색깔 : gold silver) 두께의 초박절편을 제작한다. 이 절편을 1% KMnO4(in sodium citrate)로 10분간 염색한 시편을 투과형 전자현미경으로 관찰하였다.
- 과 같이 조제하였다. 합성배지는 100㎖ 삼각플라스크에 50㎖씩 넣은 후 30분간 고압살균(121℃, 1.2㎏/㎤)하여 실온으로 냉각시킨 후 공시균을 접종, 25±1℃의 배양실에서 18일간 배양 후 균체량을 측정하여 최적 배지를 선정하였다. 균체량 측정은 Whatman No.
- 와 같이 조제하였다. 합성배지는 30분간 고압살균(121℃, 1.2㎏/㎤) 후 petri dish에 20㎖씩 분주하여 사용 하였으며, 25±1℃의 배양실에서 10일간 배양 하면서 균사생장 측정 및 균사밀도를 육안으로 조사하여 최적 고체 배지를 선발하였다.
대상 데이터
- 무리우산버섯균의 인공재배시 배지 재료에 따른 배양적 특성을 조사하기 위하여 Ø2.2 20.0㎝인 test tube에 은백양(Populus alba), 졸참나무(Quercus serrata), 아카시나무(Robinia pseudo-acacia), 미송(Pseudotsuga menziesii),상수리나무(Quercus acutissima), Corn cob 등 6가지 배지를 사용하였으며, 톱밥은 10∼20mesh 채로친 후, 미강 20%(w/w)를 혼합하여 증류수로 배지의 수분을 65%로 조절하였다. 제조된 배지는 시험관에 31g씩 13cm높이로 충진하여 고압살균기에서 30분간 살균(121℃, 1.
- 본 실험에서 사용한 무리우산버섯균(K. mutabilis)은 전남대학교 산림자원 미생물학 실험실에 보관 중이던 CNU5-3을 사용하였으며, Potato dextrose agar( 이하 PDA)배지에 접종하여 25±1℃에서 2주간 배양 후 사용 하였다. PDA배지 20㎖를 Petri dish(Ø87mm)에 분주한 평판배지에 보존균을 접종하여 10일간 배양한 다음 고체 실험은 Cork borer NO 3.
성능/효과
- Bavendam test를 통한 무리우산버섯균의 균사생장도를 조사한 결과, tannic acid의 함량이 많아질수록 균사생장이 더 양호하지만, 큰 차이는 보이지 않았다(Fig. 15. Table 4.). 또한, tannic acid 1%가 함유된 배지에서 균사가 생장한 부위가 갈색으로 변하였다.
- 반면 MCM, Lilly에서는 저조한 생장을 보였다. 균사 밀도는 YM, ME, MCM이 가장 조밀하게 생장 하였으며 Lilly에서 가장 낮은 밀도를 보여 주었다. 하지만 대부분의 배지에서 생장이 양호하였으며 큰 유이차는 나타나지 않았다.
- 따라서 본 연구 결과 무리우산버섯균 (K. mutabilis) CNU5-3균에 의한 졸참나무 변재의 부후 형태는, 세포벽 내강에서 중간층으로 점진적으로 분해하는 전형적인 동시 분해형 백색부후 형태를 보여주고 있다.
- 무리우산버섯균의 20∼25℃에서 균사생육이 빠르고 균사밀도도 가장 좋았으며, 30℃이상에서는 균사생장이 급속히 감소하는 것을 볼 수 있었다. 반면 35℃이상에서는 균사생육이 정지되는 것을 알 수 있었다.
- 또한, tannic acid 1%가 함유된 배지에서 균사가 생장한 부위가 갈색으로 변하였다. 무리우산버섯균의 경우, tannic acid의 함량이 많아질수록 균사생장이 더 양호한 것으로 나타났으며, tannic acid 1%가 함유된 배지에서 균사가 생장한 부위가 갈색으로 변한 것으로 보아 무리우산 버섯균은 백색부후균인 것으로 규명되었다. 무리우산버섯 균이 배양된 졸참나무 시편을 이용하여 dry weight 감소율을 측정한 결과는 table 6.
- 본 실험에서는 균사가 성장하면서 소비하는 량을 측정하였으며 균사생장 전과 후의 추출량에 있어서 그 양이 줄어든 것으로 보아 미강과 톱밥에 함유되어 있는 물질을 이용하여 생장한 것으로 볼수 있겠다. 접종되지 않은 배지와 무리우산버섯균을 접종하여 부후가 완료된 배지의 pH를 조사한 결과 접종되지 않은 배지에서는 pH가 6.
- MCM과 Hennergerg 배지에서는 가장 저조한 생육을보였으며 다른 배지들은 생육에 큰 유이 차는 없었다. 본 실험의 결과 배지의 조성에 따라 균사생육 정도의 차이가 크다고 생각되며 이는 박(1978) 등이 보고한 바와 같이 팽이버섯의 균사배양시 배지조성에 따라 균사 생육의 차이가 있다고 한 보고와 일치하는 경향이 있다.
- 본 실험에서는 균사가 성장하면서 소비하는 량을 측정하였으며 균사생장 전과 후의 추출량에 있어서 그 양이 줄어든 것으로 보아 미강과 톱밥에 함유되어 있는 물질을 이용하여 생장한 것으로 볼수 있겠다. 접종되지 않은 배지와 무리우산버섯균을 접종하여 부후가 완료된 배지의 pH를 조사한 결과 접종되지 않은 배지에서는 pH가 6.07로 나타났고, 부후가 완료된 배지의 pH는 4.31로 조사되어 무리우산버섯균이 생장하면서 목재를 산성화시키는 것을 알 수 있었다.
- 과 같다. 졸참나무의 무리우산 버섯균에 의한 dry weight 감소율을 측정한 결과 감소량은 110㎎으로 5.9%의 감소율을 보였다.
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