Agrobacterium과 자엽절 공동배양으로 대두 형질전환체를 생산하였다. 대두 배양재료는 3개의 품종과 1개의 genotype의 자엽절 절편을 사용하였으며, bar유전자와 GUS유전자로 제작된 pPTN289와 pCAMBIA3301벡터를 LBA4401, GV3101, EHA101, C58에 각각 형질전환하여 공동 배양하였고 모든 형질전환 방법은 약간 변형된 Zhang 등(1999)의 방법에 따라 수행하였다. 형질전환빈도는 아그로박테리움의 종류에 따라 현저한 차이가 있었으며, 특히 사용한 균주중 EHA101에서 3.6%로 최대치를 보였다. Glufosinate가 첨가된 선발배지에서 106개의 식물체를 얻었으며, 이중 Thorne에서 5개체, 1049에서 5개체, 백운콩에서 1개체 등 모두 11개로부터 GUS양성반응을 확인하였다. Southern분석과 basta검정법에 의하여 T1세대 식물체로부터 GUS유전자와 bar유전자가 발현되고 있음을 확인하였다.
Agrobacterium과 자엽절 공동배양으로 대두 형질전환체를 생산하였다. 대두 배양재료는 3개의 품종과 1개의 genotype의 자엽절 절편을 사용하였으며, bar유전자와 GUS유전자로 제작된 pPTN289와 pCAMBIA3301벡터를 LBA4401, GV3101, EHA101, C58에 각각 형질전환하여 공동 배양하였고 모든 형질전환 방법은 약간 변형된 Zhang 등(1999)의 방법에 따라 수행하였다. 형질전환빈도는 아그로박테리움의 종류에 따라 현저한 차이가 있었으며, 특히 사용한 균주중 EHA101에서 3.6%로 최대치를 보였다. Glufosinate가 첨가된 선발배지에서 106개의 식물체를 얻었으며, 이중 Thorne에서 5개체, 1049에서 5개체, 백운콩에서 1개체 등 모두 11개로부터 GUS양성반응을 확인하였다. Southern분석과 basta검정법에 의하여 T1세대 식물체로부터 GUS유전자와 bar유전자가 발현되고 있음을 확인하였다.
Agrobacterium tumefaciens-mediated cotyledonary node transformation was used to produce transgenic soybean. Cotyledonary node explants of three cultivars and one genotype were co-cultivated with strains Agrobacterium (LBA4404, GV3101, EHA101, C58) containing the binary vectors (pCAMBIA3301 and pPTN2...
Agrobacterium tumefaciens-mediated cotyledonary node transformation was used to produce transgenic soybean. Cotyledonary node explants of three cultivars and one genotype were co-cultivated with strains Agrobacterium (LBA4404, GV3101, EHA101, C58) containing the binary vectors (pCAMBIA3301 and pPTN289) carrying with CaMV 35S promoter-GUS gene as reporter gene and NOS promoter-bar gene conferring resistance to glufosinate (herbicide Basta) as selectable marker. There was a significant difference in the transformation frequency depend on bacteria strain. The EHA101 strain of the bacterial strains employed gave the maximum efficiency (3.6%). One hundred-six lines transformed showed the resistance in glufosinate. Histochemical GUS assay showed that at least 11 plants transformed with the GUS gene were positive response. The soybean transformants were obtained from the Thorne (5 plants), 1049 (5 plants) and Bakun (1 plant), respectively. Southern blot analysis and leaf painting assay revealed that the GUS and bar gene segregated and expressed in their progeny.
Agrobacterium tumefaciens-mediated cotyledonary node transformation was used to produce transgenic soybean. Cotyledonary node explants of three cultivars and one genotype were co-cultivated with strains Agrobacterium (LBA4404, GV3101, EHA101, C58) containing the binary vectors (pCAMBIA3301 and pPTN289) carrying with CaMV 35S promoter-GUS gene as reporter gene and NOS promoter-bar gene conferring resistance to glufosinate (herbicide Basta) as selectable marker. There was a significant difference in the transformation frequency depend on bacteria strain. The EHA101 strain of the bacterial strains employed gave the maximum efficiency (3.6%). One hundred-six lines transformed showed the resistance in glufosinate. Histochemical GUS assay showed that at least 11 plants transformed with the GUS gene were positive response. The soybean transformants were obtained from the Thorne (5 plants), 1049 (5 plants) and Bakun (1 plant), respectively. Southern blot analysis and leaf painting assay revealed that the GUS and bar gene segregated and expressed in their progeny.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 자엽 절 아그로박테리움 공동배양법 (Zhang et al. 1999)으로 재분화능이 높은 #1049와 국내외 3개 품종을 대상으로 #m균주에 따른 형질전환과 후대 검증을 통한 안정적 형질전환시스템을 확보 하였기에 보고 하고자 한다.
제안 방법
1996)으로 2일간 표면 살균하였다. 2% sucrose와 0.8% agar가 첨가된 MS 기본배지 (Murashige and Skoog1962)에 페트리디쉬 당 10개의 종자를 치상하고 16시간 광주기하에서 5일 동안 발아시켰다. 배지는 autoclave전 1 N HC1 과 1 N KOH로 pH 5.
1987). 50 mg/L streptomycin과 50 mg/L spectinomycin이 첨가된 LB액체배지와 50 mg/L kanamycin (pPTN289)과 50 mg/L rifampicin이 첨가된 LB액체지 (pCAMBIA3301) 각 50 ml에 colony를 접종하여 28℃로 8 시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (OD650 = 0.6 - 1.0)의균을 사용하였다.
)를 솜으로 처리 하였다. 5일 후 제초제에 대한 내성을 나타낸 식물체의 잎 조직으로부터 genomic DNA를 추출하였다(Dellaporta et al. 1983). 10 #의 DNA를 Hind Ⅲ 제한효소 반응액에 37℃에서 16시간 동안 반응시켜 절단 한 후 0.
8% agarose 겔에 전기 영동 하였다. Agarose 겔 상의 DNA 밴드를 ZetaR-Probe nylon membrane (Bio-Rad, catalog #162-0196)에 옮겨 32P-dCTP (Stratagene, catalog #300385) 로 표지된 약 1.5 kb bar probe를 이용하여 Southern 분석하였다 (Southern 1975).
4, CM)에 5개씩 치상하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동 배양한 자엽절 절편을 3 - 5회 수세한 후 shoot유도배지 (B5 salt, B5vitamin, 3% sucrose, 1.67 mg/L BA, 5 mg/L glufonsinate, 50 mg/L ticarcillin, 50 mg/L cefotaxime, 50 mg/L vancomycin, 3 mM MES, pH 5.6, SI)에 옮겨 6 - 8주 동안 2주 간격으로 계대배양 하였다. 형성된 shoot를 분리하여shoot 신장배지 (MS salt, B5 vitamin, 1 mg/L zeatin, 0.
기내에서 성숙한 유식물체 (약 3 cm)를 토양에 이식하여 성숙 시킨 후 4개의 GUS양성반응을 나타내는 식물체 (ST-1, ST-2, ST-3, ST-4)로부터 후대 종자 (T1)를 얻었다. 각 형질전환체로부터 수확한 종자 (T1 세대)를 1 - 5개씩 토양에 파종하여 성숙한 식물체를 얻었고 3주정도 자란 식물체의 1차엽에 바스타 (basta)처리를 하여 제초제에 대한 저항성을 조사한 결과 ST-1 계통의 5개체 중 4개체에서, ST-2계통 5개체 모두, ST-3계통에서 1개체에서, ST-4계통 4개체 모두에서 저항성이 갖는 것으로 나타났다.
식물 재료 : 1,000개 genotypes으로부터 선발된 기관 발생 능이 높은 계통 (1049, unpublished 데이터)과 국내외 3 품종 (백운, 무안, Thome) 종자를 12 N 염산가스 노출법 (Di et al. 1996)으로 2일간 표면 살균하였다. 2% sucrose와 0.
약 30 - 40개 자엽 절 절편을 25 ml의 /grobac/erz#용액에 30분 동안 침지한 후 공동배양용 배지 (1/10 B5 salt, 20 mMMES, 100 mg/L cysteine, 1.67 mg/L BA, 0.25 mL GA3, 39 mg/L acetosyringone, 3% sucrose, pH 5.4, CM)에 5개씩 치상하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동 배양한 자엽절 절편을 3 - 5회 수세한 후 shoot유도배지 (B5 salt, B5vitamin, 3% sucrose, 1.
2002) 등 많은 연구가 이루어져 왔다. 이러 한기 연구를 바탕으로 대두에서 바이러스 저항성 (Di et al. 1996), 제초제 저항성 (Padgette et al. 1995), 해충 저항성 (Stewart et al. 1996) 및 lysine 함량증가 (Falco et al.1995) 등 많은 형질전환체를 개발하였다. 그러나 이러한 대두의 형질전환효율 증진과 신품종 육성을 위한 연구가 진행되어 왔음에도 불구하고 아직까지 Monsanto, Tom Clemente실험실 등 제한된 소수 연구 그룹에서 성공 하였을 뿐 국내에서는 아직까지 어려운 작물로 분류되어 있고, 형질전환체의 후대 검증을 통한 외 래유전자의 발현을 확인한 바 없다.
후대 종자 (T1 세대)를 토양에 파종하여 온실에서 생육 시켰다. 파종 후 식물체의 크기가 30 cm 이상 되었을 때 1차 잎 표면에 0.1% 바스타 (Aventis Inc.)를 솜으로 처리 하였다. 5일 후 제초제에 대한 내성을 나타낸 식물체의 잎 조직으로부터 genomic DNA를 추출하였다(Dellaporta et al.
대상 데이터
CaMV35S프로모터, B -glucuoinidase (GUS)유전자와 bar 유전자를 선발표지로 포함하고 있는 pCAMBIA3301 과pPTN289벡터를 fieeze-thaw방법으로 LBA4404, EHA101,GV3101 및 C58에 각각 형질전환 하여 균주로 사용하였다(Jefferson et al. 1987). 50 mg/L streptomycin과 50 mg/L spectinomycin이 첨가된 LB액체배지와 50 mg/L kanamycin (pPTN289)과 50 mg/L rifampicin이 첨가된 LB액체지 (pCAMBIA3301) 각 50 ml에 colony를 접종하여 28℃로 8 시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (OD650 = 0.
국내 원자력연구소와 일본유전자은행으로 부터 수집한1,000개 이상의 genotype에 대한 기관발생능을 0.1 mg/L NAA와 3.2 mg/L 사이토키닌 (BA, tidiazuron, zeatin, kinetin)을 각각 조합 첨가한 MS배지에서 조사 하여 45% 이상 기관 발생능을 갖는 1 계통 (#1049)을 선정 하였다 (unpublished 데이터). #1049와 3개 품종을 자엽 절 공동배양법 (Zhang et al.
24시간 후 70% 알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성반응을 보인 식물체의 빈도를 조사하였다. 대조구로서는 Agrobacterium과 공동배양하지 않은 식물체의 잎 절편을 사용하였다.
본 연구는 과학기술부 작물유전체기능연구사업단 과제(CG2121)로부터 지원받았으며, 네브라스카대학 Tom Clemente 박사로부터 대두(Throne)품종과 pPTN289벡터를 공급 받아 수행하였다.
이론/모형
6, RI)에 옮겨 유식물체를 얻었다. 모든 배지는 Zhang's 등의 방법 (1999)에 따라 조제 하였으며, 4 #1.Phytagel을 첨가하기 전 pH를 조정하여 121℃, 1.
성능/효과
5 mg/L glufbsinate가 첨가된 선발배지에서 1, 412개의 자엽 절 절편으로부터 106개의 glufosinate 저항성 유식 물체를 얻을 수 있었으며, 이 중 GUS 양성반응을 나타낸 식물체는 11개체로 낮은 형질 전환율 (0.77%)을 나타내었다 (Fig. IE, F). 그러나 각 품종에서 얻어진 GUS 양성반응 식물체를 보면 #1049에서 5개체 (1.
Agrobacterium 균주에 따른 형질전환율을 비교해 보면 PCAMBIA3301 벡터가 도입된 LBA4404에서 3.1%, GV3101 에서 1.6% 그리고 C58에서 0.0%의 GUS 양성반응을 보였 Table 1. Frequency (%) of GUS expression in soybean leaf formed from cotyledonaiy node explants mediated by Agrobacterium tumefaciens strains.
ST-3, ST-4)로부터 후대 종자 (T1)를 얻었다. 각 형질전환체로부터 수확한 종자 (T1 세대)를 1 - 5개씩 토양에 파종하여 성숙한 식물체를 얻었고 3주정도 자란 식물체의 1차엽에 바스타 (basta)처리를 하여 제초제에 대한 저항성을 조사한 결과 ST-1 계통의 5개체 중 4개체에서, ST-2계통 5개체 모두, ST-3계통에서 1개체에서, ST-4계통 4개체 모두에서 저항성이 갖는 것으로 나타났다. 그러나 대조군의 경우 basta를 처리 하였을 때 3일째부터 잎이 갈변되면서 점차 괴사되어 저항성이 없는 것으로 나타났다 (Figure 2).
IE, F). 그러나 각 품종에서 얻어진 GUS 양성반응 식물체를 보면 #1049에서 5개체 (1.8%), 백운콩에서 1 개체 (0.46%), Thome에서 5개체 (1.72%)를 각각 얻을 수 있었으며, 무안 콩에서는 얻지 못하였다. 이와 같이 계통 또는 품종에 따라 형질전환 빈도의 차이를 볼 수 있었으며, 특히 이전 1, 000 계통 스크리닝으로부터 높은 기관발생능을 보인 #1049 계통은 미국에서 대두 형질전환 품종으로 사용하는 Thor ne 품종과 유사한 형질전환 빈도를 보였다.
제초제 저항성을 갖는 형질전환체의 잎 (6개체)으로부터 추출한 genomic DNA/를 이용하여 Southern분석을 수행 한 결과 ST-1-1과 ST-1-2에서는 2 copy가, ST-3-1, ST-3-2, ST-4-1 에서는 1 copy가 식물체 genome에 삽입되어 있었고, ST-2-1 에서는 확인할 수 없었다 (Figure 3). 따라서 자엽 절 공동배양법에 의해 도입된 #유전자가 대두 genomic DNA에 삽입된 후 다음 세대에 안정적으로 유전되고 있음을 확인할 수 있었다.
72%)를 각각 얻을 수 있었으며, 무안 콩에서는 얻지 못하였다. 이와 같이 계통 또는 품종에 따라 형질전환 빈도의 차이를 볼 수 있었으며, 특히 이전 1, 000 계통 스크리닝으로부터 높은 기관발생능을 보인 #1049 계통은 미국에서 대두 형질전환 품종으로 사용하는 Thor ne 품종과 유사한 형질전환 빈도를 보였다. 이러한 결과는 형질전환 빈도가 품종의 기관발생능과 밀접한 관계에 있다는 연구 결과 (Simmonds and Donaldson 2000)와 일치되며, 이는 옥수수에서 식물체 재분화능과 형질전환에 있어서 A188 계통의 중요성이 확인 된 후 (Green 1982), 세포배양과 원형질체 배양을 통한 식물체재생 (Rhodes et al.
그러나 대조군의 경우 basta를 처리 하였을 때 3일째부터 잎이 갈변되면서 점차 괴사되어 저항성이 없는 것으로 나타났다 (Figure 2). 제초제 저항성을 갖는 형질전환체의 잎 (6개체)으로부터 추출한 genomic DNA/를 이용하여 Southern분석을 수행 한 결과 ST-1-1과 ST-1-2에서는 2 copy가, ST-3-1, ST-3-2, ST-4-1 에서는 1 copy가 식물체 genome에 삽입되어 있었고, ST-2-1 에서는 확인할 수 없었다 (Figure 3). 따라서 자엽 절 공동배양법에 의해 도입된 #유전자가 대두 genomic DNA에 삽입된 후 다음 세대에 안정적으로 유전되고 있음을 확인할 수 있었다.
후속연구
대두의 고효율 형질전환 기술 개발은 새로운 대두 신품종 개발을 더욱 촉진 시킬 수 있을 뿐 아니라 functional genomics연구를 수행하기 위한 insertion mutant line생산에서도 필수적으로 이용될 수 있을 것이다. 대두 형질 전환시스템은 미숙 배 배양으로 부터 체세포 배발생이나 (Cahoon et al.
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