[국내논문]Agrobacterium 매개에 의한 고구마 형질전환 및 식물체 재분화 Agrobacterium- mediated Genetic Transformation and Plant Regeneration of Sweetpotato (Ipomoea batatas)원문보기
국내 고구마 율미 품종의 배발생 캘러스를 Agrobacterium 매개 방법을 이용하여 형질전환 식물체를 개발하였다. 배발생 캘러스를 7일 동안 전배양 한 후 Agrobacterium과 2일 간 공동배양할 경우 일시적인 형질전환 효율이 가장 높았다. Agrobacterium과의 공동배양 후 배발생 캘러스를 1mg/L 2,4-D, 100mg/L kanamycin, 400mg/L claforan 이 첨가된 선발배지에서 4주 간격으로 계대배양하였다. 선발된 kanamycin 저항성 캘러스를 2,4-D를 제거한 선발배지로 옮겨 체세포배를 유도하였으며 이후 소식물체로 발달하였다. Southern 분석으로 1-3 copy의 GUS 유전자가 고구마 염색체내로 도입되었음을 확인하였다. 또한 조직학적 분석으로 GUS 유전자가 형질전환 고구마의 배발생 캘러스, 재분화 식물체의 잎, 엽병, 및 뿌리 조직에서 강하게 발현됨을 알 수 있었다.
국내 고구마 율미 품종의 배발생 캘러스를 Agrobacterium 매개 방법을 이용하여 형질전환 식물체를 개발하였다. 배발생 캘러스를 7일 동안 전배양 한 후 Agrobacterium과 2일 간 공동배양할 경우 일시적인 형질전환 효율이 가장 높았다. Agrobacterium과의 공동배양 후 배발생 캘러스를 1mg/L 2,4-D, 100mg/L kanamycin, 400mg/L claforan 이 첨가된 선발배지에서 4주 간격으로 계대배양하였다. 선발된 kanamycin 저항성 캘러스를 2,4-D를 제거한 선발배지로 옮겨 체세포배를 유도하였으며 이후 소식물체로 발달하였다. Southern 분석으로 1-3 copy의 GUS 유전자가 고구마 염색체내로 도입되었음을 확인하였다. 또한 조직학적 분석으로 GUS 유전자가 형질전환 고구마의 배발생 캘러스, 재분화 식물체의 잎, 엽병, 및 뿌리 조직에서 강하게 발현됨을 알 수 있었다.
Transformed sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Yulmi) plants were developed from embryogenic calli following Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. A. tumefaciens strain EHA105/pCAMBIA2301 harboring genes for intron $\beta$-glucuronidase (GUS) and kanamycin resistance....
Transformed sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Yulmi) plants were developed from embryogenic calli following Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. A. tumefaciens strain EHA105/pCAMBIA2301 harboring genes for intron $\beta$-glucuronidase (GUS) and kanamycin resistance. Transient expression of GUS gene was found to be higher when embryogenic calli were co-cultivated with Agrobacterium for 2 days. The co-cultured embryogenic calli transferred to selective MS medium containing 1mg/L 2,4-D, 100mg/L kanamycin, and 400mg/L claforan. These embryogenic calli were subcultured to the same selection medium at 4 weeks interval. Kanamycin-resistant calli transferred to hormone-free MS medium with kanamycin gave rise to somatic embryos and then converted into plantlets in the same medium. Southern blot analysis confirmed that the GUS gene was inserted into the genome of the sweetpotato plants. A histochemical assay revealed that the GUS gene was preferentially expressed in the leaf, petiole, and vascular tissue and tip of root.
Transformed sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Yulmi) plants were developed from embryogenic calli following Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. A. tumefaciens strain EHA105/pCAMBIA2301 harboring genes for intron $\beta$-glucuronidase (GUS) and kanamycin resistance. Transient expression of GUS gene was found to be higher when embryogenic calli were co-cultivated with Agrobacterium for 2 days. The co-cultured embryogenic calli transferred to selective MS medium containing 1mg/L 2,4-D, 100mg/L kanamycin, and 400mg/L claforan. These embryogenic calli were subcultured to the same selection medium at 4 weeks interval. Kanamycin-resistant calli transferred to hormone-free MS medium with kanamycin gave rise to somatic embryos and then converted into plantlets in the same medium. Southern blot analysis confirmed that the GUS gene was inserted into the genome of the sweetpotato plants. A histochemical assay revealed that the GUS gene was preferentially expressed in the leaf, petiole, and vascular tissue and tip of root.
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문제 정의
Agrobacterium과 공동배양 기간이 고구마 배발생 캘러스의 형질전환 효율에 미치는 영향을 조사였다. 계대배양 7일된 배 발생 캘러스를 대상으로 공동배양 기간을 2, 3, 5일로 각각 달리하였을 경우 GUS 발현율은 2일 동안 공동배양 하였을 때 100 mg 배발생 캘러스당 120개의 GUS spot 수를 나타내어 최적의 조건을 나타내었다 (Figure 2A).
그러나 국내품종의 경우 praticle bombardment 방법에 의해서만 형질전환 고구마 식물체가 개발되었을 뿐 Agrobacterium 매개에 의한 형질전환체 생산은 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 국내 주요 고구마 품종인 '율미 (Yulmi), 의 배발생 캘러스를 이용하여 Agmbacterium를 매개로 GUS 유전자를 도입하고 체세포 배 발생을 통하여 형질전환 식물체를 개발하고자 하였다.
제안 방법
배 발생 캘러스를 7일 동안 전배양 한 후 Agrobacterium과 2일간 공동배양할 경우 일시적인 형질전환 효율이 가장 높았다. 由"과의 공동배양 후 배발생 캘러스를 1mg/L 2, 4-D, 100 mg/L kanamycin, 400 mg^ clafbran 이 첨가된 선발배지에서 4주 간격으로 계대배양하였다. 선발된 kanamycin 저항성 캘러스를 2, 4-D를 제거한 선발 배지로 옮겨 체세포배를 유도하였으며 이후 소식물체로 발달하였다.
4 mg/L thiamine . HO, 30 g/L sucrose, 1 mg/L 2, 4-D 및 4 g/L Gelrite (MS ID)가 첨가된 배지에서 4주 간격으로 계대배양하여 유지하였다 (Kwon et al. 2002). 이러한 배발생 캘러스를 형질전환 재료로 사용하였다.
Kanamycin 저항성 캘러스 및 재분화된 식물체는 배발생 캘러스를 Agrobacterium과 공동배양한 후 MS1DCK 선발배지에서 4주 배양한 후 살아남은 배발생 캘러스 덩어리 숫자를 계산하였으며 BMCK 배지에서 4주 배양하여 재분화된 식물체를 조사하였다.
Kanamycin 저항성 캘러스로부터 체세포배발생을 거쳐 재분화된 식물체에서 도입된 유전자를 확인하기 위하여 기내에서 생육중인 식물체의 잎으로부터 genomic DNA를 추출하여 PCR 분석을 실시하였다. PCR에는 GUS 유전자 특이 프라이머를 사용하였으며 그 결과 재분화된 모든 식물체에서 1.
Kanamycin 첨가배지에서 선발된 배발생 캘러스 및 재분화된 식물체의 잎, 엽병, 뿌리 등의 조직 및 형질전환 시키지 않은 배발생 캘러스, 식물체의 각 조직을 함께 X-Gluc 기질용액에 반응시켜 GUS 단백질의 활성을 분석하였다. 선발배지에서 1개월 동안 배양한 캘러스 및 체세포 배에서 청색의 GUS 활성을 관찰할 수 있었으나 형질전환시키지않은 대조구의 캘러스에서는 청색반응이 나타나지 않았다 (Figure 3).
Kanamycin 함유배지에 일차적으로 선발된 재분화 식물체를 PCR로 확인하였다. PCR에 사용된 primer는 GUS 유전자의 특이 염기서열 부분을 사용하였다.
PCR에 사용된 primer는 GUS 유전자의 특이 염기서열 부분을 사용하였다. PCR로 GUS 유전자의 도입이 확인된 고구마 식물체를 대상으로 Southern 분석을 실시하였다. 배양기에서 생육중인 고구마 식물체의 잎으로부터의 DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Germany) 를이용하여 genomic DNA를 분리하였다.
국내 고구마 율미 품종의 배발생 캘러스를 매개 방법을 이용하여 형질전환 식물체를 개발하였다. 배 발생 캘러스를 7일 동안 전배양 한 후 Agrobacterium과 2일간 공동배양할 경우 일시적인 형질전환 효율이 가장 높았다.
이 DNA를 동위원소 [a&P] dCTP로 labelling시켜 prehybridization-g- 액 (Zeta Probe membrane 용)에 첨가하여 60 °C 에서 24시간 동안 혼성화시켰다. 반응을 마친 membrane을 세척하고 X-ray 필름에 노출시켜 밴드를 확인하였다.
배 발생 캘러스와 식물체의 잎, 엽병, 뿌리 조직을 5-bromo-4-chloro-3- indole-glucuronide (X-Ghic)가 포함된 용액에 37°C에서 16 시간 반응시킨 후 70% 알코올로 세척한 후 해부현미경으로 관찰하였다.
계대배양 7일된 배 발생 캘러스를 대상으로 공동배양 기간을 2, 3, 5일로 각각 달리하였을 경우 GUS 발현율은 2일 동안 공동배양 하였을 때 100 mg 배발생 캘러스당 120개의 GUS spot 수를 나타내어 최적의 조건을 나타내었다 (Figure 2A). 배발생 캘러스의 계대배양 기간이 GUS 단백질의 일시적인 발현은 Agrobacterium과 2일 공동배양 후 선발배지에서 3일 동안 배양한 다음 조사하였다. 그 결과 계대배양 7-14일 된 배발생 캘러스의 경우 100 mg 배발생 캘러스당 약 120-150 개의 GUS spot이 나타났다 (Figure 2B).
PCR로 GUS 유전자의 도입이 확인된 고구마 식물체를 대상으로 Southern 분석을 실시하였다. 배양기에서 생육중인 고구마 식물체의 잎으로부터의 DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Germany) 를이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 분리한 DNA (30 yg) 를 EcoRI으로 각각 절단하여 0.
본 연구자들은 현재 본 형질전환 시스템을 이용하여 스트레스에 내성을 지닌 고구마 식물체를 생산하고자 복합스트레스 관련 nucleoside diphosphate kinase 2 유전자 (Moon et al. 2003) 및 superoxide dismutase, ascorbate peroxidase 유전자들을 산화스트레스 유도성 SWPA2 프로모터 (Kim et al. 2003)에 연결한 벡터를 이용하여 형질전환을 시도하고 있으며 현재 PCR로 확인된 소식물체를 확보하였다. 따라서 고구마를 대상으로 하여 particle bombardment에 의한 형질전환 뿐만 아니라 Agrobacterium tumefaciens를 매개로 하는 형질전환 식물체 개발이 가능할 것으로 생각된다.
배양기에서 생육중인 고구마 식물체의 잎으로부터의 DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Germany) 를이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 분리한 DNA (30 yg) 를 EcoRI으로 각각 절단하여 0.8% agarose gel에 전기 영동 한 후, Zeta Probe membrane (Bio-Rad 제품)으로 전이시켰다. Probe는 GUS 유전자 특이부분에서 제작된 primer를 이용하여 PCR로 합성하여 이용하였다 (1.
현탁하여 배발생 캘러스와 30분 동안 공동배양한 후 2, 3, 5 일 동안 각각 공동배 양기 간을 달리 하여 MS1D 배지에 배양하여 형질전환 효율을 비교하였다. 이후에 100mg/L kanamycin과 400 mg/L clafbran이 함유된 선발배지 (MS1DCK)에서 4주 간격으로 계대배양하면서 kanamycin 저항성 캘러스를 선발하였다. 선발된 배발생 캘러스로부터체세포배 및 식물체를 유도하기 위하여 2, 4-D를 제거한 MS 기본배지 (100 mg/L kanamycin, 400 mg/L clafbran 함유: BMCK)에 옮겨 25°C, 약 40 gmol .
1 일 동안 배양한 Agrobacteria를 원심분리하여 모은 후 10 mL의 MS1D 액체배지에. 현탁하여 배발생 캘러스와 30분 동안 공동배양한 후 2, 3, 5 일 동안 각각 공동배 양기 간을 달리 하여 MS1D 배지에 배양하여 형질전환 효율을 비교하였다. 이후에 100mg/L kanamycin과 400 mg/L clafbran이 함유된 선발배지 (MS1DCK)에서 4주 간격으로 계대배양하면서 kanamycin 저항성 캘러스를 선발하였다.
대상 데이터
MS1D 고체배지에서 계대배양한지 1주일 된 배발생 캘러스를 형 질전환 재료로 이용하였다. 형질전환에 이용할 Agrobacterium tumefaciens EHA 105는 intron 영역을 포함하는 0-glucuronidase (GUS) reporter 유전자가 CaMV 35S promoter에 연결되어 있고 kanamycin 저항성 neo mycin phosphotransferase (nptll) 유전자를 선발표지로 가진 pCAMBIA2301 벡터를 함유하고 있다.
PCAMBIA2301 벡터가 도입된 배발생 캘러스를 2일 동안 MS1D 배지에서 배양한 후 100 mg/L kanamycin과 400 mg/L claforano] 첨가된 MS1DCK 선발배지에서 4주 간격으로 계대 배양하면서 선발하였다. 선발배지에서 계대 배양이 진행되면서 대부분의 캘러스는 점액질화 되고 비 배 발생 캘러스로 전환되었으나 일부 캘러스가 배발생능을 그대로 유지하면서 증식되었다.
2002). 이러한 배발생 캘러스를 형질전환 재료로 사용하였다.
형질전환은 약 150-200 여개의 배발생 캘러스 덩어리를 대상으로 실시하였으며 실험은 3회 반복하였다. Kanamycin 저항성 캘러스 및 재분화된 식물체는 배발생 캘러스를 Agrobacterium과 공동배양한 후 MS1DCK 선발배지에서 4주 배양한 후 살아남은 배발생 캘러스 덩어리 숫자를 계산하였으며 BMCK 배지에서 4주 배양하여 재분화된 식물체를 조사하였다.
이론/모형
PCR로 외래유전자 도입이 확인된 캘러스 및 재분화된 식물체의 각 조직을 대상으로 GUS 활성의 조직화학적 분석을 Jefferson 등 (1987)의 방법에 따라 실시하였다. 배 발생 캘러스와 식물체의 잎, 엽병, 뿌리 조직을 5-bromo-4-chloro-3- indole-glucuronide (X-Ghic)가 포함된 용액에 37°C에서 16 시간 반응시킨 후 70% 알코올로 세척한 후 해부현미경으로 관찰하였다.
성능/효과
Agrovacterum과 공동배양 시킨 고구마 배발생 캘러스의 kanamycin 저항성 캘러스의 형성율을 MS1DCK 선발 배지에서 배양 4주 후에 조사한 결과 10% 미만으로 나타났으며 이중 2일간의 공동배양 결과 8.3%로 가장 높은 효율을 보였다 (Table 1). 이러한 결과는 9.
2 kb 크기 밴드를 확인할 수 있었으나 형질전환시키지않은 식물체에서는 밴드가 합성되지 않았다 (결과 미제시). PCR 분석으로 외래 유전자의 도입이 확인된 3개의 식물체에서 GUS 유전자를 probe로 하여 genomic Southern 분석을 실시한 결과 선발된 개체에서 각각 1-3 copy 유전자가 고구마 염색체 안에 삽입되었음을 확인하였다 (Figure 4). 이러한 결과는 particle bombardment 방법에 의해서만 가능하였던 형질전환 고구마 식물체가 국내 품종으로는 처음으로 4grobacferii<"t에 의 해서 개발되 었음을 보여 주는 것 이 다.
효율에 미치는 영향을 조사였다. 계대배양 7일된 배 발생 캘러스를 대상으로 공동배양 기간을 2, 3, 5일로 각각 달리하였을 경우 GUS 발현율은 2일 동안 공동배양 하였을 때 100 mg 배발생 캘러스당 120개의 GUS spot 수를 나타내어 최적의 조건을 나타내었다 (Figure 2A). 배발생 캘러스의 계대배양 기간이 GUS 단백질의 일시적인 발현은 Agrobacterium과 2일 공동배양 후 선발배지에서 3일 동안 배양한 다음 조사하였다.
그 결과 계대배양 7-14일 된 배발생 캘러스의 경우 100 mg 배발생 캘러스당 약 120-150 개의 GUS spot이 나타났다 (Figure 2B). 따라서 고구마 배발생 캘러스의 형질전환은 계대배양 7일된 배발생 캘러스를 Agrobacterium과 2일 동안 공동배양 조건을 적용할 수 있을 것이다.
Southern 분석으로 1-3 copy의 GUS 유전자가 고구마 염색체내로 도입되었음을 확인하였다. 또한 조직학적 분석으로 GUS 유전자가 형질전환 고구마의 배발생 캘러스, 재분화 식물체의 잎, 엽병, 및 뿌리 조직에서 강하게 발현됨을 알 수 있었다.
배 발생 캘러스를 7일 동안 전배양 한 후 Agrobacterium과 2일간 공동배양할 경우 일시적인 형질전환 효율이 가장 높았다. 由"과의 공동배양 후 배발생 캘러스를 1mg/L 2, 4-D, 100 mg/L kanamycin, 400 mg^ clafbran 이 첨가된 선발배지에서 4주 간격으로 계대배양하였다.
후속연구
2003)에 연결한 벡터를 이용하여 형질전환을 시도하고 있으며 현재 PCR로 확인된 소식물체를 확보하였다. 따라서 고구마를 대상으로 하여 particle bombardment에 의한 형질전환 뿐만 아니라 Agrobacterium tumefaciens를 매개로 하는 형질전환 식물체 개발이 가능할 것으로 생각된다.
2001). 따라서 높은 효율로 형질전환 식물체를 얻기 위해서는 사용하는 식물체의 특성에 맞는 조건을 추가로 확립할 필요가 있다고 생각된다.
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